Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l'ARN virus

Résumé

Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d'autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.

Résumé

virus à ARN sont responsables de maladies humaines majeures telles que la grippe, la bronchite, la dengue, l'hépatite C ou la rougeole. Ils représentent aussi une menace émergente en raison de l'augmentation des échanges à travers le monde et les populations humaines pénétrant écosystèmes de plus en plus naturelles. Un bon exemple d'une telle situation émergente est épidémies de virus du chikungunya de 2005-2006 dans l'océan Indien. Les progrès récents dans notre compréhension des voies cellulaires contrôlant la réplication virale suggèrent que des composés ciblant les fonctions de la cellule hôte, plutôt que le virus lui-même, pourraient inhiber un large panel de virus à ARN. Certains composés antiviraux à large spectre ont été identifiés avec accueil tests et ciblées. Toutefois, la mesure de l'inhibition de la réplication virale dans des cultures de cellules en utilisant la réduction de l'effet cytopathogène comme une visualisation représente encore une stratégie de dépistage primordiale. Ces écrans fonctionnels ont été grandement améliorées par le développement des virus recombinants exprimant journaliste enzymes capable de bioluminescence tel que la luciférase. Dans le présent rapport, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit, qui combine recombinant de la rougeole et les virus de chikungunya avec des tests de viabilité cellulaire, pour identifier des composés avec un profil antivirale à large spectre.

Introduction

virus à ARN sont responsables d'une grande variété d'infections humaines, et avoir un impact énorme sur les populations à travers le monde à la fois en termes de santé publique et de coût économique. Vaccins efficaces ont été mis au point contre plusieurs virus à ARN humain, et sont largement utilisés comme traitements prophylactiques. Cependant, il ya encore un manque crucial de médicaments thérapeutiques contre les infections de virus à ARN. En effet, les vaccins efficaces ne sont pas disponibles par rapport aux principales agents pathogènes humains tels que le virus de la dengue, virus de l'hépatite C ou le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). E....

Protocole

1. Préparation de 96 puits fille plaques avec les composés

1. Déplacer plaques mères à 96 puits contenant 10 mM de solutions de composés chimiques dans le DMSO à partir de -20 ° C à la température ambiante. Diluer composés 5x dans le DMSO pour obtenir des plaques de dilution 96 puits intermédiaires à 2 mM. La dilution est réalisée par pipetage de 5 ul dans 20 ul de DMSO et de mélange.
2. 1 ul de plaques de dilution dans les puits sec de blanc, de culture de tissu à code à barres des plaques 96 puits. Ce premier ensemble de plaques-filles (D1) seront utilisées pour évaluer la toxicité des composés à une concentration finale de 20 uM. Magasin fille plaqu....

Résultats

Ce pipeline de dépistage repose d'abord sur la sélection de composés qui inhibent la réplication MV et ne présentent pas de toxicité cellulaire significative (figure 1, l'écran principal). Il tire parti des dosages à base de luciférase pour déterminer la toxicité cellulaire et l'inhibition de la réplication virale. Toutes les étapes de pipetage et d'acquisition des données peut être effectué dans un cadre de haut-débit avec une plate-forme robotique.

La toxic.......

Discussion

Le pipeline de criblage décrit ici vise à sélectionner des composés avec un profil adapté comme inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Quand une bibliothèque de 10 000 composés a été criblée avec ce protocole et les critères de filtrage ci-dessus ont été appliquées, à savoir l'inhibition de la réplication MV supérieur à 75%, 40 composés (0,4%) a reçu positif. En outre, environ la moitié d'entre eux ont montré une toxicité sur dans le test de la viabilité en fonction de la luciférase, et ont été pri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plateforme EVO Freedom	Plateforme robotique	Polycarbonate
96 puits de culture cellulaire en polystyrène, blanc	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente	Promega	G7570	Essai de viabilité basé sur la luciférase
Système d’essai de luciférase Bright-Glo Promega		E2610	Réactif contenant de la luciférase de luciférase substrat
Système d’essai de luciférase Renilla-Glo	Promega	E2710	Réactif contenant un substrat de Renilla luciférase
Britelite plus Gene Reporter Système d’essai	Perkin-Elmer	6016761	Réactif contenant un substrat de luciférase de luciole. Peut être utilisé comme alternative au réactif Brigh-Glo pour déterminer l’activité de la luciférase.