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Article de méthode

Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique

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DOI :

10.3791/51209

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7 mai 2014

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1Laboratoire de Radiopathologie, CEA DSV iRCM SCSR, 2INSERM, U967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Université Paris Sud, UMR 967

Dans cet article

Résumé

L'administration de deux analogues de la thymidine, et EdU BrdU, dans des souris gravides permet l'analyse de la progression du cycle cellulaire dans les neurones et les cellules progénitrices dans le cerveau de souris embryonnaire. Cette méthode est utile pour déterminer les effets du stress génotoxique, y compris les rayonnements ionisants, au cours du développement du cerveau.

Résumé

Les neurones du cortex cérébral sont générées lors du développement du cerveau à partir de différents types de cellules souches et progénitrices neurales (CNPS), qui forment un épithélium pseudo tapisse les ventricules latéraux du cerveau embryonnaire. Stress génotoxiques, tels que les rayonnements ionisants, ont des effets très néfastes sur le développement du cerveau liée à la grande sensibilité de la NSPC. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dépend de la caractérisation de la réponse aux dommages de l'ADN de ces types particuliers de cellules, ce qui nécessite une méthode précise pour déterminer la progression NSPC à travers le cycle cellulaire dans les tissus endommagés. Ici on trouve une méthode basée sur des injections intrapéritonéales successives de EdU et BrdU chez les souris enceintes et en outre la détection de ces deux analogues de la thymidine en coupes coronales du cerveau embryonnaire. EdU BrdU et sont tous les deux incorporés dans l'ADN pendant la replication des cellules en phase S et sont détectés par deux techniques différentes (azide ouun anticorps spécifique, respectivement), ce qui facilite leur détection simultanée. EdU BrdU et la coloration sont ensuite déterminés pour chaque noyau NSPC en fonction de sa distance à partir de la marge ventriculaire dans une région standard du télencéphale dorsal. Ainsi, cette technique de double marquage permet de distinguer les cellules qui ont progressé à travers le cycle cellulaire à partir de ceux qui ont activé un point de contrôle du cycle cellulaire, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire en réponse à des dommages à l'ADN.

Un exemple d'expérience est présentée, dans laquelle Edu a été injectée avant l'irradiation et BrdU immédiatement après et les analyses effectuées dans le 4 h après l'irradiation. Ce protocole fournit une analyse précise de la réponse aiguë de lésions de l'ADN de NSPC en fonction de la phase du cycle cellulaire à laquelle ils ont été irradiées. Ce procédé est aisément transposable à d'autres systèmes en vue de déterminer l'incidence d'un traitement particulier sur la progression du cycle cellulaire dans les tissus vivants.

Introduction

Au cours du développement embryonnaire du cerveau, les neurones de projection du cortex cérébral sont générés dans la zone ventriculaire, un épithélium pseudo composée de différents types de cellules neuronales souches et de cellules progénitrices (NSPC) qui tapisse les ventricules latéraux. Parmi NSPC, les cellules radiales gliales (RGC), qui servent de cellules souches neurales, subissent une migration nucléaire interkinetic (INM): ils effectuent la mitose à la surface du ventricule et de la phase S à la limite de base de la zone ventriculaire (VZ) 1, 2,3. Ils peuvent se diviser de manière symétrique à générer deux RGC ou asymétrique pour générer un RGC et un neurone ou une cellule intermédiaire progénitrices (IPC) 4, 5. IPC migrent à une couche sus-jacente en prolifération dite zone sous-ventriculaire (SVZ), où, après une dernière division symétrique ils génèrent deux neurones de projection immatures 8.6. Contrairement à RGC, l'IPC ne subissent pas l'INM (revue dans 9). Neurones nouvellement générés émigrésmangé radialement le long des fibres radiales dans la zone intermédiaire (IZ) pour atteindre leur destination finale dans la plaque corticale (CP) 10, 8. Le timing parfait de tous ces événements est essentielle pour un développement cortical correct. Par exemple, le passage de la prolifération de la différenciation des populations de cellules progénitrices neurales est contrôlée par la durée de la phase G1 11, 12. L'allongement de la phase G1 corrèle donc avec la différenciation cellulaire.

