Capsulaire sérotypage des Streptococcus pneumoniae Utilisation de la réaction Quellung

Résumé

La réaction Quellung est la technique de référence en matière de sérotypage Streptococcus pneumoniae. Cette technique utilise un microscope et antisérums pneumocoque spécifique et est couramment utilisé dans les laboratoires de référence et de recherche dans le monde entier.

Résumé

Il ya plus de 90 différents sérotypes capsulaires de Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) l'. En plus d'être un outil pour comprendre l'épidémiologie pneumocoque, sérotypage capsulaire peut fournir des informations utiles pour les études sur l'efficacité du vaccin et d'impact. La réaction Quellung est la méthode de l'étalon-or pour le sérotypage capsulaire pneumococcique. Le procédé consiste à tester une suspension de cellules avec des antiserums réunis pneumococcique et spécifique dirigé contre le polysaccharide capsulaire. Les réactions antigène-anticorps sont observées au microscope. Le protocole comporte trois étapes principales: 1) Préparation d'une suspension de cellules bactériennes, 2) le mélange des cellules et des antiserums sur une lame de verre, et 3) la lecture de la réaction Quellung en utilisant un microscope. La réaction Quellung est relativement simple à réaliser et peut être appliqué partout où un microscope et des antiserums appropriés sont disponibles.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est responsable de la mort d'environ 800 000 enfants de moins de cinq ans chaque année, avec le fardeau de la maladie relevant principalement dans les pays pauvres en ressources ^1. Les maladies pneumococciques varient en gravité des infections localisées telles que l'otite moyenne aiguë à la vie en danger des infections sévères telles que sepsis, la méningite et la pneumonie ^2. Plus de 90 sérotypes capsulaires des pneumocoques ont été décrits ^{3, 4.} Vaccins antipneumococciques actuelles offrent une protection contre les sérotypes qui sont responsables de la majorité de la maladie invasive ^{5, 6.} Cependant, l'utilisation largement répandue de vaccins a été associé avec le remplacement des sérotypes inclus dans le vaccin par des sérotypes inclus dans le vaccin, à la fois dans le transport du nasopharynx et la maladie invasive ^{7, 8.} Cela souligne l'importance de sérotypage pour épidémiologiquesurveillance et l'impact du vaccin études à long terme ^9.

La méthode de l'étalon-or pour le typage pneumocoque est le test de réaction capsulaire, connu comme la réaction Quellung, d'abord décrit par Neufeld en 1902 (voir autrichienne ^10). Un haut degré de concordance a été trouvée entre les laboratoires, et entre la réaction Quellung et d'autres méthodes de sérotypage ^11-13. Il existe plusieurs variantes de la réaction Quellung ^{10, 14-16.} Le procédé décrit ici ne nécessite pas l'utilisation d'une contre-coloration ou la lentille à immersion d'huile, mais plutôt, une goutte d'échantillon préparé est mélangé avec le sérum de frappe et immédiatement examinés sous un grossissement de 400X.

La réaction est généralement effectuée Quellung disponible dans le commerce en utilisant des antisérums. Le procédé décrit ici utilise moins d'antisérums par rapport à d'autres méthodes ^{16, 17,} ce qui rend plus rentable. Une fois un isolmangé est identifié comme un pneumocoque, il est testé de manière séquentielle avec des pools d'antisérums jusqu'à ce qu'une réaction positive est observée. Chaque sérum de la piscine contient différents mélanges d'antisérums dirigés contre 91 sérotypes pneumococciques ^18. Une fois la piscine est établie, le type individuel et de groupe antisérums qui sont inclus dans la piscine réactive sont testés individuellement dans l'ordre. Type antisérums réagit généralement avec un seul sérotype (par exemple de type 1 antisérum réagit avec le sérotype 1), alors que les antisérums de groupes réagissent avec tous les sérotypes dans un groupe particulier (par exemple le Groupe 22 antisérum réagit avec les sérotypes 22F et 22A). Certains sérotypes au sein des groupes se différencient en utilisant le facteur antisérums (par exemple sérotype 22F réagit avec facteur 22b, mais pas 22c). Dans ce cas, l'essai se poursuit avec tous les antisérums facteur pertinent jusqu'à ce sérotype est déterminé ^{19, 20.} La réaction Quellung est simple et rapide ¹⁴ et peut être réalisée dans n'importe quel laboratory qui est équipé d'un microscope de bonne qualité et un ensemble approprié d'antisérums.

