Visualisation de l'ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Résumé

Nous présentons un protocole sur la façon de recueillir et électronique de processus cryo-tomographie de mitochondries entières. La technique donne un aperçu détaillé de la structure, la fonction et l'organisation de grands complexes de protéines membranaires en membranes biologiques indigènes.

Résumé

Electron cryo-tomographie est un outil puissant dans la biologie structurale, capable de visualiser la structure tridimensionnelle d'échantillons biologiques, tels que des cellules, des organites, des vésicules membranaires ou des virus dans des détails moléculaire. Pour ce faire, l'échantillon aqueux est rapidement vitrifié dans l'éthane liquide, qu'il conserve dans un état congelé-hydraté proche de l'origine. Au microscope électronique, les séries d'inclinaison sont enregistrés à la température de l'azote liquide, à partir de laquelle on reconstruit des tomographies 3D. Le rapport signal-sur-bruit du volume tomographique est intrinsèquement faible. Reconnaissables, caractéristiques récurrentes sont renforcées par subtomogram moyenne, qui sous-volumes individuels sont découpés, alignés et moyenne pour réduire le bruit. De cette manière, les cartes 3D avec une résolution de 2 nm ou plus peut être obtenu. Un ajustement des structures disponibles en haute résolution pour le volume 3D produit alors des modèles atomiques de complexes de protéines dans leur environnement natif. Ici, nous montrons comment nous utilisons cryo-tomography pour étudier l'organisation in situ de grands complexes de protéines membranaires dans les mitochondries. Nous constatons que les ATP synthases sont organisées en rangées le long des sommets de dimères à forte courbure de la membrane intérieure de crêtes, alors que le complexe I est distribuée de manière aléatoire dans les régions de la membrane de part et d'autre des rangées. Par subtomogram moyenne, nous avons obtenu une structure de l'ATP synthase mitochondriale le dimère à l'intérieur de la membrane de crêtes.

Introduction

Les mitochondries sont les centrales d'énergie de la cellule. Par conversion d'un gradient de proton électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne en énergie de liaison chimique, l'ATP synthase mitochondriale produit la plupart de l'ATP qui entraîne des processus cellulaires. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents conversion d'énergie mitochondriale, nous avons besoin de déterminer la structure de l'ATP synthase in situ, et pour savoir comment il est organisé et distribué dans la membrane mitochondriale interne. Bien que les structures à haute résolution de la plupart des composants mitochondriaux de l'ATP synthase ^3.1 et cartes à faible résolution de l'ensemble du complexe ⁴ sont disponibles, il est important d'établir la structure et la conformation de l'enzyme active dans la membrane. La distribution de l'ATP synthase dans la membrane mitochondriale interne a été largement supposé être aléatoire, mais un début de trouver ⁵ et nos propres résultats initiaux ⁶ indiqué que ce n'est pas til cas. Des études ultérieures de notre groupe et d'autres ⁷ ont confirmé que l'ATP synthase est disposé dans de longues rangées de dimères sur les crêtes étroitement courbes de la mitochondriale interne crêtes de la membrane ^8, tandis que les pompes à protons de la chaîne de transport d'électrons semblent être situés de chaque côté des lignes ^9. Cette disposition a d'importantes implications pour les mécanismes de conversion d'énergie mitochondriale.

La technique que nous avons utilisée pour déterminer cette disposition est cryo-tomographie (cryo-ET). Cryo-ET est actuellement la seule méthode qui offre précises volumes en trois dimensions (3D) de cellules, des compartiments cellulaires ou des organites à une résolution moléculaire. Cryo-ET est particulièrement adapté à l'étude de grands complexes dans les membranes biologiques, car les membranes apparaissent avec un bon contraste et sont faciles à tracer des volumes tomographiques en 3D.

