Optimisation et l'utilisation des Agrobacterium Médiée par la production de protéines transitoire dans Nicotiana

Les plantes sont maintenant reconnus comme une plate-forme sûre, fiable, évolutive et économique pour la production de produits biopharmaceutiques recombinants hétérologues et des protéines industrielles ^1-3 et ont des avantages importants par rapport aux systèmes d'expression de cellules microbiennes et animales ^4. Les plantes sont capables d'exprimer des protéines correctement repliées avec des modifications post-traductionnelles, notamment des anticorps multimères assemblés ^5-7. Plusieurs protéines recombinantes pharmaceutiques d'origine végétale sont en cours d'évaluation clinique ^8. Cela comprend des vaccins spécifiques au patient recombinants idiotype (scFv) pour le traitement du lymphome non hodgkinien ^9, pandémie base hémagglutinine et saisonniers candidats vaccins contre la grippe ^10,11 (Cummings et al., Soumis à des vaccins), anti-Streptococcus antigène de surface je / anticorps II pour le traitement de la carie dentaire ^12, et de l'insuline humaine pour le traitement du diabète ^13. En outre, reco humaineglucocérébrosidase mbinant pour la thérapie de remplacement enzymatique chez les patients atteints de la maladie de Gaucher a été approuvé en Israël et aux États-Unis et il est prévu dans le cadre du programme d'accès élargi à l'extérieur des États-Unis ^14,15.

Des protéines hétérologues peuvent être produites dans transformée de manière stable (ou transplastomique transgénique) ou des plantes transformées de façon transitoire. La production de protéine transitoire offre plusieurs avantages par rapport à la production dans les plantes transgéniques, y compris le court laps de temps pour obtenir l'expression et l'accumulation ^16, et peut être réalisé en introduisant des vecteurs binaires bactérienne ou végétale recombinante vecteurs viraux dans les tissus végétaux ^4. Le système d'expression transitoire la plus avancée est basée sur l'utilisation de «vecteurs de lancement» qui associent des composants de virus de plantes et des plasmides binaires, et sont livrées par agro-infiltration ^17,18. Agroinfiltration d'un vecteur de lancement sur ​​la base de virus de la mosaïque du tabac (TMV) a été appliquée avec succès au laboratoirel'échelle pour produire des antigènes de vaccins contre des pathogènes tels que le virus du papillome humain ^{19, 20} Yersinia pestis, virus influenza A ^21,22, Bacillus anthracis ^23, et le virus de la variole dans ²⁴ N. benthamiana feuilles. expression transitoire à médiation par Agrobacterium est également un procédé prometteur pour la production simultanée de multiples protéines ^2,25-27. Par exemple, les systèmes d'expression transitoire de plantes ont été utilisées pour produire des anticorps spécifiques de la tumeur recombinants ^28,29, un anticorps recombinant dirigé contre le récepteur glycosylé epidermal growth factor ^30, et un anticorps monoclonal spécifique de l'antigène protecteur ^31,32 anthrax. Co-infiltration de plants de Nicotiana benthamiana avec un gène cible et un suppresseur de résultats d'inactivation de gène dans une expression accrue de la protéine cible ^33,34.

Agroinfiltration est une méthode courante pour introdu uniformémentCing bactéries hébergeant un gène d'intérêt dans des tissus végétaux ^35-37. Vide infiltration d'Agrobacterium pour l'expression transitoire de gènes dans plante intacte feuilles est une méthode rapide, évolutive et utile pour la production de protéines étrangères sans la nécessité de produire des plantes transgéniques ^38-41. Pendant agroinfiltration à vide, les plantes sont retournées à l'envers et les parties aériennes immergés dans Agrobacterium suspension. Ensuite, on applique le vide causant des gaz à évacuer des espaces intercellulaires feuille par les stomates. Rapid libération re-pressurisation suivante des résultats de vide dans l'infusion de la suspension d'Agrobacterium dans la feuille. À la suite de l'infiltration sous vide d'agrobactéries, les plantes sont en outre cultivées et l'expression de la cible est surveillée. Les plus hauts niveaux d'expression de cible sont généralement observées 2-3 jours après l'infiltration (dpi) avec un vecteur binaire et 4-7 dpi avec un vecteur de lancement, après quoi le niveau d'expression généralement dimi^17,18,42-45 session. Agrobacterium tumefaciens est le véhicule le plus largement utilisé pour délivrer un gène d'intérêt dans une plante pour la production de protéines. Agroinfiltration fonctionne exceptionnellement bien en N. benthamiana mais relativement peu dans la plupart des autres plantes, y compris Arabidopsis thaliana ^46.

Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple, efficace et économique pour la production de protéines transitoire dans 5-6 semaines, âgé de N. benthamiana en utilisant A. tumefaciens infiltration. L'inconvénient majeur de la mise à l'échelle industrielle de la technique de centrifugation est agro-infiltration de bactéries récoltées et remise en suspension du culot bactérien dans un milieu contenant du 4'-hydroxy-3 ', 5'-diméthoxyacétophénone (acétosyringone), les monosaccharides, et 2 - (N-morpholino) acide éthanesulfonique (MES) en mémoire tampon pour l'induction des gènes vir. Nous avons été en mesure de résoudre ces problèmes par l'optimisation de la Agrobacterium l'N. type sauvage espèce tabac hôte benthamiana et N. laine de bois, ainsi que dans hybride N. excelsiana.

1. Culture des plantes

Pour agroinfiltration suite, nous avons évalué deux espèces de Nicotiana de type sauvage (N. benthamiana et N. excelsior) et un hybrides (N. excelsiana) cultivées en hydroponie sur laine de roche dans les installations intérieures.

1. Faire tremper les dalles de laine de roche dans une solution d'engrais de l'usine.
2. Semez les graines de type sauvage N. benthamiana, N. excelsior et N. excelsiana (hybride de N. benthamiana × N. excelsior) sur les éléments nutritifs trempé surface de la laine de roche.
3. Faire pousser des plantes à partir de graines dans des conditions contrôlées (24 ° C et 40-65% d'humidité relative) et une photopériode de jours longs (14 heures de lumière et 10 h foncé, avec un éclairage de 130-150 uE m ^-2 s ^-1) pour 4-5 semaines pour N. benthamiana et N. excelsiana, et 5-6 semaines pour N. excelsior.

2. Construction de vecteurs pour Agroinfiltration

1. Insérer un gène rapporteur synthétique (protéine verte fluorescente [GFP]), sur toute la longueur d'hémagglutinine (HA) de la souche A/California/04/2009 de virus de la grippe (HAC1), et reconfiguré lichenase enzyme (LicKM) ¹⁸ séparément dans le vecteur de lancement pBID4 ¹⁸ (vecteur à base de TMV) pour obtenir pBID4-GFP, pBID4-HAC1 et pBID4-LicKM, respectivement ^18,32,41,47.
2. Présentez 10-50 ng de pBID4 portant GFP ou HAC1 dans des cellules électrocompétentes de A. tumefaciens souche GV3101 et LicKM dans des cellules électrocompétentes de A. tumefaciens souches GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 et A4 avec le électroporateur de MicroPulser de gène.
3. Utiliser le agrobactéries transformées pour des expériences d'infiltration, sauf indication contraire.

3. Passez l'aspirateur infiltration d'Agrobacterium dans les plantes de Nicotiana

1. Cultivez A. tumefaciens souches nuit (O / N) en milieu LB, med YEBium ou milieu AB supplémenté avec 50 mg / L de kanamycine à 28 ° C sous agitation à 200-250 rpm.
2. Diluer agrobactéries dans de l'eau Milli-Q à une densité optique à 600 nm (A ₆₀₀₎ de 0,5 ou centrifuger les cellules d'Agrobacterium développée dans du milieu LB ou YEB ou AB à 4000 × g pendant 10 min à 4 ° C, re-suspend dans le milieu d'induction (1x MS de sel, 10 mM de MES, acétosyringone 200 uM, 2% de saccharose [MMA]) à A ₆₀₀ de 0,5, et on agite à température ambiante pendant 1 à 3 h, sauf indication contraire.
3. Infiltrer les plantes dans une chambre à vide en plongeant des tissus végétaux aériens Nicotiana en suspension d'Agrobacterium et appliquer un vide de 50 à 400 mbar pendant 30 ou 60 secondes. L'infiltration optimale est appliqué systématiquement à 50-100 mbar pendant 60 secondes.
4. Une fois que le vide est rompu, enlever les plantes à partir de la chambre à vide, rincer à l'eau, et faire croître pendant 5-7 jours dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour la croissance de pré-imprégnation.
5. Pour tester l'efficacitédes produits chimiques induisant des gènes vir d'Agrobacterium, des concentrations différentes de l'acétosyringone (0, 100, 200 ou 400 uM) ont été ajoutés à la agrobactéries suspension dans du tampon d'infiltration (MS 1x, 10 mM de MES, 2% de glucose). Par l'effet du monosaccharide sur l'induction de gènes vir, différents pourcentages de glucose (0, 1, 2 ou 4%) ont été ajoutés à agrobactéries en suspension dans le tampon d'infiltration (MS 1x, 10 mM de MES, acétosyringone 200 uM). N. plantes benthamiana ont été infiltrés comme mentionné ci-dessus dans les étapes 3.3 et 3.4).
6. laboratoire d'Agrobacterium souches GV3101, C58C1 et LB4404 et les souches de type sauvage A4, AT06, AT10, et At77 hébergeant le vecteur pBID4-LicKM ont été dilués dans de l'eau Milli-Q au ₆₀₀ de 0,5. N. plantes benthamiana ont été infiltrées par chaque souche particulière, comme mentionné ci-dessus dans les étapes 3.3 et 3.4.

