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Summary

Un test d'oeuf en ver (EIW) est une méthode utile pour quantifier comportement de ponte. Altérations de la ponte peut être une réponse comportementale de l'organisme modèle<em> Caenorhabditis elegans</em> À des substances environnementales potentiellement nocives telles que celles produites par des bactéries pathogènes.

Abstract

C. comportement de ponte elegans est affecté par des signaux environnementaux tels que l'osmolarité ¹ et vibrations ^2. En l'absence totale de nourriture C. elegans cessent également de ponte et de conserver les œufs fécondés dans l'utérus ^3. Cependant, l'effet des différentes sources de nourriture, en particulier les bactéries pathogènes et notamment Enterococcus faecalis, sur le comportement de ponte n'est pas bien caractérisée. L'œuf en ver essai (EIW) est un outil utile pour quantifier les effets de différents types de bactéries, dans ce cas E. faecalis, sur le comportement de ponte.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Le test consiste à EIW blanchiment mis en scène, gravide adulte C. elegans pour enlever la cuticule et séparent les œufs conservés provenant de l'animal. Avant de blanchiment, les vers sont exposés à des bactéries (ou tout autre type de signal environnemental) Pendant une période de temps déterminée. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs conservés à l'intérieur de l'utérus des vers. Dans cet essai, une augmentation quantifiable de la rétention d'œuf après E. exposition faecalis peut être facilement mesuré. Le test EIW est un test comportemental qui peut être utilisé pour le dépistage de bactéries potentiellement pathogènes ou la présence de toxines dans l'environnement. En outre, le test EIW peut être un outil pour dépister les drogues qui affectent neurotransmetteur signalisation depuis comportement de ponte est modulée par des neurotransmetteurs comme la sérotonine et l'acétylcholine ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, un microscopique, ascaris vivant en liberté, est un organisme modèle traditionnellement utilisé pour étudier les processus de signalisation du développement et de la cellule en raison de son anatomie transparent, développement bien caractérisé, entièrement séquencé génome, la génération en temps court, et l'homologie génétique à l'homme . Plus récemment, C. elegans est devenu un organisme modèle dans le domaine de la toxicologie environnementale et l'immunité innée ^{10, 11.}

Ces auto-fertilisation vers hermaphrodites deviennent sexuellement matures dans les deux à trois jours après l'éclosion de l'oeuf. Au cours de son cycle de vie, C. elegans passe par quatre stades larvaires (L1-L4), avant d'atteindre l'âge adulte. Un isolé hermaphrodite peut produire, en moyenne, 300 enfants dans les trois jours de fécondité maximale. En sexuellement matures C. elegans hermaphrodite, les œufs fécondés sont retenus dans l'utérus pendant plusieurs heures avant d'être jeté. Lenombre normal des oeufs stockées dans la matrice à un moment donné (en période de pointe fécondité) est comprise entre dix et quinze ^12. Le nombre d'oeufs dans l'utérus est une fonction à la fois le taux de production d'oeufs et le taux de ponte. Les œufs fécondés sont expulsés de l'utérus par la contraction des muscles seize vulvaires disposées autour de l'ouverture de la vulve ^13. Motoneurones Hermaphrodite spécifiques (HSN départ) et les motoneurones VC synapse sur les muscles vulvaires affectant la contraction musculaire et donc la ponte comportement ^5,7,13,14. Expulsion des œufs de l'utérus est dû à l'activité coordonnée de neurones et les muscles.

cultures de laboratoire de C. elegans sont typiquement élevés à un régime de non pathogène Escherichia coli OP50. Dans le milieu naturel, C. elegans entrent en contact avec une variété de sources alimentaires, tels que les bactéries pathogènes, qui peuvent être potentiellement dangereux. Lorsqu'ils sont exposés à des substances nocives enl'environnement, C. elegans conserver les oeufs jusqu'à ce que l'environnement devient plus favorable. On peut supposer que cette rétention d'œuf est un effort pour protéger leur progéniture.

Dans cet œuf à vis sans fin (EIW) dosage, C. elegans sont exposés aux bactéries pathogènes potentiellement, Enterococcus faecalis, qui se trouve dans l'environnement. L'exposition à des formes pathogènes de E. faecalis peuvent causer une infection intestinale persistante et même la mort en C. elegans ^15. L'exposition à d'autres formes de bactéries pathogènes ont été montré pour affecter la rétention d'œuf ^16,17, cependant l'effet n'a pas été quantifiée. En outre, les souches de l'effet de légèrement pathogène de E. faecalis, les souches qui ne sont pas immédiatement mortelle, sur le comportement de ponte n'a pas été étudiée.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Même si C. eleganssont transparentes, les œufs s'accumulent dans l'utérus peut être difficile à quantifier dans un animal intact. Le test consiste à EIW blanchiment gravide adulte C. elegans qui ont été exposées à la bactérie pendant une période de temps déterminée. La solution d'eau de Javel dissout la cuticule externe laissant les œufs derrière. Les oeufs sont réfraction aux effets de blanchiment en raison de la présence d'une coquille de protection. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs libérés de l'utérus des vers sur le blanchiment.

