Mesurer les effets des bactéries sur C. Elegans Comportement aide d'un test de rétention d'oeufs

Summary

Un test d'oeuf en ver (EIW) est une méthode utile pour quantifier comportement de ponte. Altérations de la ponte peut être une réponse comportementale de l'organisme modèle Caenorhabditis elegans À des substances environnementales potentiellement nocives telles que celles produites par des bactéries pathogènes.

Abstract

C. comportement de ponte elegans est affecté par des signaux environnementaux tels que l'osmolarité ¹ et vibrations ^2. En l'absence totale de nourriture C. elegans cessent également de ponte et de conserver les œufs fécondés dans l'utérus ^3. Cependant, l'effet des différentes sources de nourriture, en particulier les bactéries pathogènes et notamment Enterococcus faecalis, sur le comportement de ponte n'est pas bien caractérisée. L'œuf en ver essai (EIW) est un outil utile pour quantifier les effets de différents types de bactéries, dans ce cas E. faecalis, sur le comportement de ponte.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Le test consiste à EIW blanchiment mis en scène, gravide adulte C. elegans pour enlever la cuticule et séparent les œufs conservés provenant de l'animal. Avant de blanchiment, les vers sont exposés à des bactéries (ou tout autre type de signal environnemental) Pendant une période de temps déterminée. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs conservés à l'intérieur de l'utérus des vers. Dans cet essai, une augmentation quantifiable de la rétention d'œuf après E. exposition faecalis peut être facilement mesuré. Le test EIW est un test comportemental qui peut être utilisé pour le dépistage de bactéries potentiellement pathogènes ou la présence de toxines dans l'environnement. En outre, le test EIW peut être un outil pour dépister les drogues qui affectent neurotransmetteur signalisation depuis comportement de ponte est modulée par des neurotransmetteurs comme la sérotonine et l'acétylcholine ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, un microscopique, ascaris vivant en liberté, est un organisme modèle traditionnellement utilisé pour étudier les processus de signalisation du développement et de la cellule en raison de son anatomie transparent, développement bien caractérisé, entièrement séquencé génome, la génération en temps court, et l'homologie génétique à l'homme . Plus récemment, C. elegans est devenu un organisme modèle dans le domaine de la toxicologie environnementale et l'immunité innée ^{10, 11.}

Ces auto-fertilisation vers hermaphrodites deviennent sexuellement matures dans les deux à trois jours après l'éclosion de l'oeuf. Au cours de son cycle de vie, C. elegans passe par quatre stades larvaires (L1-L4), avant d'atteindre l'âge adulte. Un isolé hermaphrodite peut produire, en moyenne, 300 enfants dans les trois jours de fécondité maximale. En sexuellement matures C. elegans hermaphrodite, les œufs fécondés sont retenus dans l'utérus pendant plusieurs heures avant d'être jeté. Lenombre normal des oeufs stockées dans la matrice à un moment donné (en période de pointe fécondité) est comprise entre dix et quinze ^12. Le nombre d'oeufs dans l'utérus est une fonction à la fois le taux de production d'oeufs et le taux de ponte. Les œufs fécondés sont expulsés de l'utérus par la contraction des muscles seize vulvaires disposées autour de l'ouverture de la vulve ^13. Motoneurones Hermaphrodite spécifiques (HSN départ) et les motoneurones VC synapse sur les muscles vulvaires affectant la contraction musculaire et donc la ponte comportement ^5,7,13,14. Expulsion des œufs de l'utérus est dû à l'activité coordonnée de neurones et les muscles.

cultures de laboratoire de C. elegans sont typiquement élevés à un régime de non pathogène Escherichia coli OP50. Dans le milieu naturel, C. elegans entrent en contact avec une variété de sources alimentaires, tels que les bactéries pathogènes, qui peuvent être potentiellement dangereux. Lorsqu'ils sont exposés à des substances nocives enl'environnement, C. elegans conserver les oeufs jusqu'à ce que l'environnement devient plus favorable. On peut supposer que cette rétention d'œuf est un effort pour protéger leur progéniture.

Dans cet œuf à vis sans fin (EIW) dosage, C. elegans sont exposés aux bactéries pathogènes potentiellement, Enterococcus faecalis, qui se trouve dans l'environnement. L'exposition à des formes pathogènes de E. faecalis peuvent causer une infection intestinale persistante et même la mort en C. elegans ^15. L'exposition à d'autres formes de bactéries pathogènes ont été montré pour affecter la rétention d'œuf ^16,17, cependant l'effet n'a pas été quantifiée. En outre, les souches de l'effet de légèrement pathogène de E. faecalis, les souches qui ne sont pas immédiatement mortelle, sur le comportement de ponte n'a pas été étudiée.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Même si C. eleganssont transparentes, les œufs s'accumulent dans l'utérus peut être difficile à quantifier dans un animal intact. Le test consiste à EIW blanchiment gravide adulte C. elegans qui ont été exposées à la bactérie pendant une période de temps déterminée. La solution d'eau de Javel dissout la cuticule externe laissant les œufs derrière. Les oeufs sont réfraction aux effets de blanchiment en raison de la présence d'une coquille de protection. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs libérés de l'utérus des vers sur le blanchiment.