Protocole

Une. Préparation de suspension cellulaire pour taper

1. L'utilisation d'un jetable boucle 1 pl stérile, prendre un petit balayage de la nuit fraîche et pure culture de pneumocoques cultivé sur gélose au sang de cheval non sélectif solide et inoculer 100 pi Heart Infusion bouillon (HI). La suspension doit apparaître comme juste visiblement trouble. Agiter doucement le tube pour émulsionner.
   Remarque: d'autres médias tels que le bouillon Brain Heart Infusion peuvent également convenir. L'addition de sérum (par exemple une concentration finale de 10% (en volume) de sérum / de cheval) et incubation à 37 ° C pendant environ 1 heure avant l'utilisation peut être utilisé pour améliorer la réaction.

2. Contrôle de la densité de suspension cellulaire

La suspension de cellules préparée à l'étape 1.1 est également utilisé en tant que témoin négatif, et doit être vérifiée pour la densité des cellules avant d'ajouter les sérums de typage.

1. L'utilisation d'une boucle de 1 ul, transférer une goutte de l'inoculum préparé dans l'étape 1.1 sur un verreglissière de microscope.
2. En utilisant une paire de forceps, placer une petite lamelle circulaire sur la suspension.
3. Utilisation du réglage de contraste de phase, observer la préparation au microscope sous un grossissement de 400X, pour vérifier la densité de la suspension (figure 1A).
   1. Si l'inoculum est trop lourde (Figure 2A), ajouter plus de bouillon à la suspension cellulaire effectuée à l'étape 1.1 de la diluer. Mélanger doucement à nouveau.
   2. Si l'inoculum est trop clair, par exemple, il ya <50 cellules visibles dans le champ microscopique (figure 2B), ajouter plus de bactéries à la préparation de la suspension cellulaire fait dans l'étape 1.1 et Mélanger doucement.
      Remarque: Avec l'expérience, la densité de la suspension cellulaire peut être jugé par la secousse et la tenue à la lumière, où il doit apparaître comme juste visiblement trouble.
4. Répéter les étapes 2.1 à 2.3 jusqu'à ce qu'un nombre adéquat de cellules sont visibles dans le champ microscopique.
   Remarque: les lames de verre et coverslips présentent un danger d'objets tranchants. Après utilisation, les lames et lamelles sont contaminés avec du matériel infectieux et doivent être éliminés dans un récipient biohazard objets tranchants.