L'essai décrit une méthode simple, peu coûteux et rapide à quantifier le nombre d'ovules dans l'utérus à un moment donné, et donc de quantifier les effets de E. faecalis sur la rétention d'œufs. Ce test peut être utilisé pour quantifier l'effet d'autres types de bactéries, de toxines environnementales ou des médicaments sur la rétention d'œufs. Ce test a également le potentiel d'être utilisé comme un écran pour pouvoir pathogène bactérien.

Protocol

1) Préparation de nématodes croissance médias (NGM)

1. Pour faire 50 assiettes, ajouter 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, et 1,25 g de peptone à 1 Lflask.
2. Ajouter 487,5 ml de dH ₂ O dans le ballon. Agiter doucement pour mélanger et couvrir l'ouverture de la fiole avec un morceau de papier d'aluminium.
3. Stériliser la solution à l'autoclave à des conditions standards (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Laisser la solution refroidir à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. Pour la solution, ajouter ce qui suit dans l'ordre: 500 cholestérol ul de 5 mg / ml de solution mère (dissous dans l'éthanol), 500 pi 1 M CaCl _2, 500 pi 1 M MgSO _4, et 12,5 ml ₄ tampon KPO (54,15 g KH ₂ PO ₄ et de 17,8 g de K ₂ HPO ₄ dans 500 ml de dH ₂ O) comme décrit dans ^18.
6. L'aide de pipettes stériles, ajouter 10 ml de solution d'agar à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri. Autoriser les médias à se solidifier à la température ambiante overnight.

2) Préparation du bouillon B E. Médias coli

1. Pour faire cinq cultures de 100 ml, ajouter 5,0 g de Bactotryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 5,0 g NaCl dans un bécher.
2. Ajouter de l'eau distillée stérile pour un volume final de 500 ml. Chauffer la solution sur une plaque chaude, sous agitation, jusqu'à ce que les solutés sont dissous.
3. Versez 100 ml de bouillon B en cinq bouteilles de verre (ml volume au moins 200).
4. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
5. Laissez B bouillon refroidir à température ambiante avant utilisation.

3) L'ensemencement C. elegans Plaques d'entretien

1. Après avoir laissé les plaques NGM sécher à température ambiante pendant au moins une semaine, inoculer un B 100 ml bouillon de culture avec quelques colonies de E. coli (OP50).
2. Croître E. culture coli à 37 ° C pendant une nuit.
3. Pipette une à deux gouttes (environ 10081; l) de OP50 culture sur le centre de chaque plaque NGM. Les plaques sont généralement empilées couvercle vers le haut. Lorsque pipetage (ensemencement), commencer par la pipette de la culture sur la plaque au fond de la pile. Hissez-vous chaque pile. Essayez de ne pas déplacer les plaques après le semis, car il est important que la culture soit pas trop près des bords de la plaque.
4. Laisser les plaques ensemencées sécher à température ambiante pendant au moins une semaine avant de l'utiliser.
5. Plaques ensemencées sont stockés (inversé) dans des récipients en plastique scellés à température ambiante.

4) Maintien C. elegans Souches

1. Pour maintenir bien nourris C. les stocks elegans, un ver utilisent choisir de passer trois L4s ou adultes gravides à une nouvelle tête de série NGM plaque tous les 3-4 jours.
2. plaques de magasins (inversée) de préférence à l'intérieur d'un incubateur à 15-22 ° C. Cultures dans les analyses décrites ont été conservés à 20 ° C. C. développement elegans est dépendante de la température. Comme maintenance augmentation de la température, le temps entre les stades de développement diminue.

5) Préparation de soja tryptique Agar (TSA) E. faecalis Culture Médias

1. Pour faire 50 plaques, mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un ballon et porter à ébullition en remuant, sur une plaque chauffante.
2. Ajouter 20 g de poudre de TSA agar dans le ballon et laisser la solution pour dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser la solution refroidir à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. L'aide de pipettes stériles, ajouter 10 ml de solution d'agar à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri. Autoriser les médias à se solidifier à température ambiante jusqu'au lendemain.

6) Préparation de soja tryptique Broth (TSB) E. faecalis Culture Médias

1. Pour faire 250 tubes de culture, mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un flacon et chaud sur une plaque de cuisson en remuant. </li>
2. Ajouter 15 g de poudre d'agar TSB dans le ballon et laisser la poudre à dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser refroidir la solution à température ambiante, puis pipette 2 ml, 5 dans des tubes à essai stériles ml.

