Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Jason M. Conley; Tarsis F. Brust; Ruqiang Xu; Kevin D. Burris; Val J. Watts

doi:10.3791/51218

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Article de méthode

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

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DOI :

10.3791/51218

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27 janvier 2014

Jason M. Conley¹ , Tarsis F. Brust¹ , Ruqiang Xu¹ , Kevin D. Burris² , Val J. Watts¹

¹Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, ²Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Dans cet article

Résumé

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Résumé

Sensibilisation de l'adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l'activité AC, alors que l'activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l'AC et l'augmentation des niveaux d'AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l'activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D ₂ et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l'AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l'AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l'AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l'AC, le développement et la validation d'un dosage de l'AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d'une méthodologie complexe pour mesurer l'accumulation d'AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d'un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L'utilisation de deux modèles cellulaires D ₂ de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D _2L et HEK-AC6 / D _2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (> 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l'essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d'une banque de siRNA ciblés.

Introduction

Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance ^1. En plus de l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l'activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés ^2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont a....