Surveillance de l’assemblage d’un facteur de virulence bactérienne sécrété à l’aide d’une réticulation spécifique au site

Résumé

Cet article illustre l’utilisation du marquage radio par chasse d’impulsions en combinaison avec la photoréticulation spécifique au site pour surveiller les interactions entre une protéine d’intérêt et d’autres facteurs chez E. coli. Contrairement aux méthodes traditionnelles de réticulation chimique, cette approche génère des « instantanés » à haute résolution d’une voie d’assemblage ordonnée dans une cellule vivante.

Résumé

Cet article décrit une méthode pour détecter et analyser les interactions dynamiques entre une protéine d’intérêt et d’autres facteurs in vivo. Notre méthode est basée sur la technologie de suppression de l’ambre qui a été développée à l’origine par Peter Schultz et ses collègues¹. Une mutation ambrée est d’abord introduite au niveau d’un codon spécifique du gène codant pour la protéine d’intérêt. Le mutant ambré est ensuite exprimé dans E. coli avec des gènes codant pour un ARNt suppresseur d’ambre et une aminoacyle-ARNt synthétase dérivée de Methanococcus jannaschii. À l’aide de ce système, l’analogue de l’acide aminé photo-activable p-benzoylphénylalanine (Bpa) est incorporé au codon ambré. Les cellules sont ensuite irradiées avec de la lumière ultraviolette pour lier de manière covalente le résidu Bpa à des protéines situées entre 3 et 8 Å. La photoréticulation est réalisée en combinaison avec le marquage par pulse-chase et l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt afin de surveiller les changements dans les interactions protéine-protéine qui se produisent sur une échelle de temps de quelques secondes à quelques minutes. Nous avons optimisé la procédure pour étudier l’assemblage d’un facteur de virulence bactérienne composé de deux domaines indépendants, un domaine intégré dans la membrane externe et un domaine transloqué dans l’espace extracellulaire, mais la méthode peut être utilisée pour étudier de nombreux processus d’assemblage et voies biologiques différents dans les cellules procaryotes et eucaryotes. En principe, les facteurs d’interaction et même les résidus spécifiques de facteurs d’interaction qui se lient à une protéine d’intérêt peuvent être identifiés par spectrométrie de masse.

Introduction

Il est souvent essentiel d’identifier et de caractériser les interactions entre une protéine d’intérêt et d’autres composants cellulaires pour définir son rôle dans une voie biologique, pour comprendre son assemblage, ou pour élucider son mécanisme d’action. Une grande variété d’approches sont couramment utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine, mais toutes ont leurs limites. La méthode la plus simple et non biaisée pour identifier les protéines qui se lient à une protéine d’intérêt est la copurification (ou co-immunoprécipitation), mais cette approche nécessite qu’un complexe protéique reste intact pendant la procédure de purification. Les interactions protéiques faibles ou transitoires peuvent être stabilisées par réticulation chimique, mais cette méthode nécessite généralement l’utilisation de composés qui lient les protéines par le biais d’amines primaires largement dispersées dans la séquence protéique. Des motifs de réticulation complexes et difficiles à interpréter peuvent être générés, en particulier lorsque les protéines d’intérêt sont des composants de complexes multiprotéiques. De plus, comme les bras d’espacement des réticulants chimiques dépassent généralement 10 Å de longueur, des liaisons covalentes peuvent se former avec des protéines situées à proximité de la protéine d’intérêt, mais qui n’interagissent pas directement avec elle. Des méthodes telles que la chromatographie d’affinité et les cribles à deux hybrides sont également souvent utiles pour identifier les interactions protéine-protéine. La première approche, cependant, nécessite de reproduire des conditions qui favorisent des interactions physiologiquement significatives et ne peut pas être utilisée pour détecter des interactions faibles. Cette dernière approche exige que les interactions de liaison puissent être répliquées dans l’organisme hôte et soient maintenues lorsqu’une protéine d’intérêt et ses partenaires de liaison sont placés dans le contexte d’une protéine de fusion. Les méthodes à deux hybrides ont également tendance à générer des résultats faussement positifs². Une fois qu’une interaction protéine-protéine a été établie, un travail considérable est souvent nécessaire pour cartographier le site de l’interaction. L’inconvénient le plus important des approches traditionnelles est peut-être qu’elles ne fournissent aucune information sur la séquence temporelle des interactions intermoléculaires ou la cinétique de liaison.