L'essai décrit une méthode simple, peu coûteux et rapide à quantifier le nombre d'ovules dans l'utérus à un moment donné, et donc de quantifier les effets de E. faecalis sur la rétention d'œufs. Ce test peut être utilisé pour quantifier l'effet d'autres types de bactéries, de toxines environnementales ou des médicaments sur la rétention d'œufs. Ce test a également le potentiel d'être utilisé comme un écran pour pouvoir pathogène bactérien.

Protocol

1) Préparation de nématodes croissance médias (NGM)

1. Pour faire 50 assiettes, ajouter 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, et 1,25 g de peptone à 1 Lflask.
2. Ajouter 487,5 ml de dH ₂ O dans le ballon. Agiter doucement pour mélanger et couvrir l'ouverture de la fiole avec un morceau de papier d'aluminium.
3. Stériliser la solution à l'autoclave à des conditions standards (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Laisser la solution refroidir à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. Pour la solution, ajouter ce qui suit dans l'ordre: 500 cholestérol ul de 5 mg / ml de solution mère (dissous dans l'éthanol), 500 pi 1 M CaCl _2, 500 pi 1 M MgSO _4, et 12,5 ml ₄ tampon KPO (54,15 g KH ₂ PO ₄ et de 17,8 g de K ₂ HPO ₄ dans 500 ml de dH ₂ O) comme décrit dans ^18.
6. L'aide de pipettes stériles, ajouter 10 ml de solution d'agar à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri. Autoriser les médias à se solidifier à la température ambiante overnight.

2) Préparation du bouillon B E. Médias coli

1. Pour faire cinq cultures de 100 ml, ajouter 5,0 g de Bactotryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 5,0 g NaCl dans un bécher.
2. Ajouter de l'eau distillée stérile pour un volume final de 500 ml. Chauffer la solution sur une plaque chaude, sous agitation, jusqu'à ce que les solutés sont dissous.
3. Versez 100 ml de bouillon B en cinq bouteilles de verre (ml volume au moins 200).
4. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
5. Laissez B bouillon refroidir à température ambiante avant utilisation.

3) L'ensemencement C. elegans Plaques d'entretien

1. Après avoir laissé les plaques NGM sécher à température ambiante pendant au moins une semaine, inoculer un B 100 ml bouillon de culture avec quelques colonies de E. coli (OP50).
2. Croître E. culture coli à 37 ° C pendant une nuit.
3. Pipette une à deux gouttes (environ 10081; l) de OP50 culture sur le centre de chaque plaque NGM. Les plaques sont généralement empilées couvercle vers le haut. Lorsque pipetage (ensemencement), commencer par la pipette de la culture sur la plaque au fond de la pile. Hissez-vous chaque pile. Essayez de ne pas déplacer les plaques après le semis, car il est important que la culture soit pas trop près des bords de la plaque.
4. Laisser les plaques ensemencées sécher à température ambiante pendant au moins une semaine avant de l'utiliser.
5. Plaques ensemencées sont stockés (inversé) dans des récipients en plastique scellés à température ambiante.

4) Maintien C. elegans Souches

1. Pour maintenir bien nourris C. les stocks elegans, un ver utilisent choisir de passer trois L4s ou adultes gravides à une nouvelle tête de série NGM plaque tous les 3-4 jours.
2. plaques de magasins (inversée) de préférence à l'intérieur d'un incubateur à 15-22 ° C. Cultures dans les analyses décrites ont été conservés à 20 ° C. C. développement elegans est dépendante de la température. Comme maintenance augmentation de la température, le temps entre les stades de développement diminue.

5) Préparation de soja tryptique Agar (TSA) E. faecalis Culture Médias

1. Pour faire 50 plaques, mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un ballon et porter à ébullition en remuant, sur une plaque chauffante.
2. Ajouter 20 g de poudre de TSA agar dans le ballon et laisser la solution pour dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser la solution refroidir à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. L'aide de pipettes stériles, ajouter 10 ml de solution d'agar à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri. Autoriser les médias à se solidifier à température ambiante jusqu'au lendemain.

6) Préparation de soja tryptique Broth (TSB) E. faecalis Culture Médias

1. Pour faire 250 tubes de culture, mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un flacon et chaud sur une plaque de cuisson en remuant.
2. Ajouter 15 g de poudre d'agar TSB dans le ballon et laisser la poudre à dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser refroidir la solution à température ambiante, puis pipette 2 ml, 5 dans des tubes à essai stériles ml.

7) Préparation de la perfusion (BHI) Médias coeur du cerveau, avec la streptomycine, pour E. faecalis Culture

1. Mesurer 500 ml d'eau distillée stérile dans un ballon et porter à ébullition en remuant, sur une plaque chauffante.
2. Ajouter 26 g de milieu BHI dans le ballon et laisser la solution pour dissoudre.
3. Stériliser les solutions par autoclavage à des conditions standard (121 psi, 120 ° C, 20 minutes).
4. Laisser refroidir la solution à 45 ° C dans un bain d'eau.
5. En utilisant une technique stérile, ajouter 0,5 ml d'une solution mère de streptomycine 10 mg / ml et agiter pour mélanger.
6. Ajouter 10 ml de la solution à chaque 60 mm de polystyrène boîte de Pétri.
7. Autoriser les médias à se solidifier à température ambiante jusqu'au lendemain. plaques de magasins (inversée) à 4 ° C jusqu'à ce que quelques heures avant l'utilisation.