4. Procédure de co-agroinfiltration pour la Silencing suppresseur viral

1. Mix les Milli-Q cultures Agrobacterium GV3101 dilué à l'eau portant le gène de la GFP et le silence virale p19 suppresseur de tomate virus du rabougrissement (TBSV) à 01h01, 02h01, 03h01 et 04h01 ratios. Infiltrez N. plantes benthamiana comme décrit ci-dessus.
2. Infiltrez N. plantes benthamiana avec un mélange de deux Agrobacterium GV3101 cultures dilué à l'eau Milli-Q: la première portant le plasmide pBID4-HAC1 et le second portant l'un des suppresseurs de silencing - p19 de TBSV ou p23 du virus de la tristeza, dans le plasmide pCassp ( pCassp19) et dans le plasmide binaire PGR sous le promoteur 35S (PGR-P23), respectivement, au rapport 4:1.

5. Western Blot Analysis

1. Prélever des échantillons de feuilles aléatoires de N. benthamiana, N. excelsior ou N. plantes excelsiana à 4-7 dpi et pulvériser dans l'azote liquide à une poudre fine.
2. Ajouter trois volumes de tampon PBS 1x contenant 0,5% de TritonX-100 à chaque échantillon.
3. Secouer doucement les échantillons prélevés pendant 15 min à 4 ° C.
4. Spin l'extrait de 5 minutes et recueillir protéine soluble totale dans un tube propre Eppendorf.
5. Diluer les extraits à une dilution appropriée (1:50 à 1:100) dans du tampon d'extraction PBS 1x, et à 5 x tampon d'échantillon (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% de SDS, 0,5% de bleu de bromophénol, 50% de glycérol v / v, et de 500 mM de DTT) à une concentration finale de 1 x.
6. Échantillons Faire bouillir pendant 5 min.
7. Protéines séparées par 10% SDS-PAGE, transfert sur membrane Immobilon-P transfert, et de bloquer avec 0,5% de I-bloc.
8. Détecter la GFP en utilisant polyclonal de lapin anti-GFP antisérum à 1:5000 et HAC1 en utilisant un anticorps monoclonal anti-poly-histidine souris à 1:1000 dans la solution de blocage pendant 1 h.
9. Après marquage de l'anticorps primaire, laver les membranes trois fois pendant 10 minutes chacune avec 1 x PBST-20 et incuber avec une peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à l'anticorps anti-lapin à 1:5000 ou un conjugué HRPanticorps anti-souris de d à 1:10.000 pendant 1 heure, pour la GFP et la détection HAC1, respectivement.
10. Traiter des transferts de Western en utilisant le substrat SuperSignal West Pico Chemiluminescent.
11. Utiliser le logiciel de GeneTools pour analyser l'intensité de la bande de la protéine et obtenir la bande quantité calibrée.

La production de protéines: (calibrée quantité x dilution de l'échantillon) / quantité d'échantillon chargé) x 4 = mg / kg.
Equation: Production de protéines (P), la quantité calibrée (C), la dilution de l'échantillon (D) et la quantité de l'échantillon chargé (S).

6. Zymogramme Assay

1. N. collecter pBID4-LicKM infiltré benthamiana échantillons de tissus aléatoire.
2. Extraire les protéines en utilisant les mêmes procédés décrits ci-dessus pour l'analyse Western blot et ensuite analyser par 10% de SDS-PAGE à 0,1% lichénane inclus dans les gels.
3. Après électrophorèse, les gels de lavage deux fois pendant 10 min chacune dans un tampon de lavage (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] et 0,1% de Triton X-100), Puis les incuber dans du tampon de lavage à 65 ° C pendant 1 heure.
4. Après incubation, éliminer le tampon de lavage et colorer les gels avec 0,5% de rouge Congo pendant 5 min à température ambiante.
5. Rincer les gels dans l'eau Milli-Q trois fois pendant 10 minutes à chaque fois, et ajouter 1 M de NaCl à visualiser l'activité lichénase. La protéine de lichenase bactérienne purifiée a été utilisée comme contrôle positif pour l'activité enzymatique.