3. Dactylographie

1. Transférer ~ 1 ul de l'inoculum préparé (par exemple en utilisant une boucle de 1 ul) sur la lame de microscope en verre. Jeter la boucle dans le récipient biohazard objets tranchants.
2. Ajouter un volume égal (1 pi de anse) de sérum à température ambiante sur la lame et mélanger deux gouttes bien avec la boucle.
3. En utilisant une paire de pinces, placer une petite lamelle circulaire sur la suspension, en prenant soin de ne pas toucher la baisse. Placer la lamelle couvre-objet sur la suspension juste après l'addition d'anti-sérums à empêcher le liquide sur la lame de se dessécher.
4. En utilisant un microscope, observer la suspension sous contraste de phase avec un grossissement de 400X. Une réaction négative Quellung est observée lorsque peu ou pas de «gonflement» des cellules pneumocoque peut être vu à 400X grossissement, similaire à ce qui est observé dans la suspension de cellules pneumococciques avec des antisérums ajouté aucun (témoin négatif). Une réaction Quellung positif est observé lorsque les cellules apparaissent agrandie ou "gonflé" et la plus visible par rapport aux cellules du contrôle négatif.
   Remarque: les réactions équivoques doivent être étudiés plus loin, par exemple en examinant la réaction au bout de 5 à 10 min d'incubation à température ambiante, ou en répétant la réaction avec le plus d'antisérum.
5. Effectuer sérotypage pneumocoque aux essais successifs de piscines antisérums individuels jusqu'à une réaction positive est observée. Alternativement, des piscines peuvent être appliquées en «cycles» en fonction de l'incidence locale des sérotypes.
   Remarque: Test en «cycles» veille à ce que les piscines contenant des anticorps pour les sérotypes les plus communs sont testés en premier, en minimisant l'effort et de coût. Essais simultanés de plusieurs piscines fournit également des contrôles négatifs supplémentaires, ce qui peut être utile dans interpretation. Si toutes les piscines dans un «rondes» sont particulièrement négatif, tester l'isolat avec les rondes subséquentes de piscines.
6. Testez l'isolat en utilisant le type approprié ou un groupe anti-sérum contenu dans la piscine réactive. Le cas échéant, utilisez facteur antisérums de différencier davantage le sérotype.
   Remarque: Les clés de la antisérums pneumocoques fournis par le fabricant sont utilisés dans la sélection de pool approprié, le type, le groupe ou le facteur antisérums et l'interprétation des résultats (y compris les réactions croisées).
7. Si les résultats négatifs sont obtenus avec toutes les piscines, tester l'isolat avec le réactif Omniserum (contient des anticorps contre 91 sérotypes ^21). Si une réaction Quellung positif n'est pas encore observé lors de l'essai d'un pneumocoque isoler avec le réactif Omniserum, c'est peut-être parce que l'isolat exprime peu ou pas de capsule, ou que des anticorps contre le sérotype ne sont pas représentés dans le Omniserum. Cette dernière catégorie peut inclure de nouveaux sérotypes.

Résultats

Une réaction positive est observée lorsque Quellung anticorps spécifique d'un type se lie à la capsule du pneumocoque, ce qui conduit à une modification de son indice de réfraction ^10. Vu sous un microscope, les bactéries semblent 'gonflé' et plus visible ^14. Figure 1A montre des cellules pneumocoque dans un bouillon HI. Lorsque l'anti-sérum spécifique de type est ajouté à la suspension bactérienne, les pneumocoques apparaissent «gonflée», de réfraction et plus arrondie (figure 1B).

Trop de cellules ajoutées au bouillon de bactéries peuvent entraîner l'agrégation de cellules ou une réaction faussement négative. Montre la figure 2 inoculations de cellules pneumocoque dans un bouillon HI qui sont «trop lourd» (figure 2A) ou «trop léger» (figure 2B).

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Figure 1. Réaction Quellung négatif et positif. Préparations de sérotype 9V pneumocoque isoler sans sérum (1A) et avec le groupe 9 antisérum (1B), ont été vu sous un grossissement de 400X. Ce dernier montre le «gonflement» et l'arrondissement des cellules bactériennes généralement vu dans une réaction Quellung positif.

Figure 2. Inoculum trop lourd et trop léger. Préparations de suspensions cellulaires pneumocoque qui sont trop lourds (2A) ou trop léger (2B), lorsqu'on les examine sous un grossissement de 400X.

