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Article de méthode

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

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DOI :

10.3791/51218

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27 janvier 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Dans cet article

Résumé

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Résumé

Sensibilisation de l'adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l'activité AC, alors que l'activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l'AC et l'augmentation des niveaux d'AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l'activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D 2 et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l'AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l'AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l'AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l'AC, le développement et la validation d'un dosage de l'AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d'une méthodologie complexe pour mesurer l'accumulation d'AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d'un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L'utilisation de deux modèles cellulaires D 2 de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D 2L et HEK-AC6 / D 2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (> 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l'essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d'une banque de siRNA ciblés.

Introduction

Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance 1. En plus de l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l'activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés 2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont associés à la douleur, les troubles neuropsychiatriques et neurologiques, et comprennent μ / κ des opioïdes, D 2/4 de la dopamine, 5HT 1A, et M 2/4 2 récepteurs muscariniques. En plus des découvertes du Dr Nirenberg, un grand nombre de preuves existe reliant sensibilisation de signalisation AC à l'activation du récepteur opioïde chronique à la fois in vitro et in vivo 3-7. Sensibilisation des AC a également été associée à une variété de maladies impliquant les récepteurs dopaminergiques D 2 et telles que la schizophrénie y compris la maladie de Parkinson (pour une revue voir référence 2). Malgré l'importance potentielle de la sensibilisation, le mécanisme (s) précis associé avec / activation persistante Gai o-récepteur couplé qui conduit à une réactivité accrue AC reste en grande partie inconnue.

Ces études fournissent la justification de l'examen des mécanismes de sensibilisation de l'adénylyl cyclase comme une cible neurobiologique importante. De même, la pertinence physiologique de signalisation AC 8 et l'importance que les isoformes de CA individuels détiennent dans cette réponse adaptative devraient aussi être reconnus 2,9,10. Dans le cadre de notre recherche, les caractéristiques générales associées à la sensibilisation hétérologue des isoformes recombinantes de AC parallèle les caractéristiques described pour étudier les isoformes endogènes de l'AC. Plus précisément, des recherches antérieures ont montré que l'activation de Gai / o protéines et les sous-unités de la suite de presse / réarrangement sont des conditions importantes pour récepteur induite par la sensibilisation de toutes les isoformes AC. En outre, plusieurs études suggèrent que la signalisation de protéines kinases et des sous-unités Gßy sont impliqués dans la sensibilisation 2,11-13. CA individuels présentent également des motifs uniques et distincts de sensibilisation 12. Par exemple, l'exposition persistante des récepteurs D 2 agonistes est associée à une sensibilisation de AC1 et AC8 de Ca2 + stimulation / calmoduline 14,15, tandis que l'AC3 étroitement liée n'est pas sensibilisé 2. AC2, AC4, et AC7 sont étroitement liés, cependant, que l'activité de la PKC-AC2 stimulée est robuste sensibilisés après une exposition prolongée de D 2 récepteurs agonistes 7,14,16,17. En outre, AC5 et AC6 montrent un degré marqué de hetersensibilisation ologous à gaz et stimulée par la forskoline accumulation d'AMPc suite à l'activation de récepteurs D 2 14,18-20, mais semblent différer dans leur exigence de la sous-unité Gßy AC interactions 21. Bien que la plupart des études de sensibilisation AC ont utilisé des lignées de cellules modèles (par exemple des cellules HEK293 exprimant les isoformes individuelles AC), il apparaît que ces résultats traduisent par des modèles de cellules neuronales natives 4,22. Plus récemment, les effets des inhibiteurs sélectifs des isoformes de petites molécules identifiées AC dans les cellules HEK293 exprimant isoformes AC peuvent également être convertis en études comportementales in vivo 23.

L'absence d'un mécanisme moléculaire identifié pour la sensibilisation hétérologue reflète probablement la complexité de la réponse adaptative aussi bien que les propriétés uniques de la régulation individuelle des isoformes AC 12. Démêler une telle complexité est encore compliquée par l'utilisation de la méthodologie lourde tchapeau a limité chercheurs universitaires d'employer des approches impartiales. Par exemple, nos études mécanistiques précédentes impliquaient l'utilisation de modèles cellulaires cultivées en continu en utilisant 24 - et 48-bien le format de culture tissulaire 15. Les cellules cultivées ont été généralement cultivées pendant 48 h et ensuite soumis à un traitement médicamenteux agoniste (2-18 h), suivie par une série de lavages et d'incubations de cellules (figure 1). Protocoles d'accumulation d'AMPc spécifique AC-isoformes ont ensuite été utilisée suivie par la mesure de l'accumulation d'AMPc en utilisant une laborieuse et longue [3 H] AMPc méthodologie 15,24 liaison. La durée de bout en bout pour chaque dosage généralement nécessaire d'un total de quatre à cinq jours à partir de la cellule de placage à l'analyse de données (figure 1). L'application de nouvelles technologies et l'automatisation a conduit à des améliorations marquées pour les études de sensibilisation dans le milieu industriel et centre de HTS. Par exemple, un groupe de travail avec le Centre national pour Chemical génomique a rapporté deux jours une HTS procédure de dosage pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de récepteur opioïde μ sensibilisation induite en format 1536 puits 25.