7. GFP Imaging

1. Effectuer une détection visuelle de la fluorescence GFP dans les plantes entières transformées de façon transitoire en utilisant une lampe UV à grande longueur d'onde qui s'est tenue à la main.
2. Photo transitoire transformé plantes avec un appareil photo numérique à travers un jaune 8, ES 52 filtre (temps d'exposition, 15 sec).
3. Obtenir des images de Western blot analyse en utilisant le logiciel GeneSnap sur un GeneGnome et quantifier les résultats en utilisant le logiciel de GeneTools, avec une courbe d'étalonnage basée sur la norme de la GFP purifiée.
4. Quantifier la protéine HAC1 en utilisant une courbe d'étalonnage sur la base de la purificationed HAC norme de protéine à partir de la souche A/Indonesia/05/05 de virus de la grippe.
5. Calculer les valeurs moyennes de 3 à 4 répétitions pour toutes les expériences.

Les besoins nutritifs pour la croissance des plantes. L'utilisation d'un milieu hydroponique de la croissance des plantes (Rockwool) et solution nutritive assure l'uniformité de N. croissance benthamiana et élimine la complexité (mécanique, de réglementation et de l'efficacité) associés à l'utilisation du sol pour la culture des plantes. Nous avons grandi N. benthamiana sur des plaques de laine de roche trempés dans les engrais disponibles dans le commerce pour déterminer les conditions optimales pour la croissance des plantes et de l'accumulation de la biomasse. Nous avons observé 95-100% de germination des semences. Il convient de noter que l'inclusion de phosphore est essentiel d'obtenir la germination, car nous avons trouvé que la solution nutritive manque de phosphore n'a pas soutenu la germination et la croissance de N. graines benthamiana (figure 1A).

Effets de la croissance d'Agrobacterium et des supports d'infiltration sur la production de la santé et de la protéine végétale. Nous avons testé plusieurs conditions du milieu afin d'optimiser l'efficacité de la til agroinfiltration technique de la production à grande échelle. Les bactéries (A. tumefaciens souche GV3101) abritant le produit d'assemblage pBID4-GFP ont été cultivées O / N dans différentes conditions du milieu (YEB, LB ou AB), et soit centrifugées et remises en suspension dans un milieu d'induction (MMA) (contenant 1 x Murashige & Skoog [MS] Basal Mélange de sel, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / L de saccharose et de l'acétosyringone 200 uM) ou dilué dans de l'eau Milli-Q à A 600 de 0,5 avant d'utiliser pour l'infiltration de la plante. Nous avons observé que l'infiltration sous vide de plantes avec des bactéries diluées dans de l'eau a donné lieu à la production de protéines comparables à ceux obtenus avec tous les supports d'infiltration dans des rapports antérieurs 42,48. En revanche, l'infiltration avec Agrobacteria non dilué grandi dans YEB ou LB médias a entraîné le flétrissement complet de N. benthamiana laisse dans moins de 24 heures après l'infiltration, tandis que Agrobacteria non dilués cultivées dans un milieu AB n'ont eu aucun effet sur ​​la santé des plantes infiltrés (datune non représenté). Comme illustré sur la figure 1B, les plantes infiltrées avec des cultures d'Agrobacterium cultivées dans YEB, LB ou AB médias et dilué avec de l'eau Milli-Q (1:5, 600 A du 0,6 au 0,8 ou 01:10, de 0,3 à 0,4 A 600) ont montré aucun symptôme et présentaient une production de GFP moyenne de 1645, 1520 et 1839, respectivement. agrobactéries centrifugé et remis en suspension dans un milieu d'induction (MMA) ne présentait aucun symptôme et aucune différence significative dans la production de protéines par rapport aux agrobactéries directement dilué dans de l'eau Milli-Q ( 1671 ± 102 et 1667 ± 131 mg / kg, respectivement). Par conséquent, de l'eau Milli-Q est recommandé pour la dilution des cultures d'Agrobacterium pour l'infiltration de la plante et a été couramment utilisé dans nos expériences ultérieures pour obtenir un A 600 de 0,5.