D'autres méthodes pour étudier la structure 3D de cellules ou organelles ne donnent pas de détails moléculaire. Super-résolution de la microscopie à lumière ^{10, 11} est excellent en révélant la position ou la distance entre les marqueurs luminescents liés à des protéines d'intérêt avec une précision de quelques dizaines de nm, mais il ne révèle pas la structure de la protéine elle-même, même à basse résolution . microscopie électronique à transmission de coupes en série ¹² ou imagerie îlot par microscopie électronique à balayage ¹³ d'échantillons biologiques plastique intégré offrent une vue basse résolution de volumes cellulaires, mais également ne pas révéler les détails moléculaire. La microscopie à force atomique ¹⁴ peut en principe délivrer résolution moléculaire ou atomique même, mais seulement à la surface des objets sur un support solide atomiquement plat. Enfin, tomographie par rayons X ¹⁵ ou diffusion de intenses impulsions de rayons X par des lasers à électrons libres ¹⁶ est peu probable pour révéler la structure de grands complexes, objets apériodiques comme les cellules ou les organites entiers à mrésolution olecular dans un avenir prévisible. Ainsi à l'heure actuelle, il n'y a pas d'alternative à cryo-ET pour les études de la structure 3D de cellules ou organites à résolution nanométrique.

Cryo-ET est la méthode de choix pour l'examen de la structure et la conformation des assemblages de protéines associées à la membrane, y compris le complexe du pore nucléaire ^17, le pic de la grippe se complexe ^18, et les flagelles des protéines motrices ^{22, 23,} mais également l'organisation des cellules bactériennes entières ¹⁹ et l'entrée de virus pathogènes comme le VIH dans les cellules ^20-23. Cryo-ET est inestimable pour la visualisation de protéines filamenteuses et leurs interactions dans la cellule, dont les filaments d'actine ²⁴ ou axonèmes ^25. La résolution peut être améliorée à 2 nm ou mieux par subtomogram moyenne ^26, dans lequel sont découpées sous-volumes de répétition, des traits réguliers sur un volume tomographique et en moyenne par une particule d'image prodes techniques de transformation.

Cryo-ET comprend l'acquisition d'une série d'images de projection d'un spécimen mince (<250 nm d') prises sous différents angles d'inclinaison dans un microscope électronique à transmission (MET). Le spécimen doit être mince pour que des électrons qui interagissent fortement avec la matière, sont dispersés plus d'une fois. Diffusion multiple rend les images qui en résultent difficiles à interpréter et réduit le contraste. Les images de la zone sélectionnée de l'échantillon sont alignés par rapport à l'autre et prévus dans un espace 3D par un programme informatique approprié, la génération d'un volume 3D de l'échantillon. L'alignement des images est assisté par marqueurs fiduciaires or, qui sont mélangés avec l'échantillon avant la congélation. Marqueurs fiduciaires Idéalement 10 ou plus uniformément réparties doivent être présents dans chaque image pour obtenir un bon alignement.

Pour observer en détail moléculaire, les échantillons sont congelés plongée dans l'éthane liquide, ce qui préserve leur état hydraté natif. Congélation en liquideéthane est si rapide (~ 10 ⁵ ° C / s) ²⁷ que l'eau ne cristallise pas, mais reste dans un état ​​vitrifié, semblable à du verre. cristaux de glace des dommages-intérêts de la formation des structures biologiques sensibles. Comme échantillons biologiques souffrent de dégâts d'irradiation, il existe une limite pour le nombre total d'événements de diffusion de l'échantillon peut tolérer. Les images sont ainsi acquises en mode à faible dose: Une zone d'intérêt est identifié à faible grossissement (1,500X) avec une dose d'électrons inférieure à 1 e ^- / nm ² (mode de recherche). L'image est ensuite porté à un plus fort grossissement, hors de la zone d'intérêt (mode de mise au point). Ce n'est que lorsque l'image est acquise, la zone d'intérêt est irradié avec une dose plus élevée d'électrons (mode d'exposition).

Ici, nous présentons un aperçu de la façon de recueillir et d'électrons de processus cryo-tomographie, en utilisant de l'ATP synthase dimères dans la membrane mitochondriale interne comme un exemple. Le protocole suivant décrit comment préparer les mitochondries pour cryo-ET, comment mettre en placeet collecter une série d'inclinaison avec une dose d'électrons totale spécifique, et la manière de traiter la série d'inclinaison pour obtenir un volume 3D de la zone d'intérêt. Une vue d'ensemble de la procédure est illustrée sur la figure 1.