Stress génotoxique, tels que les rayonnements ionisants, le développement du cerveau sérieusement affaiblir (revue dans 13). Nous et d'autres avons montré que CNPS sont très sujettes à l'apoptose induite par le rayonnement 14, 15,16. Les rayonnements ionisants induisent cassures double brin qui sont les plus graves dommages aux cellules proliférantes. Une composante essentielle de la réponse de l'ADN de dommages (DDR) dans les cellules de cyclisme est l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire au G1 / S ou G2 / M transitions ou pendant Sphase (intra-S checkpoint) 17-21. Ils bloquent la progression du cycle cellulaire pour fournir des temps de réparation de l'ADN ou de l'élimination des cellules trop endommagés. Par conséquent, la mort cellulaire ainsi que la progression du cycle cellulaire retardée peuvent altérer le développement du cerveau en réponse à l'exposition au rayonnement ionisant de 22 à 24. Il était donc intéressant de développer une méthode pour évaluer l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire dans NSPC chez la souris irradiée cerveau embryonnaire.

La progression du cycle cellulaire est habituellement suivie en utilisant l'incorporation d'un analogue de la thymidine, la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). BrdU est incorporé au cours de la phase S du cycle cellulaire, lorsque l'ADN se réplique. L'utilisation d'un anticorps contre BrdU permet par la suite de la détection de cellules qui étaient en phase S pendant l'impulsion de BrdU.

Un nouvel analogue de la thymidine, la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EDU) est détectée par un azoture fluorescent. Les différentes façons de détecter EdU et B RDU ne cross-réagit pas 25, ce qui permet la détection simultanée de deux des analogues de la thymidine, qui est utile pour l'étude de la progression du cycle cellulaire. Habituellement cellules sont d'abord marquées avec Edu puis puisées avec BrdU, où le temps entre les deux incorporations dure deux heures 25, 26. L'addition de BrdU dans des milieux de culture contenant EdU entraîne préférentiellement incorporation de BrdU dans l'ADN, à l'exclusion de EdU, alors que l'addition simultanée de 25 EdU avec BrdU équimolaire ou équimolaire par rapport à la moitié des résultats de médias dans seulement l'incorporation de BrdU 27. Cela simplifie le protocole de marquage double en supprimant les étapes de lavage qui sont normalement requises pour éliminer la première étiquette à partir du milieu de culture avant l'addition de la deuxième étiquette. C'est également un intérêt particulier pour l'étude in vivo, où les étapes de lavage ne ​​sont pas possibles, afin de déterminer le moment précis de l'entrée ou de sortie de la population de cellules en phase S.

t "> Récemment, un procédé de marquage à double impulsion dans le cerveau de souris embryonnaire en utilisant EdU et BrdU 23, 24,22 a été développé pour analyser la progression du cycle cellulaire et l'INM de NSPC après l'irradiation in utero. En outre, il a été démontré que, lors de phase S, les cellules de souris reproduire d'abord les régions euchromatine et l'hétérochromatine alors péricentrique 28,29,30. intéressant, hétérochromatine péricentrique de chromosomes différents clusters dans les noyaux interphasiques pour former des foyers d'hétérochromatine aussi connu comme chromocentres et facilement détectable par coloration DAPI comme foyers lumineux. Par conséquent, les différentiels Edu et BrdU colorations de l'euchromatine et chromocentres nous ont aidés à analyser plus précisément la progression de la phase S du CNPS.

Cette méthode a permis la démonstration de l'absence apparente de G1 / S checkpoint dans NSCP 22-24, ce qui est assez surprenant, car ce point de contrôle est censé être critique pour la stabilité du génome. Plusieurs expconceptions de erimental basés sur diverses combinaisons d'impulsions edu et BrdU ont été utilisées pour analyser la progression du cycle cellulaire dans le télencéphale ventral et dorsal. Ici, nous donnons un exemple de protocoles permettant l'étude des dommages de l'ADN aiguë de NSPC dans le 4 premières heures suivant l'irradiation in utero d'embryons de souris E14.5.