Effets de la densité Agrobacterium de cellules en suspension et évolution dans le temps de l'expression de la cible. Nous avons ensuite examiné si la densité des cellules bactériennesaffecte l'efficacité de l'infiltration et de niveaux d'expression de la cible. A cet effet, nous avons évalué quatre densités de cellules en suspension d'Agrobacterium portant différents pBID4-GFP, A 600 de 1,0, 0,5, 0,1 et 0,05. À la suite de l'infiltration, N. benthamiana plantes ont été surveillées pendant le développement des symptômes visibles et évolution dans le temps de l'expression de la cible en prélevant des échantillons à 4, 7 et 10 dpi. A 4 dpi, nous avons observé des différences notables dans la fluorescence de la GFP chez les plantes infiltrées avec des densités différentes de suspension de cellules d'Agrobacterium (pas d'expression de la GFP a été observée à 600 A de 0,05). À 7 dpi, la fluorescence de GFP a été similaire dans les plantes infiltrées avec des densités de cellules en suspension de 600 A 1,0, 0,5 et 0,1, mais était plus faible dans les plantes infiltrées à un A 600 de 0,05. Comme le montre la figure 1C, ces données ont été confirmées par Western blot des analyses des échantillons prélevés à 4 ppp, présentant de très faible production de protéines à A 600 600 A de 1,0 (1,739 mg / kg). À 7 dpi, plantes n'ont pas montré de différences significatives dans la production de GFP estimé à 600 A de 1,0, 0,5 et 0,1 (1662, 1870 et 1890, respectivement), tandis que A 600 de 0,05 montré la production de GFP inférieure (1,199 mg / kg). En revanche, à 10 dpi aucune différence dans la production de la GFP ont été observées chez les plantes infiltrées avec l'une des quatre densités de suspension de cellules (1218, 1181, 1197 et 1304).

Infiltration d'autres souches d'Agrobacterium. Afin d'augmenter la diversité des souches d'Agrobacterium disponible pour la production de protéines transitoire, nous avons testé des isolats de type sauvage. Ces souches, isolées de la couronne fiel des hôtes naturels, ont été aimablement fournies par le Dr Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana). Pour examiner leur utilité dans la production de protéines transitoire, nous infiltré N. benthamiana avec les souches suivantes carrying pBID4-LicKM 18: A. rhizogenes (A4) et A. tumefaciens type sauvage Nester souches A348, A208, A281 et (nommé AT6, AT10, et At77, respectivement), ainsi que des souches de laboratoire d'ingénierie de A. tumefaciens GV3101, C58C1, et LBA4404. Les feuilles infiltrées ont été recueillies à 7 dpi et le niveau d'expression LicKM a été estimé par analyse Western blot. Comme le montre la Figure 2A, le plus haut niveau de production LicKM peut être réalisé avec les souches GV3101, A4 et LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 et 1450 ± 117 mg / kg, respectivement), avec de légères différences; le niveau le plus bas d'expression (~ 900 ± 102 mg / kg) avec C58C1; et la production intermédiaire avec AT6, AT10 et At77 (~ 1250 ± 19, 1100 ± 42 et ± 1,200 111 mg / kg, respectivement). L'activité enzymatique a été démontrée en utilisant lichenase dosage Zymogramme. Figure 2B montre que lichenase produites dans les tissus des plantes infiltrées en utilisant l'une des caractéristiquesdes souches d'Agrobacterium était enzymatiquement active. Il faut également noter que les plantes de N. benthamiana infiltrés par des souches A4 et At77 présentaient des symptômes pathologiques (retard de croissance, pétiole allongement et de curling, et l'enroulement des feuilles), alors qu'avec la souche AT10 les symptômes étaient bénins. Aucun symptôme n'a été observé dans les plantes de N. benthamiana infiltrés avec la souche de laboratoire GV3101 (figure 2C).

Infiltration des espèces Nicotiana alternatives. Nous avons comparé les taux de production de biomasse et la production de protéines chez deux espèces sauvages du genre Nicotiana (N. benthamiana et N. excelsior) et dans une espèce hybride, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Des espèces testées, N. benthamiana, une foule largement utilisé pour la production de protéines transitoire en utilisant des systèmes d'expression basés sur Agrobacterium ou base de virus 2,34,49, atteint préparation d'infiltration dans les 4-5 semaines de germination. La période de croissance nécessaire pour générer le niveau optimal de la biomasse est également 4-5 semaines pour N. excelsiana mais est plus longue (6-7 semaines) pour N. excelsior. En outre, les nœuds de plantes sont relativement courtes pour N. excelsior par rapport à d'autres espèces de Nicotiana.

En outre, nous avons observé que vide infiltration de N. benthamiana et N. excelsiana à 50-250 mbar pendant 60 secondes est très efficace pour agroinfiltration de feuilles entières, tandis que N. excelsior est difficile d'infiltrer en raison de leurs canopée et coriaces feuilles inférieures, même lorsque le vide a été appliqué trois fois pendant 1 minute chaque, en présence d'agents tensio-actifs non-ioniques tels que Sillwet-77 ou S240. En outre, le taux de germination de N. excelsiana et N. graines excelsior est ~ 40-50%; afin d'augmenter le taux de germination de 90 à 100%, les semences doivent être traitées avec 10% bleach pendant 1 heure avant le semis. Dans les mêmes conditions de croissance, la biomasse la plus élevée de la feuille qui peut être généré à partir de N. excelsiana est environ deux fois plus élevée par rapport à N. benthamiana (tableau 1).