Protocole

1 Préparation des mitochondries à partir de cellules ou de tissus humains par centrifugation différentielle

Cette section décrit une procédure générale pour l'isolement des mitochondries intactes de différents organismes eucaryotes. La précision des composants du tampon et de la vitesse de centrifugation doivent être optimisés pour chaque tissu / espèces étudiées.

1. Faire éclater les cellules dans un tampon isotonique (par exemple, 250 mM de saccharose, 10 mM d'HEPES pH 7,4), en utilisant un broyeur à billes de verre (mycélium) ^28, une digestion enzymatique de la paroi cellulaire (Saccharomyces cerevisiae) ^29, d'un homogénéisateur à roulement à billes (single -Chargeur eucaryotes / cellules / culture) ³⁰ nematodes, ou un mélangeur (de tissus animaux ou végétaux) ^31.
2. Éliminer les débris cellulaires par filtration à travers une mousseline suivie d'une centrifugation à basse vitesse (2000 x g, 4 ° C, 10 min).
3. Recueillir surnageant et de culot de mitochondries par centrifugation à grande vitesse (9000 xg, 4 ° C, 10 min).
4. Si nécessaire, utiliser un gradient de densité isotonique étape de purification supplémentaire de la fraction mitochondriale ^32.

2 Préparation des mitochondries pour cryo-tomographie

La section suivante décrit comment obtenir les échantillons congelés-hydratés pour cryo-ET. REMARQUE: La méthode implique l'utilisation de l'azote liquide extrêmement froid et de l'éthane, qui peut causer de graves brûlures de la peau. des lunettes de protection et des gants cryo-protection doivent être portés. Éthane liquide, qui est également inflammable, doit être traitée dans une hotte de laboratoire.

1. Remettre en suspension les mitochondries culot dans 250 mM de tréhalose, 10 mM de tampon HEPES à pH 7,4 à une concentration d'environ 5 mg / ml de protéine totale.
2. Décharge luminescente grilles EM trouée de carbone, du carbone jusqu'à latérales, dans un dispositif à vide selon les instructions du fabricant.
3. Liquéfier quelques millilitres d'éthane en dirigeant un courant de gaz d'éthane sur le côté intérieur d'un froid de l'azote liquiderécipient en aluminium éd.
4. Mélanger la suspension de repère d'or de la protéine A conjuguée à 1: 1 avec suspension mitochondriale et appliquer immédiatement 3 pi à un réseau EM décharge luminescente qui s'est tenue à pinces.
5. Placez la pince à épiler dans un dispositif de vitrification, par exemple, une guillotine fait maison. Éponger l'excès de liquide avec un coin de papier filtre (~ 5 secondes ou jusqu'à ce que le liquide cesse d'étalement) et plonger immédiatement dans la grille de l'éthane liquide en relâchant la gâchette.
6. Transférer la grille à partir d'éthane liquide dans l'azote liquide. Pendant le transfert, enlever l'excès d'éthane à partir de la grille avec un papier filtre. Placez l'extrémité d'un morceau de papier filtre en forme de coin dans la éthane liquide. Comme l'éthane liquide monte doucement glisser la grille le papier du filtre, mais le garder au-dessous du front de liquide. Éthane liquide est retiré de la grille par une action capillaire, et une fois tous éthane liquide a été retiré, transférer immédiatement la grille dans l'azote liquide.
7. Placer la grille vitrifiés dans une boîte de rangement de grille, unee stocker de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure, le cas échéant.

3 Enregistrement des tomographique Tilt Series

La section suivante décrit comment mettre en place et de recueillir une série d'inclinaison tomographique d'une mitochondrie avec un microscope électronique à Polara équipé d'un filtre d'énergie post-colonne et d'une caméra CCD. Des protocoles similaires sont utilisés avec tous les électrons cryo-microscopes équipés de caméras CCD ou directs de détection électronique.