Le présent article décrit nos efforts pour développer un test HTS pour les études de sensibilisation hétérologue utilisant des technologies qui sont disponibles à la plupart des institutions de recherche universitaires. Cette stratégie a été accompli en incorporant l'utilisation de cellules congelées à partir des modèles de cellules exprimant de manière hétérologue au récepteur de la dopamine D 2, en combinaison avec les isoformes de l'adénylyl cyclase ou de recombinaison endogènes individuels (CHO-D 2L ou HEK-AC6 / D 2 L). Pour améliorer notre rendement, nous avons repensé notre test de sensibilisation de 48 puits (environ> 20 étapes sur 4-5 jours) pour un cinq-étape, le dosage de jour en format 384 puits qui était essentiellement "mélanger et lire". Le nouveau format utilise un temps homogène fluorescence disponible dans le commerce résolu (HTRF) d'essai pour mesurer l'AMPc accumulation dans des cellules intactes avec un lecteur multi-plaque de mode. Le dosage est robuste et se prêtent à criblage de petites molécules, et peut être efficacement appliqué pour cribler des inhibiteurs de la sensibilisation hétérologue. En outre, nous fournissons des données qui permet l'utilisation de ce test avec la transfection inverse de siRNA pour une large criblage d'une banque de siRNA ciblés ou de génomes avec seulement une modification mineure à l'approche générale.

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Protocole

Une. Expansion et la cryoconservation de cellules test Prêt

  1. Culture des cellules CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) les cellules d'une cellule plat 15 cm 2 de culture dans le milieu F12 de Ham additionné de 1,0 uM de L-glutamine, 800 pg / pl G418, 300 pg / hygromycine ul, 100 u / pl pénicilline, 100 pg / pl de la streptomycine, et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
  2. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont confluentes à 90-95%. Laver les cellules avec 10 pi de tampon phosphate salin (PBS), et récolter les cellules par addition de 3 ul de tampon de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Remettre les cellules en utilisant 12 pi de milieu de culture et compter les cellules en utilisant l'exclusion au bleu trypan.
  3. Centrifuger la suspension de cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ul de milieu de congélation (10% de diméthyl sulfoxyde, de 90% FBS). Diluer la suspension de cellules pour obtenir la concentration cellulaire désirée (par exemple de 1 à 20 x 10 6 cellules / ul).
  4. Aliquote de 1,0 ul de solution de cellules de chaque tube cryogénique. Incuber les tubes cryogéniques dans un récipient de congélation de cellules à -80 ° C pendant une nuit. Transférer les tubes cryogéniques à un N 2 liquide réservoir pour le stockage à long terme.

2. Placage cellules Prêt dosage (et Option n º transfection)

  1. Décongeler rapidement un tube cryogénique congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °. Une fois que les cellules sont décongelées, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ul contenant 9 ul d'Opti-MEM, et mélanger en inversant le tube 3 à 5 fois.
  2. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ul d'Opti-MEM.
  3. Compter les cellules en utilisant l'exclusion au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire et de diluer les cellules viables comme nécessaire (par ex. 3 x 10 5 cellules / ul de concentration) dansOpti-MEM. Planche 10 pl / puits de cellules dans une culture de tissu traitée plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux.
  4. Faire des dilutions en série de l'AMPc dans Opti-MEM pour générer une courbe standard pour estimer la production d'AMPc par les cellules (selon recommandations du fabricant - voir la section 7). Ajouter 10 ul / puits de standards d'AMPc à la plaque. Remarque: une courbe standard unique peut être préparé sur une plaque séparée ou puits vides sur l'une des plaques de dosage.
  5. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 1 heure.

3. Inverser siRNA Option de transfection *

Cette section est facultative et pertinente à la figure 3.

  1. Préparer une solution de siRNA dans RNase ddH 2 O (par exemple 0,4 pmol / ul). Ajouter 5 ul à des puits individuels de plaque de 384 puits, et centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante.
  2. Diluer Lipofectamine 2000 à Opti-MEM par un facteur de 0,006 (par exemple, ajouter 6 pi de Lipofectamine 2000 à 1000 pi d'Opti-MEM), et mélanger par pipetage de haut en bas.
  3. Incuber la solution Lipofectamine 2000/Opti-MEM pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 5 ul de la solution diluée Lipofectamine 2000/Opti-MEM à des puits individuels de plaques à 384 puits contenant déjà des siRNA. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante.
  4. Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante.
  5. cellules prêtes d'essai de plaque comme décrit ci-dessus (Section 2). Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante.
  6. Retour plaque d'essai à incubateur humidifié à 37 ° C (5% de CO 2) pour 48-96 h déterminée pour le gène ciblé abattre (voir la discussion).