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Protocole

1. Procédures d'animaux

Ce protocole a été conçu en conformité avec la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) et a été approuvé par notre comité institutionnel sur la protection des animaux (Cetea-CEA DSV IdF).

  1. Injections avec Edu / BrdU et l'irradiation des souris gravides de E14.5 (figure 2A).
    1. Préparer une solution de EdU à 1 mg / ml et de BrdU à 5 mg / ml dans du PBS. Effectuez une injection intra-péritonéale (IP) de 100 pi de solution edu à l'aide d'une aiguille 25 G dans des souris enceintes. 1,5 heures plus tard, les souris ont irradier (irradiation corporelle totale) à 0 Gy ou 2 Gy (0,6 Gy / min). Immédiatement après, injecter (IP) 200 pi de solution de BrdU aide d'une aiguille G 25 dans les souris enceintes.
  2. Préparation de coupes coronales de cerveau embryonnaire.
    1. À 1 h ou 4 h après l'irradiation, euthanasier les souris enceintes par le dioxyde de carbone.
    2. Ouvrez la cavi abdominaleté sur trois centimètres à l'aide de ciseaux. Séparer les deux cornes utérines du reste de l'utérus en sectionnant les deux extrémités des cornes. Transférer les cornes utérines dans une boîte de Pétri contenant du PBS 0,6% de glucose. Ouvrir les cornes utérines avec la pince afin d'isoler les embryons. Retirer le sac amniotique de chaque embryon en utilisant une pince.
    3. Disséquer têtes embryonnaires avec une pince et les fixer par immersion dans du paraformaldéhyde 4% (PFA, pH = 7,4) O / N à 4 ° C.
    4. Rincer têtes embryonnaires dans du PBS pendant au moins une nuit à 4 ° C. Les têtes peuvent être conservés dans du PBS pendant plusieurs jours.
    5. Têtes Intégrer dans la paraffine en utilisant un processeur d'infiltration sous vide comme indiqué dans le tableau 1. Chefs d'enrobage peuvent également être effectuées sous une hotte chimique pour l'éthanol et bains Xylen, puis dans une étuve à 65 ° C pour les bains de paraffine.
    6. Préparer 5 um coupes coronales d'épaisseur avec un microtome.
    7. Monter sur des lames de microscope polylysine enduit.
    8. Diapositives peuvent être conservés à température ambiante (TA) pendant plusieurs mois.

2. Edu / BrdU coloration

  1. Déparaffinage et démasquage antigénique
    1. Déparaffiner les coupes de cerveau paraffine par immersion des lames dans 3 bains de toluène pendant 5 min.
    2. Réhydrater pendant 3 min dans 2 bains de chacune des solutions de la diminution de la concentration en éthanol de la manière suivante: 100% de l'éthanol, de l'éthanol à 95%, éthanol à 70%, et 5 min dans H 2 O. Diapositives peuvent être conservés dans de l'eau déminéralisée pour plusieurs heures.
    3. Faire bouillir les tranches pendant 10 minutes dans une solution de citrate (10 mM, pH 6), puis incuber dans de l'eau désionisée pendant 5 min.
  2. EdU coloration
    1. Effectuer une détection EdU selon le protocole du fabricant. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de triton X-100 dans du PBS pendant 10 min.
    2. Préparer additif tampon 1X EdU par dilution de la solution 10X dans de l'eau désionisée. Cette solution doit être fraîchement préparé et utilisé sur la même day.
    3. Préparer EdU réaction cocktail, y compris EdU Alexa Fluor 488 azoture. Il est important d'ajouter les ingrédients dans l'ordre indiqué dans le tableau 2, sinon, la réaction ne sera pas procéder de manière optimale. Utilisez la réaction cocktail EdU dans les 15 minutes de préparation.
    4. Retirez le tampon de perméabilisation (étape 2.1.1), puis laver deux fois avec PBS.
    5. Ajouter 150 pi de EdU réaction cocktail, mettre une lamelle et incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à la température ambiante.
    6. Retirer la réaction cocktail EdU, puis laver une fois avec PBS.
  3. BrdU coloration
    1. Préparer du tampon de saturation avec 7,5% de sérum de chèvre et 7,5% de sérum fœtal bovin dans du PBS. Ajouter 150 ul de tampon de saturation sur des tranches de cerveau, mettre une lamelle couvre-objet, et incuber pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.
    2. Retirer la lamelle. Ajouter 150 pi de souris anti-BrdU anticorps primaire dilué à 1/300 dans le tampon de saturation, mettre une lamelle et incuber O /N à 4 ° C.
    3. Retirer la lamelle, puis laver 3 fois en PBS.
    4. Ajouter 150 ul d'anticorps de chèvre anti-souris-Alexa594 anticorps secondaire dilué au 1/400 dans du tampon de saturation, placer une lamelle couvre-objet, et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    5. Retirer la lamelle, puis lavez une fois dans du PBS.
    6. Coloration nucléaire: ajouter 150 ul de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 1 pg / ml dans du PBS, mettre une lamelle et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
    7. Monter les lames dans un milieu de montage.