8) Le maintien E. faecalis souches

1. Pour maintenir E. les stocks faecalis, utilisez une boucle stérile traînée colonies individuelles sur gélose plaques de soja tryptique distincts (TSA).
2. Placer les cultures à 37 ° C pendant la nuit. plaques de magasins (inversé) dans un sac scellé ou boîte à température ambiante pendant plusieurs semaines.

9) Préparation E. Plaques faecalis pour EIW Assay

1. Inoculer une culture 2 ml TSB avec une colonie de E. faecalis et incuber une nuit à 37 ° C.
2. Pipette 20 ul de E. culture faecalis sur le centre d'une plaque BHI-streptomycine préparé, et incuber une nuit à 37 ° C.

10) Préparation E. Plaques coli pour EIW Assay (plaques de contrôle)

1. Inoculer un ml B-bro 100e culture avec une colonie de E. coli OP50 et incuber une nuit à 37 ° C
2. Pipette 20 ul de la culture OP50 sur le centre d'une plaque non ensemencée NGM et permettent aux plaques ensemencées sécher à température ambiante jusqu'au lendemain.

11) Egg essai de Worm

1. Choisissez de 15 à 20 en scène-L4 C. elegans (Figure 1) au centre d'un tapis de bactéries sur un BHI-Strep-E. préparé plaque faecalis. Veillez à ne pas transférer beaucoup de OP50 à la plaque BHI. Choisissez le même nombre de L4s à un contrôle NGM-OP50 plaque.
2. Incuber les plaques pendant 40 heures à 20 ° C.
3. Préparer une solution d'eau de Javel à 20%. Mélangez une eau de Javel commerciale (6,0% d'hypochlorite de sodium) avec le volume approprié d'eau distillée.
4. Ajoutez 10 gouttes ul d'une solution de javel pour dix emplacements distincts sur un couvercle en plastique (d'un ver ou d'une plaque bactérienne).
5. Avec une pointe de ver, transférer un ver dans chaque goutte d'eau de Javel. Remuer doucement la pointe de l'choisir dans la gouttelette eau de Javel pour s'assurer que le ver a lavé la fin de la pioche (confirmer en regardant la goutte sous une loupe binoculaire).
6. Laisser la cuticule de dissoudre environ 10 min ou jusqu'à ce que les vers éclatent, en expulsant les oeufs (figure 2). Veillez à ne pas transférer les oeufs de la plaque.
7. En utilisant un microscope à dissection, de compter les œufs dans chaque goutte d'eau de Javel.

Results

Ce test permet de quantifier le nombre d'œufs retenus dans C. elegans après exposition à E. faecalis. L4 scène vers (caractérisé par l'espace ouvert et transparent au-dessus de la vulve, figure 1) ont été exposés à E. faecalis l'âge adulte. Après 40 heures d'exposition à E. faecalis, le blanchiment a été réalisée. Comme la cuticule désintégré dans la goutte d'eau de javel, les œufs sont devenus plus apparents (figure 2). Le nombre d'œufs conservés a é...

Discussion

Les étapes les plus importantes dans l'accomplissement avec succès ce test sont les suivants: 1) l'utilisation des stocks bien nourris de C. elegans, 2) la culture des types individuels de bactéries sur la plaque de dosage, 3) l'identification précise scène L4 vers l'exposition à E. faecalis, 4) en maintenant la durée d'exposition à E. faecalis uniformes dans tous les essais et 5) le temps de blanchiment ne doivent pas dépasser dix minutes pour éviter la désintégration de l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultra-pur	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion milieu déshydraté	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, souche N2	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholestérol	Alfa Aesar	A11470
Plaques de culture pour C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Plaques de culture pour E. faecalis	Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis			souches fournies par J. Middleton. Tous les isolats ont été confirmés comme étant des entérocoques
en observant la croissance sur gélose à entérocoques (BBL) et dans un bouillon de NaCl à 6 %;
toutes les souches ont augmenté à 44,5 º ; C et étaient négatifs à la catalase et à l’esculine hydrolysée. Un simplifié  ; (arabinose, mannitol, méthyl-&alpha ;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose et sorbitol) autorisés » et sorbose négatif et sorbitol, mannitol et ribose positifs). Toutes les souches présomptives d’Efs  ; ont été confirmés à l’aide du système API 20 STREP (Biomérieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	Tout microscope avec éclairage transmis et grossissement de 50X devrait être suffisant
Sulfate de streptomycine	BioReagents	BP910-50
Gélose de soja tryptique (milieu de gélose de digestion de soja-caséine), Difco	Becton Dickinson	236950
Bouillon de soja trypticase (milieu de digestion de soja-caséine), BBL	Becton Dickinson	211768
extrait de levure	Acros	61180-1000