4. Petit criblage de molécules

  1. Diluer le médicament d'intérêt (inhibiteurs par exemple. Petites molécules) dans OptiMEM-6x les concentrations finales désirées. Des dilutions en série peuvent être effectuées à l'aide de pipettes à main ou une station de traitement des liquides.
  2. Ajouter 2,5 pl / puits de composé d'essai ou du tampon contenant un véhicule (par exemple DMSO) à côté des puits en utilisant une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante (incubation est facultative).

5. Traitement agoniste persistante

  1. Préparer un 600 nM (c.. 6 fois la concentration finale souhaitée de 100 nM) solution de quinpirole dans Opti-MEM.
  2. Ajouter 2,5 pl / puits de la solution de quinpirole 600 nM sur le côté du puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 2 heures.

6. La stimulation de l'accumulation d'AMPc

  1. Au cours de l'incubation de 2 h, préparer les stimulatisur la solution dans Opti-MEM. La solution de stimulation se compose de 40 uM de forskoline, 2 uM de 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), et 4 uM spiperone (toutes les concentrations de l'étape 6 sont 4x la concentration finale souhaitée).
  2. Ajouter 5 ul / puits de la solution de stimulation sur le côté du puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
  3. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure.

7. Trempe et estimation de l'accumulation d'AMPc

  1. La production d'AMPc par les cellules est mesurée en utilisant la trousse cAMP dynamique 2 selon les instructions du fabricant. Brièvement, reconstituer anti-AMPc-cryptate et AMPc-d2 dans de l'eau distillée. Congeler aliquotes à -20 ° C pour le stockage à court terme.
  2. Diluer une partie aliquote d'anticorps anti-AMPc-cryptate et une partie aliquote de l'AMPc-D2 séparément dans le tampon de lyse, selon les instructions du fabricant pour rendre les solutions de travail.
  3. Ajj 10 pl / puits de la solution de travail anti-AMPc-cryptate et 10 pl / puits de la solution de travail cAMP-d2 à la plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux.
  4. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
  5. Lire la plaque dans un lecteur de plaque à fluorescence (réglage de l'échelle automatique de la sensibilité) en utilisant une excitation de 337 nm, et de mesurer les émissions à 620 nm et 665 nm par instructions du fabricant.
  6. Appliquer l'analyse de quotient pour évaluer l'AMPc courbe standard par les instructions du fabricant. En utilisant les valeurs obtenues, extrapoler l'accumulation d'AMPc estimé dans les puits de test en utilisant un logiciel d'analyse de données.

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Résultats

Partie I. Le développement d'un test de sensibilisation bien hétérologue 384 pour identifier des inhibiteurs de petites molécules en utilisant un modèle de cellule disponible dans le commerce.

Pour étudier la sensibilisation hétérologue dans un modèle cellulaire, nous avons fait un certain nombre d'améliorations qui nous ont permis de rationaliser le test dans un format «mélanger et lire". Plusieurs modifications principales sont exposées ci-dessous, et sont déc...

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Discussion

Dans un effort pour faciliter les études de sensibilisation hétérologue, nous avons largement modifié notre méthode précédente réalisation d'un rationalisé "mélange et de lire" format qui est modifiable à criblage à haut débit et le mécanisme de l'examen de l'action. Les principales modifications apportées à notre protocole peuvent être résumées comme suit: 1) l'utilisation de cellules congelées comme réactifs "de dosage prêt"; 2) la miniaturisation de l'analyse au format 384 puit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier M. Richard Zink et Todd Wiernicki pour la formation méthodologique et des conseils de dosage. Nous remercions également Jean-Paul Spence pour lecture attentive et suggestions d'ordre rédactionnel. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé 060 397 MH, Fondation Brain and Behavior Research, et Eli Lilly and Company à travers le Programme de bourses de recherche Lilly (LRAP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CHO-K1-DRD2L cellulesDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 mediaVWRSH30026fs
Sérum de veau fœtalVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycineFisher50-230-5556
Pénicilline/streptomycineLife Technologies15070063
Boîtes de 15 cmBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Tampon de dissociation cellulaireLife Technologies13150016
Tampon phosphate SalineLife Technologies10010-049
CryovialsFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC Plaques à 384 puitstraitées Perkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
(± ;)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)SulpirideSigmaS112
Lipofectamine 2000 réactif de transfectionInvitrogen11668019
Trypan blueLife TechnologiesT10282
Eau, DNase et RNase MPBiomedicals821739
Gas siRNADharmaconsiRNA personnalisé SiRNA
non cibléDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

Références

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

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Réimpressions et autorisations

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