3. Analyse

  1. Examiner des coupes de cerveau sous un microscope à fluorescence avec un objectif 20X ou un microscope confocal et acquérir des images à trois voies (488 nm, 594 nm et UV) comme sépare fichiers.
  2. Empilez les images avec le logiciel Photoshop.
  3. Analyser des coupes de cerveau dans un secteur standard de la paroi cérébrale dorsomédial. Ce secteur est de 100 um dans sa dimension médiane-latérale et est divisée en 18 bacs (ou plus) de 10 μm de hauteur dans sa dimension radiale à l'aide d'une grille superposée sur les images (figure 1) comme précédemment décrit 31.
    1. Aligner la grille tel que le premier bac est à la surface ventriculaire, avec son grand axe parallèle à la frontière ventriculaire. Numéroter la EdU marqué, BrdU et / ou noyaux pycnotiques (correspondant à noyaux apoptotiques) dans chaque bac. Compter un noyau situé sur la limite de deux bacs dans le bac qui contient sa plus grande partie, ou dans le bac inférieur, lorsque le noyau occupe des aires égales dans les deux bacs.
  4. L'analyse statistique.

Analyser au moins deux tranches de cortex par embryon. Répétez expériences sur au moins 3 embryons de différentes portées. Les résultats doivent être données en tant que moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Les analyses statistiques sont effectuées avec Graphpad Prism utilisant ANOVA à deux voies et de multiples tests de comparaison POSTHOC Bonferroni.

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Résultats

Dans l'expérience décrite dans la figure 2, on a administré EdU 1,5 h avant l'irradiation et la BrdU juste après l'irradiation. Quatre types de cellules ont ensuite été distingués dans les tranches de cortex préparés en 1 ou 4 heures après l'irradiation, selon la constitution de l'une ou EdU BrdU, les deux ou aucun (Figures 2A et 2B). Surtout, ni EdU ni l'incorporation de BrdU changé le niveau d'apoptose radio-induite (données non présentées)...

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Discussion

Le dispositif expérimental décrit ici sur la base de l'incorporation de EdU 1,5 heure avant l'irradiation et l'incorporation de BrdU immédiatement après irradiation a permis la démonstration que NSPCs sont capables d'activer S et G2 / M points de contrôle, mais pas au point de contrôle G1 / S au cours de la 1 ère heure après un stress génotoxique dans le cerveau de fœtus de souris. Nous avons effectué d'autres expériences dans lesquelles Edu a été injecté à différents temps après l'irr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont pas de conflit d'intérêt.

Remerciements

Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du financement du septième programme-cadre de l'Union européenne (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° 323267, d'Électricité de France (EDF) et de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
MicrotomeLeicaRM 2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488 kit d’imagerieLife TechnologiesC10083
Anti-BrdUGE HealthcareRPN2021/300
Chèvre anti souris-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
Lame polysinusThermo scientificJ2800AMNZ
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPIMicroscope Sigma-AldrichD9542
BX51Olympus
Microscope confocal SPELeica
Prism logicielGraphpadVersion 5.0c
Logiciel PhotoshopAdobe

Références

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