La production de protéine a été examinée en N. benthamiana, N. excelsior et N. excelsiana infiltrée par la souche GV3101 Agrobacterium pBID4-GFP. l'accumulation de GFP a été évaluée à 7 dpi dans les feuilles infiltrées entiers en utilisant la lumière UV, suivie par une analyse Western blot. figure 3A montre une distribution uniforme de la GFP dans N. benthamiana et N. excelsiana et la répartition inégale dans N. excelsior (en raison d'une difficulté d'infiltrer une zone entière de la feuille de N. excelsior). figure 3B montre le niveau de production de GFP estimée par l'illumination de la lumière UV dans les feuilles infiltrées recueillies auprès des trois espèces de Nicotiana à 7 dpi. L'accumulation de la GFPniveau de règlement est plus élevé dans N. benthamiana (~ 2,23 g / kg) par rapport à N. excelsiana et N. excelsior (~ 1,89 et 1,54 g / kg, respectivement). Le faible niveau de la production de protéines dans N. excelsior est due à l'infiltration et de la distribution de la GFP accumulé dans la feuille recueillies inégale.

Nous avons observé que les feuilles supérieures sont directement exposés à la lumière présentent souvent les niveaux les plus anciens et les plus élevés de l'accumulation de la GFP transitoire (2-4 dpi) que les feuilles sous la canopée. Cependant, dans nos études, l'accumulation GFP était le plus élevé à 7 dpi et a été réparti uniformément dans la plupart des feuilles, sauf dans des feuilles non infiltrée nouvellement croissance qui ne présentent pas d'accumulation de la GFP.

Effets de la pression à vide et de la durée sur la production de protéine transitoire. Infiltration sous vide augmente de manière significative les niveaux d'expression transitoire de comparaison à la pression appliquée par injection à la main avec une seringue sans aiguille 42. L'application d'unevide provoque des gaz à évacuer plante submergée par les stomates des feuilles. Lorsque le vide est rompu et la pression augmente rapidement, la suspension d'Agrobacterium est entraînée dans les feuilles de remplacer les gaz évacués 50.

Pour tester l'effet de la pression du vide sur les feuilles de N. benthamiana, on a infiltré les plantes avec la souche GV3101 d'Agrobacterium hébergeant pBID4-GFP sous diverses pressions de vide (50 à 400 mbar) pendant 30 ou 60 secondes. Il a été démontré que le vide plus fort (au-dessous de 50 mbar) appliqué pendant 30 ou 60 s à des résultats d'endommagement mécanique de feuilles infiltrées, conduisant à un flétrissement des tissus et la mort de la plante peu après infiltration (24-48 h). D'autre part, l'application du vide plus doux (400 mbar) sur les résultats de l'infiltration de seulement 50% de la surface foliaire et une diminution du niveau de production de la GFP (303 ± 90 mg / kg) (Figure 4A). Surtout, nous n'avons pas observé de différences dans la production de GFP sous 50, 100 et 200 mbar (1651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg, respectivement) (figure 4A) et légère à pas, les effets néfastes sur la santé de la plante lorsque les pressions de vide de 50 à 200 mbar ont été appliquées pendant 30 ou 60 sec. Par conséquent, de 50 à 100 mbar de pression de vide est recommandé pour les expériences d'infiltration.

L'effet de la durée de la dépression sur l'expression de la cible a été évaluée en infiltrant un plat de N. plantes benthamiana toutes les heures avec un A 600 de 0,5 de GV3101 hébergeant pBID4 -. GFP pendant 8 heures à la même culture d'Agrobacterium La figure 4B montre que le niveau de production de la GFP a été similaire à tous les temps relève jusqu'à 8 heures, ce qui suggère que plus ce la période de temps Agrobacterium maintient sa capacité de lancer un ADN simple brin.

Effet de l'induction chimique de la production de protéine. Certains métabolites phénoliques des plantes et les sucres peuvent indgènes de virulence UCE de A. tumefaciens 1,52. En conséquence, de nombreux produits chimiques et monosaccharaides ont été rapportés pour améliorer la production de protéine transitoire dans diverses espèces de plantes. Acétosyringone est le plus souvent ajoutée aux cultures de A. tumefaciens pour induire l'opéron vir avant agroinfiltration 40,53-57.