Cet article décrit une méthode simple qui permet de surmonter certaines des limites des autres approches utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine. Initialement, une seule mutation ambrée est introduite dans le gène qui code pour une protéine d’intérêt. Le mutant ambré est ensuite coexprimé avec un ARNt suppresseur d’ambre et une aminoacyl-ARNt synthétase dérivée de Methanococcus jannaschii qui ont été modifiés pour incorporer l’analogue d’acide aminé photoactivable p-benzoylphénylalanine (Bpa) uniquement aux codons ambrés³. L’irradiation de cellules avec une lumière ultraviolette (UV) de grande longueur d’onde (~365 nm) facilite alors la formation d’une liaison covalente entre Bpa et les protéines qui se trouvent dans ~3-8 Å^4,5. Dans certains contextes expérimentaux, des réticulations peuvent également se former entre le Bpa activé et les composants non protéiques des cellules tels que les lipides et les acides nucléiques⁶. Les molécules qui se terminent au niveau du codon ambré doivent généralement être facilement distinguables de la protéine pleine longueur sur SDS-PAGE et ne peuvent pas être réticulées à d’autres protéines. En soumettant les cellules à un radiomarquage pulsé-poursuite avant la réticulation, puis à des produits d’immunoprécipitation ou de purification d’affinité, la séquence et la durée des interactions protéine-protéine peuvent être établies. La capacité de générer des informations temporelles sur les interactions intermoléculaires est particulièrement précieuse pour étudier la progression d’une protéine d’intérêt à travers n’importe quelle voie ordonnée d’assemblage, de trafic ou de signalisation en plusieurs étapes et pour identifier les intermédiaires de voie. À l’instar de la réticulation chimique, la réticulation spécifique au site détecte les interactions protéine-protéine qui se produisent dans des conditions physiologiques, mais l’introduction d’un réticulant à une seule position facilite l’analyse des interactions entre les segments individuels d’une protéine et d’autres facteurs. Cette caractéristique unique de la réticulation spécifique au site est particulièrement avantageuse lorsque la protéine d’intérêt comporte plusieurs segments ou domaines qui ont le potentiel d’interagir avec des partenaires de liaison distincts. De plus, la réticulation spécifique au site peut être utilisée en combinaison avec des méthodes telles que la spectrométrie de masse pour cartographier avec précision les résidus qui médient les interactions protéine-protéine. Bien que cette méthode soit optimisée pour une utilisation chez E. coli, l’incorporation d’analogues d’acides aminés photactivatables dans les protéines par suppression de l’ambre a été signalée dans des cellules de mycobactéries, de levures et de mammifères^7-11. Ainsi, en principe, notre méthode peut être utilisée dans d’autres systèmes.