7) Préparation de la perfusion (BHI) Médias coeur du cerveau, avec la streptomycine, pour E. faecalis Culture

1. Mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un ballon et porter à ébullition en remuant, sur une plaque chauffante.
2. Ajouter 26 g de milieu BHI dans le ballon et laisser la solution pour dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser refroidir la solution à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. En utilisant une technique stérile, ajouter 0,5 ml d'une solution mère de streptomycine 10 mg / ml et agiter pour mélanger.
6. Ajouter 10 ml de la solution à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri.
<li> Autoriser les médias à se solidifier à température ambiante jusqu'au lendemain. plaques de magasins (inversée) à 4 ° C jusqu'à ce que quelques heures avant l'utilisation.

8) Le maintien E. faecalis souches

1. Pour maintenir E. les stocks faecalis, utilisez une boucle stérile traînée colonies individuelles sur gélose plaques de soja tryptique distincts (TSA).
2. Placer les cultures à 37 ° C pendant la nuit. plaques de magasins (inversé) dans un sac scellé ou boîte à température ambiante pendant plusieurs semaines.

9) Préparation E. Plaques faecalis pour EIW Assay

1. Inoculer une culture 2 ml TSB avec une colonie de E. faecalis et incuber une nuit à 37 ° C.
2. Pipette 20 ul de E. culture faecalis sur le centre d'une plaque BHI-streptomycine préparé, et incuber une nuit à 37 ° C.

10) Préparation E. Plaques coli pour EIW Assay (plaques de contrôle)

1. Inoculer un ml B-bro 100e culture avec une colonie de E. coli OP50 et incuber une nuit à 37 ° C
2. Pipette 20 ul de la culture OP50 sur le centre d'une plaque non ensemencée NGM et permettent aux plaques ensemencées sécher à température ambiante jusqu'au lendemain.

11) Egg essai de Worm

1. Choisissez de 15 à 20 en scène-L4 C. elegans (Figure 1) au centre d'un tapis de bactéries sur un BHI-Strep-E. préparé plaque faecalis. Veillez à ne pas transférer beaucoup de OP50 à la plaque BHI. Choisissez le même nombre de L4s à un contrôle NGM-OP50 plaque.
2. Incuber les plaques pendant 40 heures à 20 ° C.
3. Préparer une solution d'eau de Javel à 20%. Mélangez une eau de Javel commerciale (6,0% d'hypochlorite de sodium) avec le volume approprié d'eau distillée.
4. Ajoutez 10 gouttes ul d'une solution de javel pour dix emplacements distincts sur un couvercle en plastique (d'un ver ou d'une plaque bactérienne).
5. Avec une pointe de ver, transférer un ver dans chaque goutte d'eau de Javel. Remuer doucement la pointe de l'choisir dans la gouttelette eau de Javel pour s'assurer que le ver a lavé la fin de la pioche (confirmer en regardant la goutte sous une loupe binoculaire).
6. Laisser la cuticule de dissoudre environ 10 min ou jusqu'à ce que les vers éclatent, en expulsant les oeufs (figure 2). Veillez à ne pas transférer les oeufs de la plaque.
7. En utilisant un microscope à dissection, de compter les œufs dans chaque goutte d'eau de Javel.

Representative Results

Discussion

Les étapes les plus importantes dans l'accomplissement avec succès ce test sont les suivants: 1) l'utilisation des stocks bien nourris de C. elegans, 2) la culture des types individuels de bactéries sur la plaque de dosage, 3) l'identification précise scène L4 vers l'exposition à E. faecalis, 4) en maintenant la durée d'exposition à E. faecalis uniformes dans tous les essais et 5) le temps de blanchiment ne doivent pas dépasser dix minutes pour éviter la désintégration de l'œuf.

Pour cet essai, il est important de choisir vers sains, bien nourris. Famine maternelle peut affecter la fécondité et la croissance de la progéniture ^19,20, il est donc important que les vers ont été bien nourris pendant plusieurs générations avant d'effectuer ce test. Un stock bien nourris de vers est facilement maintenu en transférant simplement quelques vers adultes d'une nouvelle plaque NGM ensemencé tous les 2-3 jours. Deux jours avant l'essai, les vers adultes doivent être placés sur une nouvelle pelouse du OP50 afin de disposer de suffisamment de L4 progéniture disponible pour le dosage.