Discussion

Une étape cruciale de cette technique est d'assurer une culture pure est utilisée pour préparer la suspension en même temps que l'addition d'un nombre approprié de cellules bactériennes dans le bouillon. Il convient de noter que la croissance de la colonie et la morphologie sur des plaques de gélose varie entre différents isolats pneumococciques. Certains produisent des colonies sèches et rugueuses, qui peuvent être difficiles à enlever avec une boucle et ne pas émulsionner bien dans le bouillon. Pour cette raison, une plus grande balayage de bactéries peut être nécessaire lors de la préparation de la suspension cellulaire. Dans tous les cas, il est impératif que les cellules individuelles, et non des agrégats, sont évidentes dans le contrôle négatif de sorte que leur importance relative peut être comparée à des cellules avec des antiserums ajoutés. En outre, un trop grand nombre de cellules bactériennes peuvent conduire à une fausse réaction négative, où un excès d'antigène capsulaire peut inhiber la réaction Quellung ^10. Pour cette raison, il est important pour créer une suspension bactérienne avec une densité de cellules appropriée (figure 1). La suspensionpension peut être conservé pendant plusieurs mois par l'ajout de quelques gouttes de formol concentré. Cela permet le contrôle par lot plus facile et aussi stérilise le bouillon de réduire le risque d'infections acquises au laboratoire, bien que ce doit être pesé contre le risque de sécurité de formol manipulation, qui est toxique, corrosif, cancérogène, sensibiliser et inflammable. En outre, nous avons observé que certains isolats montrent les réactions les plus faibles en présence de formol (données non présentées).

Quellung réactions sont examinées en utilisant un microscope. L'utilisation de contraste de phase améliore la visibilité de la capsule. Dans certains laboratoires, la réaction est visualisé en utilisant l'huile d'immersion à 1000 grossissement X ^{14, 16.} En outre, certains laboratoires utilisent un contre-colorant (bleu de méthylène) pour améliorer encore la visibilité d'une réaction positive ^{de 10, 16, 22.} La méthode présentée ici est considérée sans huile-iMMERSION et sous un grossissement de 400X ^{15, 17.} Cette méthode est rapide, simple et relativement facile à lire ^23.

Il est important de maintenir de bonnes procédures de contrôle interne de la qualité pour s'assurer que les procédures d'antisérums et d'essai sont dans l'ordre. La participation à un programme d'assurance de qualité externe est souvent bénéfique.

Une limitation importante de la réaction Quellung pour le sérotypage des pneumocoques est le coût élevé des antisérums nécessaires. Cependant, ceci est minimisé dans le protocole ci-dessus en raison de la faible quantité d'antisérum utilisé pour chaque réaction. Plusieurs autres procédés ont été décrits pour le sérotypage des pneumocoques ^{23, 24.} Cependant, Quellung reste l'étalon-or et le développement de nouvelles méthodes nécessite normalisation contre la réaction Quellung ^23. Utilisant des antisérums échéant, la réaction Quellung peut également être utilisée pour identifier et saisir d'autres bouchonsule bactéries produisant ^25. La réaction Quellung contribue à la caractérisation des sérotypes pneumococciques actuelles et émergentes, ainsi que de fournir des informations sur l'efficacité du vaccin et l'impact à long terme de la vaccination sur le transport et la maladie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antisérum antipneumocoque (Neufeld)	SSI Diagnostica		http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Ramener tous les antisérums à température ambiante avant utilisation
Antisérum pneumocoque (Omni)	SSI Diagnostica	2438	Ramener tous les antisérums à température ambiante avant utilisation
Microscope optique	Leica Microsystems	Leica DML
Boucles d’inoculation jetables calibrées 1 & micro ; l	Plaques Copan	CD175S01
Horse Blood Agar (HBA)	Thermo Fisher Scientific	PP2001	http://www.thermofisher.com.au/ Porter à température ambiante avant utilisation Bouillon d’infusion
cardiaque (HI)	Unité de préparation des milieux (MPU), Université de Melbourne	40HIN	Amener à température ambiante avant utilisation
Lames de microscope en verre 76 mm x 26 mm	Lomb Scientific	7101	Risque pour objets tranchants : Jeter dans un contenant pour objets tranchants à risque biologique
Lamelles circulaires en verre	NeuVitro	GG-5
*À l’exclusion de l’antisérum, tous les autres matériaux peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
*Les plaques préparées à partir de sang de mouton défibibré conviennent, mais les plaques de sang préparées à partir de sang citraté ou de sang humain ne le sont pas