Nous avons largement utilisé cette méthode pour identifier les interactions intermoléculaires qui facilitent la biogenèse de l’EspP, un facteur de virulence d’E. coli O157 :H7. EspP est membre d’une superfamille de protéines connues sous le nom d'« autotransporteurs » qui contiennent un grand domaine extracellulaire N-terminal (« domaine passager ») et un domaine aC-terminal (« domaine b ») qui se replie en une structure cylindrique b et ancre la protéine à la membrane externe (MO⁾¹². Le mécanisme par lequel le domaine des passagers est transloqué à travers le MO est un mystère de longue date. Comme toutes les protéines de surface des cellules bactériennes, l’EspP doit être transportée à travers la membrane interne, transportée à travers le périplasme (l’espace entre les membranes interne et externe) et ciblée sur la MO dans une série d’événements ordonnés. Suite à sa translocation à travers la MO, le domaine passager EspP est également séparé du domaine b par un clivage protéolytique et libéré de la surface cellulaire. En combinant la réticulation spécifique du site avec le radiomarquage par chasse d’impulsions, nous avons montré que les deux domaines de la protéine interagissent initialement avec le chaperon moléculaire Skp dans le périplasme⁶. Par la suite, des segments discrets du domaine b interagissent de manière stéréospécifique avec les composants d’un hétérooligomère appelé complexe Bam, qui catalyse l’intégration des protéines b barrel dans la MO bactérienne par un mécanisme inconnu. Peut-être le plus intéressant, nous avons découvert que le domaine des passagers est en contact avec l’une des sous-unités du complexe Bam (BamA) lorsqu’il traverse l’OM¹³. Nos résultats nous ont permis de construire un modèle détaillé pour l’assemblage de l’autotransporteur¹⁴ et ont impliqué le complexe Bam dans le transport du domaine des passagers à travers la MO.

Protocole

1. Construction du plasmide

1. Après avoir cloné un gène qui code pour une protéine d’intérêt dans un vecteur d’expression approprié, introduisez des mutations ambrées aux endroits souhaités à l’aide d’un kit de mutagenèse dirigée.
   REMARQUE : Les informations structurelles et les prévisions d’exposition à la surface peuvent servir de guides utiles pour déterminer les positions des mutations. Étant donné que l’efficacité de la suppression de l’ambre et de la réticulation peut varier considérablement, les mutations de l’ambre doivent être introduites à plusieurs positions. De plus, comme Bpa est un analogue de la tyrosine et de la phénylalanine, essayez d’introduire des mutations ambrées à des positions qui codent normalement pour de grands acides aminés hydrophobes afin de minimiser les perturbations de la structure et de la fonction des protéines. Enfin, lors du choix d’un vecteur d’expression, gardez à l’esprit que la surproduction d’une protéine d’intérêt à un niveau très élevé peut limiter l’efficacité de l’incorporation de Bpa.

2. Préparation de la culture

1. Utiliser l’électroporation pour transformer une souche appropriée d’E. coli avec un plasmide qui code pour le système de suppression de l’ambre (pDULE-p Bpa ; voir référence⁴) et un plasmide compatible qui code pour la protéine d’intérêt avec une mutation ambrée.
2. Cellules sur plaque sur gélose LB contenant des antibiotiques appropriés (utiliser 5 μg/ml de tétracycline pour sélectionner la pDULE-p Bpa). Incuber les plaques O/N à 37 °C.
3. Le lendemain, commencer les cultures O/N à partir de colonies uniques dans 3 à 5 ml de milieu^{M9 14} contenant 0,2 % de glycérol, tous les acides aminés L sauf la méthionine et la cystéine (40 μg/ml) et des antibiotiques. Incuber à 37 °C.
4. Le lendemain, centrifuger les cultures O/N à 2 500 x g pendant 5 min à RT pour couper les cellules. Remettre les cellules en suspension dans 5 ml de milieu frais M9 et répéter la centrifugation.
   REMARQUE : Cette étape de lavage est essentielle pour maintenir les plasmides qui codent pour la résistance à l’ampicilline, car de petites quantités de b lactamase présentes dans le milieu à partir de cultures O/N dégradent l’ampicilline fraîchement ajoutée avant qu’une croissance cellulaire significative ne se produise.
5. Remettre les cellules en suspension dans 2 ml de milieu frais et mesurer la concentration cellulaire dans un spectrophotomètre (OD₅₅₀).
6. Ajouter des cellules dans un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu M9 et des antibiotiques à₅₅₀ ² = 0,03. Incuber les cultures à 37 °C dans un bain d’eau agitante.