<p class = "jove_content"> Il est également important que les plaques de dosage EIW favorisent la croissance d'un seul type de bactérie. E. faecalis souches ont été cultivées sur des plaques BHI. Streptomycine a été ajouté aux plaques pour sélectionner contre E. coli OP50, qui est transférée avec les L4 vers lorsqu'elles sont transférées à partir de plaques NGM d'entretien pour les plaques de dosage. OP50 pousse aussi sur des plaques BHI. S'il n'est pas sélectionné contre, C. elegans se nourrir sur deux types de bactéries (E. coli et E. faecalis), tandis que sur les plaques BHI. Les souches de E. faecalis utilisées dans ce test sont résistantes à la streptomycine. Si différents types de bactéries ont été utilisés pour cet essai, un autre antibiotique, et peut-être différents milieux de culture, devrait être utilisé pour sélectionner des bactéries de choix et contre E. coli OP50.

Sélectionner avec précision en scène des vers pour ce test est crucial pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il est important de compter rétention d'œufs au cours de t il le temps de la production d'oeufs / pose dans le C. auto-fertilisation elegans. La production d'œufs ne se produit que pendant les cinq premiers jours de C. elegans l'âge adulte (avec un pic autour de 40 heures post-L4) et rapidement décliner ensuite ^4,21. Les vers adultes vivent en moyenne deux à trois semaines, tant de vers adultes vivent pendant au moins une semaine sans produire des oeufs fécondés. Par conséquent, il est important de s'assurer que le test EIW n'est pas effectuée sur les vers adultes unstaged d'âge inconnu.

La deuxième raison, il est important d'utiliser des animaux mis en scène dans le dosage est EIW sorte que le temps de développement au cours de laquelle les vers ont été exposés à la bactérie, la toxine ou de drogue est étroitement contrôlée. Les cultures de C. elegans sont généralement synchronisées à l'œuf, L1 ou L4 étapes. Le stade L4 a été utilisé pour ce test en raison de la crainte que l'exposition plus longue à E. faecalis se traduirait par une létalité avant vers devenus adultes gravides.

tente "> La durée de vers de temps sont laissés dans la solution d'eau de Javel est également important de surveiller. Worms devrait normalement se dissoudre en moins de dix minutes, bien que ce temps ne varie de ver à ver. œufs fécondés sont finalement dissous par eau de Javel, mais le processus est plus lente que pour les cuticules à cause de la présence d'une coquille de protection. La coquille commence à être dissous par l'eau de Javel s'il est laissé dans la solution pendant plus de 10 à 15 min.

rétention des oeufs reflète l'équilibre entre la production d'œufs et la ponte des oeufs. Le test EIW ne suffit pas à distinguer si le nombre d'œufs conservés dans l'utérus est dû à des modifications de la production d'œufs ou de ponte. Ceci est particulièrement préoccupant si les vers traités avec une souche bactérienne ou une toxine conservent moins d'oeufs que ceux du groupe de contrôle. Dans ce cas particulier, un test de taille couvée de suivi devrait être fait. dosages de taille des couvées de quantifier le nombre d'œufs pondus sur la reproduction durée de vie ⁴ du ver </sup>. Si la taille des couvées de vers dans les groupes expérimentaux et de contrôle sont les mêmes, alors les différences de rétention d'œuf peuvent être attribuées à des différences de comportement de ponte. Parce qu'il est peu probable que mildly souches bactériennes pathogènes comme E. faecalis agiraient pour augmenter la production d'œufs, il est raisonnable de supposer que l'augmentation de la rétention d'œuf après l'exposition à E. faecalis (comme le montre la figure 3) est le résultat d'une diminution de comportement de ponte.

Le test EIW n'a également pas permis de déterminer le mécanisme par lequel les bactéries peuvent modifier la rétention d'œuf. Il est possible que C. elegans peut conserver les œufs parce que les bactéries pathogènes affecte l'alimentation en colonisant dans et en bloquant l'ouverture de la bouche, parce que c'est une source de nourriture pauvre. Il est également possible que les bactéries peuvent coloniser et bloquer l'ouverture vulvaire ou affecter la fonction des cellules dans le système de ponte. Une analyse plus approfondie est nécessaire pour déterminer le mécanisme par WHIrétention d'œuf ch est modifiée.

Ce test EIW peut être facilement modifié pour déterminer les effets de plusieurs types de composés sur la rétention d'œuf. En outre, ce test est assez simple qu'il pourrait être intégré dans un écran pour identifier les gènes, soit l'hôte (C. elegans) ou pathogènes (E. faecalis), nécessaire à l'effet de l'agent pathogène. Le test EIW peut également être utilisé pour le dépistage de gènes nécessaires à la régulation de la ponte elle-même. C. comportement de ponte elegans est modulée par des neurotransmetteurs comme la sérotonine et l'acétylcholine ^5-9, et nécessite l'action coordonnée de plusieurs neurones et les groupes musculaires ^12. Dosages EIW ont été et continueront d'être utilisés pour identifier les gènes importants pour la signalisation neurotransmetteur et / ou l'activité musculaire. Dosages EIW fournissent une analyse quantitative, plutôt que qualitative, l'analyse d'une importante C. elegans comportement.

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000