Nous avons évalué l'effet de différentes concentrations de acétosyringone (0, 100, 200 et 400 pm) et de glucose (0,4%) sur la production transitoire de protéine GFP dans N. benthamiana infiltrée par la souche GV3101 Agrobacterium pBID4 - GFP. À cette fin, nous re-suspendu cellules d'Agrobacterium en MMA médias d'induction contenant différentes concentrations de glucose et acétosyringone pour 1-3 heures avant infiltration. Selon les résultats de l'observation visuelle à la fois (données non représentées) et l'analyse Western blot (figure 4C), aucune des concentrations testéesde ces composés induit une augmentation significative de la fluorescence de la GFP ou de la production de protéine par rapport au témoin où les médias d'induction ne contenaient pas d'acétosyringone ou le glucose.

Effet de la co-imprégnation d'un suppresseur de silence sur la production transitoire de gènes GFP et HAC1 en N. benthamiana laisse. Il a déjà été démontré que la co-expression d'un suppresseur de silencing (p19 du virus du rabougrissement de la tomate [TBSV]) interfère avec l'inactivation de gène post-transcriptionnelle (PTGS), ce qui entraîne une production accrue de protéines rapporteurs 34.

Nous avons évalué l'effet de la co-infiltration de N. benthamiana avec le vecteur de lancement portant le gène rapporteur GFP (GFP-pBID4) et p19. Avant l'infiltration, un A 600 de 0,5 dilutions de A. cultures tumefaciens GV3101 hébergeant pBID4-GFP et p19 ont été respectivement mélangés à des rapports de 1:1, 2:1, 3:1, et 4:1. expression de la colonne de suppression de silence a été contrôlée par le promoteur de virus de la mosaïque de chou-fleur 35S. Comme indiqué par les résultats de l'analyse Western blot à 7 dpi (figure 5A), la présence de p19 n'a pas augmenter ou diminuer la production de GFP dans N. benthamiana, à n'importe quel rapport des deux suspensions d'Agrobacterium.

Nous avons également comparé les effets de deux gènes suppresseurs taire virales - p23and p19 - sur la prévention de la PTGS pour HAC1. Des cultures de Agrobacterium portant le vecteur de lancement pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) et l'un des deux plasmides viraux suppresseurs de silencing ont été dilués à un A 600 de 0,5, mélangé à un rapport de 4:1, respectivement, et co-infiltré dans le vieux 4-5-semaine N. benthamiana. Une suspension de A. tumefaciens portant pBID4 - HAC1 seul a été infiltré comme témoin. Les échantillons de feuilles ont été prélevés infiltrées de 3 à 8 dpi. L'expérience a été répéATED trois fois et les niveaux moyens d'expression de la HAC1 déterminées par analyse Western blot.

Comme le montre la figure 5B, co-infiltration de N. benthamiana avec p23 ou p19 conduit à (642 ± 157 et 764 ± 108 mg / kg, respectivement) une augmentation de la production HAC1 rapport à l'utilisation sans suppresseur de silencing (environ 15-25%, respectivement) à 6 dpi. Ceci suggère que p23 et p19 sont efficaces dans notre système. Toutefois, il convient de noter que l'accumulation de HAC1 est survenu un jour plus tôt lorsque pBID4-HAC1 a été co-infiltré avec p19. Par conséquent, les résultats démontrent que les effets de la mise sous silence suppresseur p19 sur HAC1 et l'accumulation de GFP sont différents, ce qui suggère l'amélioration sélective de l'expression et / ou la stabilité de certaines protéines dans N. transitoire benthamiana.

Nous avons également observé que la fois en présence et en l'absence d'un suppresseur de silençage le niveau de la protéine HAC1 production a commencé à baisser à 7 dpi. Cela indique que le calendrier de la baisse de la production de protéines transitoire dans N. benthamiana infiltré avec le vecteur de lancement est spécifique à la cible.

La banque de cellules d'Agrobacterium hébergeant le vecteur de lancement a été évaluée chaque année pour la stabilité d'un gène cible, Agrobacterium viabilité et le taux d'accumulation de la protéine. Le stock de glycérol de la banque de cellules de la souche GV3101 transformée avec pBID4-HAC1 qui a été stocké à -80 ° C a été montré pour être très stable pour plus de trois ans sans changements dans le niveau de la production de protéines transitoire N. infiltrée plantes benthamiana. figure 5C montre que la production de protéines HAC1 estimée par Western blot dans les années 2010, 2011, 2012 et 2013 était de 670, 685, 566 et 683 mg / kg, respectivement. La production de HAC1 moyenne en N. plantes benthamiana étaient 651 ± 49,4 mg / kg.