3. Incorporation de Bpa et préparation pour la photoréticulation

REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous est pour un exemple de parcours temporel qui comporte trois points temporels (0, 1 et 5 min). Ajustez les volumes en conséquence si vous souhaitez un nombre différent de points temporels. Un aperçu de la procédure est illustré à la figure 1.

1. Pendant que les cultures sont en croissance, préparez une solution fraîche de 1 M (1 000x) de Bpa dans 1 M de NaOH (27 mg de Bpa dans 100 μl de 1 M de NaOH). Utilisez un tube à paroi sombre pour garder la solution dans l’obscurité.
2. Lorsque les cultures atteignent la phase précoce ou moyenne logarithmique (DO₅₅₀ = 0,2), ajoutez 50 μl 1 M Bpa à chaque culture. Ajouter le Bpa une goutte à la fois tout en remuant le ballon pour éviter les précipitations. Ensuite, ajoutez tous les inducteurs nécessaires à l’expression du mutant ambré. Continuez à incuber les cultures à 37 °C pendant 30 minutes supplémentaires.
3. Pendant la période d’induction de 30 minutes, étiquetez six tubes à centrifuger jetables de 15 ml avec le point de temps (0 min, 1 min, 5 min) et « + UV » ou « - UV ». Placez les tubes sur de la glace.
4. Remplissez un deuxième seau à glace de glace et placez une plaque de culture tissulaire à 6 puits sur la glace.
5. Décongeler la ³⁵S-méthionine et la ³⁵S-cystéine à haute activité spécifique (1 000 mCi/mmol) (ou un mélange préfabriqué des deux composés) pour le marquage par impulsion et préparer (ou décongeler) une solution de L-cystéine et de L-méthionine non radioactives (100 mM chacune) pour la poursuite.
6. Allumez la lampe UV cinq minutes avant le radiomarquage.
   REMARQUE : La lampe doit être réglable de manière à pouvoir être positionnée à ~3-4 cm des échantillons dans la plaque multipuits.
7. Ajoutez de la glace (~2 ml) à chaque tube étiqueté « - UV » et à deux des puits de la plaque multipuits.
   REMARQUE : La glace doit être ajoutée à un troisième puits immédiatement avant le point de temps de 5 minutes. Il est essentiel de placer de la glace directement dans les tubes et les puits pour arrêter immédiatement les réactions intracellulaires à chaque point temporel et ainsi obtenir des « instantanés » précis d’une voie biochimique spécifique.
8. À la fin de la période d’induction de 30 minutes, transvaser 25 ml de la culture dans un erlenmeyer jetable préchauffé de 125 ml. Placez le ballon dans le bain-marie agitateur à 37 °C.

4. Marquage par chasse d’impulsions et irradiation UV

REMARQUE : Le protocole de marquage par chasse d’impulsions et d’irradiation UV comporte de nombreuses étapes qui doivent être effectuées en temps opportun et qui nécessitent une organisation considérable et une préparation préalable. Tous les réactifs et les tubes doivent être facilement accessibles. Un protocole pour une expérience qui comporte des points de temps de 0, 1 et 5 minutes est présenté ci-dessous.

