Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique

Résumé

L'administration de deux analogues de la thymidine, et EdU BrdU, dans des souris gravides permet l'analyse de la progression du cycle cellulaire dans les neurones et les cellules progénitrices dans le cerveau de souris embryonnaire. Cette méthode est utile pour déterminer les effets du stress génotoxique, y compris les rayonnements ionisants, au cours du développement du cerveau.

Résumé

Les neurones du cortex cérébral sont générées lors du développement du cerveau à partir de différents types de cellules souches et progénitrices neurales (CNPS), qui forment un épithélium pseudo tapisse les ventricules latéraux du cerveau embryonnaire. Stress génotoxiques, tels que les rayonnements ionisants, ont des effets très néfastes sur le développement du cerveau liée à la grande sensibilité de la NSPC. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dépend de la caractérisation de la réponse aux dommages de l'ADN de ces types particuliers de cellules, ce qui nécessite une méthode précise pour déterminer la progression NSPC à travers le cycle cellulaire dans les tissus endommagés. Ici on trouve une méthode basée sur des injections intrapéritonéales successives de EdU et BrdU chez les souris enceintes et en outre la détection de ces deux analogues de la thymidine en coupes coronales du cerveau embryonnaire. EdU BrdU et sont tous les deux incorporés dans l'ADN pendant la replication des cellules en phase S et sont détectés par deux techniques différentes (azide ouun anticorps spécifique, respectivement), ce qui facilite leur détection simultanée. EdU BrdU et la coloration sont ensuite déterminés pour chaque noyau NSPC en fonction de sa distance à partir de la marge ventriculaire dans une région standard du télencéphale dorsal. Ainsi, cette technique de double marquage permet de distinguer les cellules qui ont progressé à travers le cycle cellulaire à partir de ceux qui ont activé un point de contrôle du cycle cellulaire, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire en réponse à des dommages à l'ADN.

Un exemple d'expérience est présentée, dans laquelle Edu a été injectée avant l'irradiation et BrdU immédiatement après et les analyses effectuées dans le 4 h après l'irradiation. Ce protocole fournit une analyse précise de la réponse aiguë de lésions de l'ADN de NSPC en fonction de la phase du cycle cellulaire à laquelle ils ont été irradiées. Ce procédé est aisément transposable à d'autres systèmes en vue de déterminer l'incidence d'un traitement particulier sur la progression du cycle cellulaire dans les tissus vivants.

Introduction

Au cours du développement embryonnaire du cerveau, les neurones de projection du cortex cérébral sont générés dans la zone ventriculaire, un épithélium pseudo composée de différents types de cellules neuronales souches et de cellules progénitrices (NSPC) qui tapisse les ventricules latéraux. Parmi NSPC, les cellules radiales gliales (RGC), qui servent de cellules souches neurales, subissent une migration nucléaire interkinetic (INM): ils effectuent la mitose à la surface du ventricule et de la phase S à la limite de base de la zone ventriculaire (VZ) ^{1, 2,3.} Ils peuvent se diviser de manière symétrique à générer deux RGC ou asymétrique pour générer un RGC ....

Protocole

1. Procédures d'animaux

Ce protocole a été conçu en conformité avec la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) et a été approuvé par notre comité institutionnel sur la protection des animaux (Cetea-CEA DSV IdF).

1. Injections avec Edu / BrdU et l'irradiation des souris gravides de E14.5 (figure 2A).
   1. Préparer une solution de EdU à 1 mg / ml et de BrdU à 5 mg / ml dans du PBS. Effectuez une injection intra-péritonéale (IP) de 100 pi de solution edu à l'aide d'une aiguille 25 G dans des souris enceintes. 1,5 heures plus tard, les souris ont irradier (....

Résultats

Dans l'expérience décrite dans la figure 2, on a administré EdU 1,5 h avant l'irradiation et la BrdU juste après l'irradiation. Quatre types de cellules ont ensuite été distingués dans les tranches de cortex préparés en 1 ou 4 heures après l'irradiation, selon la constitution de l'une ou EdU BrdU, les deux ou aucun (Figures 2A et 2B). Surtout, ni EdU ni l'incorporation de BrdU changé le niveau d'apoptose radio-induite (données non présentées). En outre, les méthodes de .......

Discussion

Le dispositif expérimental décrit ici sur la base de l'incorporation de EdU 1,5 heure avant l'irradiation et l'incorporation de BrdU immédiatement après irradiation a permis la démonstration que NSPCs sont capables d'activer S et G2 / M points de contrôle, mais pas au point de contrôle G1 / S au cours de la 1 ^ère heure après un stress génotoxique dans le cerveau de fœtus de souris. Nous avons effectué d'autres expériences dans lesquelles Edu a été injecté à différents temps après l'irr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 kit d’imagerie	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Chèvre anti souris-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Lame polysinus	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Microscope Sigma-Aldrich	D9542
BX51	Olympus
Microscope confocal SPE	Leica
Prism logiciel	Graphpad		Version 5.0c
Logiciel Photoshop	Adobe