Caractérisation des systèmes complexes à l'aide de la conception des expériences approche: l'expression transitoire de protéines dans le tabac comme une étude de cas

Summary

Nous décrivons une conception de l'approche des expériences qui peuvent être utilisés pour déterminer et modéliser l'influence des éléments de régulation du transgène, les paramètres de croissance et de développement des plantes, et des conditions d'incubation sur l'expression transitoire des anticorps monoclonaux et des protéines rapporteurs dans les plantes.

Abstract

Les plantes apportent de multiples avantages pour la production de produits biopharmaceutiques, y compris de faibles coûts, l'évolutivité et la sécurité. L'expression transitoire offre l'avantage supplémentaire de développement à court et temps de production, mais les niveaux d'expression peut varier considérablement entre les lots donnant ainsi naissance à des préoccupations d'ordre réglementaire dans le cadre de bonnes pratiques de fabrication. Nous avons utilisé un plan d'expériences (DoE) approche pour déterminer l'impact des principaux facteurs tels que des éléments de régulation dans la construction d'expression, la croissance des plantes et les paramètres de développement, et les conditions d'incubation pendant expression, sur la variabilité d'expression entre les lots. Nous avons testé des plantes exprimant un anticorps anti-VIH modèle monoclonal (2G12) et une protéine marqueur fluorescent (DsRed). Nous discutons de la justification du choix des propriétés du modèle et identifier ses limites éventuelles. L'approche générale peut facilement être transférée à d'autres problèmes parce que les principes du modèle dere largement applicable: le choix des paramètres de la connaissance, la réduction de la complexité en divisant le problème initial en petits modules, configuration logicielle guidée de combinaisons optimales d'expérimentation et par étapes de conception augmentation. Par conséquent, la méthode n'est pas seulement utile pour caractériser l'expression des protéines dans les plantes mais aussi pour l'étude d'autres systèmes complexes qui n'ont pas une description mécaniste. Les équations de prédiction décrivant l'interconnectivité entre les paramètres peuvent être utilisés pour établir des modèles mécanistes pour d'autres systèmes complexes.

Introduction

La production de protéines biopharmaceutiques dans les plantes est avantageux parce que les plantes sont peu coûteux à développer, la plate-forme peut être étendu simplement en cultivant plus de plantes, et les agents pathogènes humains sont incapables de se répliquer ^1,2. Stratégies d'expression transitoire sur la base par exemple sur l'infiltration des feuilles avec Agrobacterium tumefaciens offre des avantages supplémentaires parce que le temps entre le point de livraison de l'ADN et la livraison d'un produit purifié est réduite de quelques années à moins de 2 mois ^3. L'expression transitoire est également utilisée pour l'analyse fon....

Protocol

Une. Planification d'une stratégie DoE

1. Identifier les facteurs et les réponses pertinentes à inclure dans la conception.
   1. Définir une ou plusieurs réponses pour la mesure. Ici, les taux d'expression 2G12 et DsRed ont été utilisés (pg / ml), notamment la différence minimale détectable considéré comme (10 et 20 pg / ml, respectivement) concernés et une valeur approchée de l'écart type estimé du système (4 et 8 pg / ml, respectivement) sur la base des expériences précédentes.
   2. Utilisez la littérature disponible, les données provenant d'expériences antérieures ou conceptions spécialisées de sélection (par exemple, un plan factoriel, v....

Results

Un modèle descriptif de l'accumulation DsRed lors de l'expression transitoire en utilisant différents promoteurs et 5'UTR

DsRed fluorescence dans des extraits de feuilles a été utilisé pour indiquer le niveau de la protéine recombinante d'expression et, par conséquent a été utilisé en tant que réponse à la stratégie DoE. La différence minimale détectable nous avons considéré pertinent était de 20 pg / ml et l'écart type estimé du système était de 8 pg / ml sur la base des ex.......

Discussion

Chaque expérience nécessite une planification minutieuse, car les ressources sont souvent rares et chers. Cela est particulièrement vrai pour les stratégies DoE car les erreurs au cours de la phase de planification (par exemple, la sélection d'un modèle de base qui ne couvre pas toutes les interactions de facteurs importants) peuvent sensiblement diminuer le pouvoir prédictif des modèles issus et donc dévaluer toute l'expérience. Cependant, ces erreurs peuvent être facilement évitées en suivant les proc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE
software Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Composant du milieu
Extrait de levure	Carl Roth GmbH	2363.2	Composant du milieu
Chlorure de sodium	Carl Roth GmbH	P029.2	Composant du milieu
Ampicilline	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotique
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Composant du milieu
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Micro-organisme
pPAM	GenBank	AY027531	Vecteur de clonage/expression ;   ;
Plasmide NucleoSpin  ;	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Kit d’isolement de l’ADN plasmidique
NucleoSpin Gel et nettoyage PCR	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Kit de purification de l’ADN plasmidique
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.Spectrophotomètre
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonucléase
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonucléase
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonucléase
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictiontampon d’endonucléase
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Composant du milieu
Tétraborate disodique	Carl Roth GmbH	4403.3	Composant du support
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Composant du support
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Composant du milieu
Bleu de bromophénol	Carl Roth GmbH	A512.1	Indicateur de couleur
Xylène cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Indicateur de couleur
Glycérol	Carl Roth GmbH	7530.2	Composant multimédia
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Chambre d’électrophorèse sur gel
Agrobacterium tumefaciens souche GV3101 :pMP90RK	DSMZ	12365	Micro-organisme
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Extrait de bœuf	Carl Roth GmbH	X975.2	Composant multimédia
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Composant multimédia
Saccharose	Carl Roth GmbH	4621.2	Composant multimédia
Sulfate de magnésium	Carl Roth GmbH	0261.3	Composant multimédia
Carbenicilline	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotique
Kanamycine	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotique
Rifampicine	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotique
FWD	primer Eurofins MWG Operon	n.a.CCT	CAG GAA GAG CAA TAC
REV PRIMER	Eurofins MWG Operon	n.a.CCA	AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermocycleur	Applied Biosystems	4359659	Thermocycleur
RNAfold webserver	Université de Vienne	n.a.Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Engrais
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.Bloc	de laine de roche
Serre	n.a.n.a.Pour		la culture des plantes
Phytotron	Ilka Zell	n.a.Pour	la culture des plantes
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Seringue
Sels de Murashige et Skoog	Duchefa	M 0222.0010	Composant du milieu
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Composant du milieu
Acétosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Analogon
du Phytohormon  ; BioPhotomètre plus	Eppendorf	6132 000.008	Photomètre
Osram blanc froid 36 W	Osram	4930440	Source lumineuse
Phosphate disodique	Carl Roth GmbH	4984.3	Composant de média
Centrifugeuse 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifugeuse
Forma -86C Congélateur ULT	ThermoFisher	88400	Congélateur
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Lecteur de plaques de fluorescence
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.SPR	dispositif
Protein A	Life Technologies	10-1006	Protéine de liaison aux anticorps
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Composant multimédia
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Composant multimédia
2G12 anticorps	Polymun	AB002	Anticorps de référence