1. À l’instant 0:00 (min :sec), transférez 25 ml de culture dans une fiole de 125 ml.
2. À l’instant 0:30, ajouter 30 μCi/ml d’acides aminés radioactifs ; agiter rapidement pour mélanger. Placez le ballon dans le bain-marie agitateur à 37 °C.
3. À l’heure 1:00, ajouter 250 μl de la solution de méthionine-cystéine de 100 mM ; agiter rapidement pour mélanger.
   1. Pipeter immédiatement 4 ml de la culture dans l’un des puits de la plaque multipuits réfrigérée qui contient de la glace. Pipeter une deuxième aliquote de 4 ml dans le tube de 15 ml étiqueté « 0 min - UV ». Remettez la fiole dans le bain-marie.
4. À l’heure 2:00, pipeter 4 ml de la culture dans le deuxième puits de la plaque multipuits réfrigérée qui contient de la glace. Pipeter une autre aliquote de 4 ml dans le tube de 15 ml étiqueté « 1 min - UV ». Remettre le ballon dans le bain-marie.
5. À l’heure 6:00, pipeter 4 ml de la culture dans le troisième puits de la plaque multipuits réfrigérée qui contient de la glace. Pipeter une autre aliquote de 4 ml dans le tube de 15 ml étiqueté « 5 min - UV ».
6. Placez le seau à glace avec la plaque multipuits sous la lampe UV préchauffée et irradiez chaque échantillon individuellement pendant 4 min
   REMARQUE : Dans les expériences où les points temporels sont espacés d’au moins 4 minutes, chaque échantillon doit être irradié dès qu’il est pipeté dans la plaque multipuits.
7. Transférez les cellules dans les tubes réfrigérés de 15 ml étiquetés « 0 min +UV », 1 min + UV », etc.
8. Cellules de centrifugation à 2 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
9. Remettre chaque échantillon en suspension dans un milieu M9 de 300 μl ou PBS et ajouter 33 μl d’acide trichloracétique (TCA) froid à 100 % pour précipiter les protéines. Centrifugez les précipitations de TCA dans un microfuge à vitesse maximale pendant 10 min et retirez le surnageant. À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à - 20 °C.

5. Immunoprécipitation et détection de produits de réticulation

1. Ajouter 50 μl de tampon de solubilisation (15 % de glycérol, 200 mM de Trisbase, 15 mM d’EDTA, 4 % de SDS, 2 mM de PMSF) à chaque échantillon et chauffer en agitant à 95 °C pendant 5 min pour solubiliser la protéine précipitée.
2. Ajouter 1 ml de tampon de dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0 % Igepal CA-630, 0,5 % de désoxycholate, 0,1 % de SDS) et effectuer des immunoprécipitations standard¹⁵ en utilisant un cinquième à la moitié de chaque échantillon.
   REMARQUE : L’Igepal CA-630 (octylphényl-polyéthylène glycol) est utilisé à la place du NP-40, qui n’est plus disponible dans le commerce. Les deux composés sont chimiquement indiscernables.
3. Résoudre les protéines immunoprécipitées par SDS-PAGE. Teindre, décolorer et sécher les gels.
4. Exposer les gels à un écran au phosphore O/N et détecter les protéines radioactives (y compris les produits de réticulation) à l’aide d’un imageur phosphoreux.

Résultats

Nous avons utilisé la photoréticulation spécifique au site pour identifier les protéines qui interagissent avec l’EspP pendant son voyage vers la MO. Dans les expériences qui sont montrées ici, les codons de phénylalanine aux résidus 1113 et 1214 ont été remplacés par des codons ambrés. Les deux positions sont situées dans le bdomain, qui s’intègre dans le MO et sert d’ancrage membranaire. La structure cristalline du domaine EspPβ¹⁶ montre que les deux résidus se trouvent du côté périplasmique du canon b mais ...

Discussion

Cet article décrit une méthode qui combine la photoréticulation spécifique au site avec le marquage par chasse d’impulsions pour examiner la dynamique des interactions entre une protéine d’intérêt et d’autres composants d’une cellule vivante. La méthode est particulièrement utile pour étudier les processus en plusieurs étapes dans lesquels la protéine interagit séquentiellement avec d’autres facteurs. Contrairement aux approches traditionnelles de réticulation chimique, la photoréticulation spécifique au site fournit des...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de mutagénèse dirigée par site QuikChange II	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, réactif de marquage métabolique (35S-L-méthionine et 35S-L-cystéine, >1 000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P Lampe UV à très haute intensité, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Spectroline Ampoule de remplacement 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Falcon Plaque de culture tissulaire, 6 puits	Becton Dickinson Matériel	de laboratoire 353046
Jetable 125 ml Erlenmeyer Erlenmeyer	Corning	430421
Innova 3100 bain-marie à secouer	Nouveau Brunswick Scientific	n.a.