Figure 1. D'analyse Western blot de l'expression génique transitoire N. benthamiana. (A) Six semaines d'âge N. benthamiana 1) plantes qui poussent dans une solution d'engrais contenant 4,8% de phosphore et 2) la culture de plantes dans une solution d'engrais contenant 0% de phosphore. Vingt-cinq pg de frais équivalent de poids de la feuille a été chargé par voie. (B) Comparaison de la production de la GFP dans les usines vide infiltré avec pBID4-GFP hébergement cultures Agrobacterium GV3101 cultivés dans trois milieux différents: YEB, AB et LB. cultures GV3101 cultivées O / N dans YEB ou milieu LB ont été centrifugées à faible vitesse et remises en suspension dans un milieu d'induction (MMA) (pistes: MMA-1 et MMA-2, respectivement), ou cultivées O / N dans YEB, LB ou AB médias et directement dilué à 1:5 ou 1:10 avec de l'eau Milli-Q (pistes: YEB / 5 et YEB/10; AB / 5 et AB/10; LB / 5 et lb/10) (C) de comparaison. de l'expression de GFP à 4, 7 et 10 dpi suivantes infiltration sous vide avec différentes concentrations (de 1,0 à 600 A, 0,5, 0,1 et 0,05) de A. tumefaciens souche GV3101 portant pBID4-GFP.

Infiltration sous vide Figure 2. Comparaison de la production de lichénase transitoire et l'activité suivante de N. plantes benthamiana avec diffélouer souches de Agrobacteria. cultures de souches d'agrobactéries (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 et LBA4404) hébergeant le vecteur de lancement pBID4-LicKM ont été infiltrés individuellement dans des feuilles de N. benthamiana. Feuilles infiltrés ont été prélevés à 7 dpi. (A) lichénase production quantifiée par Western blot. (B) test Zymogramme démontrant production lichénase par l'activité enzymatique. (C) Effet d'Agrobacterium (type sauvage A4, AT10, At77 et souche de laboratoire GV3101) infiltration sur N. phytosanitaire benthamiana à 7 dpi. Vingt-cinq pg de frais équivalent de poids de la feuille a été chargé par voie.

Figure 3. Transient expression de la GFP dans des feuilles de N. benthamiana, N. excelsiana et N. excelsior à 7 dpi après infiltration sous vide avec A. tumefaciens hébergeant le lancement vecteur pBID4 - GFP. (A) L'examen visuel de l'expression de GFP sous lumière UV. (B) Analyse par transfert Western de l'accumulation de GFP.

Figure 4. (A) Effets de la pression de vide sur l'expression de la GFP transitoire et la santé des plantes. N. plantes benthamiana ont été infiltrées par pBID4 -. GFP sous une dépression de 400, 200, 100 ou 50 mbar, à vide le temps de maintien de 30 ou 60 secondes (B) la stabilité et l'infectiosité de A. tumefaciens dans N. benthamiana infiltrée par Agrobacterium GV3101 hébergement pBID4-GFP cultivée dans un milieu AB et diluée à un A 600 de 0,5. Agroinfiltration a été réalisée en infiltrant un plat de N. benthamiana plantes toutes les heures de la même culture d'Agrobacterium diluée (les voies 0-8). (C) Effet de différentes concentrations de glucose et d'acétosyringone sur l'expression transitoire de GFP. La souche d'Agrobacterium GV3101 hébergeant pBID4 - GFP a été cultivé O / N dans un milieu YEB, centrifugé et remis en suspension à un A 600 de 0,5, soit dans le MMA contenant 2% de glucose avec de l'acétosyringone à 0, 100, 200 ou 400 uM, ou en MMA contenant 200 uM d'acétosyringone avec du glucose à 0, 1, 2 ou 4%. Les suspensions d'Agrobacterium ont été maintenus pendant 3 heures à température ambiante avant l'infiltration.

Figure 5. Effets de suppresseurs de silencing sur la production de protéines transitoire N. benthamiana laisse. (A) Analyse par transfert Western de la protéine GFP suite à la co-infiltration de pBID4 p19-GFP et à différents rapports. Les échantillons prélevés à 7 dpi (25 ug d'équivalent de poids frais des feuilles ont été chargés par couloir). (B) Une culture d'Agrobacterium portant pBID4-HAC1 ont été mélangés séparément à un rapport de 4:01 avec une culture portant la p19 ou p23 suppresseur de silençage plasmides. Les combinaisons résultant des cultures Agrobacterium ont été vide infiltrés dans les plantes. Tissus infiltrés de HAC1 ont été recueillies tous les jours jusqu'à 8 dpi pour la quantification de protéines recombinantes. (C) Stabilité de la banque de cellules d'Agrobacterium. Les plantes ont été infiltrées avec le même lot de la banque de cellules d'Agrobacterium, chaque année pour évaluer l'accumulation de la protéine. Cinquante pg de frais équivalent de poids de la feuille a été chargé par voie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de eest la figure.

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