1. Aligner le microscope
   1. Insérez éprouvette par exemple, le graphite et les îles d'or sur le film de carbone à trous.
   2. Sélectionnez le mode de recherche dans le système à faible dose du microscope.
   3. Amener l'échantillon à la hauteur eucentrique. C'est le point de déplacement xy minimal lors de l'inclinaison du porte-échantillon. Centrer un point d'intérêt à 0 ° d'inclinaison, l'inclinaison de la scène à 20 ° et recentrer le point en modifiant la hauteur z. Retour à 0 ° et répéter jusqu'à ce décalage latéral est minimisé.
   4. Sélectionnermode d'exposition. Choisissez agrandissement souhaité pour la collecte d'une tomographie (par exemple, 25,000X sur le détecteur ≈ 0,6 nm Taille de l'échantillon de pixels).
   5. Choisissez une ouverture du condenseur de petite taille (50-70 mm) et sélectionnez une taille de spot et de l'intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d'imagerie et donne une lecture de pixel de 60 e ^- / pixel (CCD) ou 14 e ^- / pixel / s (détecteur d'électrons direct, mode de comptage).
   6. Centre d'ouverture du condenseur.
   7. Trouver gaussien accent par exemple, point de contraste minimal. Réinitialiser le microscope lecture de défocalisation et des points de pivotement et de corriger le centre de rotation selon les instructions du fabricant.
   8. Cadran en défocalisation souhaité pour l'enregistrement de tomographie. REMARQUE: Haute défocalisation (8 pm) augmente le contraste mais réduit la résolution, alors qu'une faible défocalisation (2-4 pm) augmente la résolution au détriment de contraste.
   9. Sur un trou vide, générer une nouvelle référence de gain et aligner filtre d'énergie selon le fabricant deinstructions.
   10. Alignez les modes de recherche et d'exposition. En mode d'exposition, centre un point d'intérêt et de passer en mode de recherche. Choisir un grossissement de 1,500X (0,033 um / pixel de l'échantillon sur le détecteur) et défocalisation de 100 um (pour augmenter le contraste). Apportez point d'intérêt retour à centrer utilisant des bobines de décalage d'image.
   11. En mode de recherche, ajustez la taille du spot et de l'intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d'imagerie et donne une lecture de pixel d'environ 20 e ^- / pixel (CCD) ou ~ 8 e ^- / pixel / sec détecteur d'électrons direct (, mode de comptage).
2. Trouver une zone de bon spécimen
   1. Insérez la grille avec des mitochondries congelés-hydratés dans le microscope électronique à la température de l'azote liquide (reportez-vous aux instructions du fabricant EM).
   2. En mode de recherche, la recherche de la grille pour les zones de l'épaisseur de la glace et de l'échantillon qualité appropriée. Prenez une photo de recherche de 6 sec de domaines prometteurs pour déterminer l'aptitude pour la collecte de tomographie. Both la membrane mitochondriale interne et externe doit être visible à ce grossissement.
3. Enregistrement d'une série Tilt tomographique
   1. Une fois une bonne surface de l'éprouvette se trouve, inclinez la scène ± 60 ° pour déterminer la plage d'inclinaison maximale qui est disponible sans aucune obstruction de l'exposition ou la zone de mise en barreaux de la grille ou des morceaux de glace.
   2. Sur un trou rempli de glace à proximité d'apparence similaire, changer de mode d'exposition et d'ajuster l'intensité du faisceau ou de l'acquisition de l'image du temps de sorte que chaque image enregistrée a une dose d'électrons de 30-50 e ^- / pixel pour CCD ou 6-8 e ^- / pixel / s détecteurs d'électrons directs, mode comptage.
   3. Calculer le rapport de distribution de dose (I ₀ / I ₆₀₎ en divisant le nombre moyen d'électrons pour une image acquise pendant 1 seconde à 0 ° avec celle de l'image de 60 °. Ce rapport décrit l'augmentation du temps d'exposition nécessaire pour maintenir un taux constant d'électrons par image avec l'augmentation de l'angle d'inclinaison (= temps d'exposition 1 / cos (α) ⁿ où (I ₀ / I ₆₀₎ = 2 ^n). Le rapport est aussi une bonne indication de l'épaisseur de la glace. Bonnes tomographies de mitochondries sont généralement enregistrés avec un I ₀ / I ₆₀ = 2.3-2.6.
   4. Sur un trou vide, d'acquérir une image de 1 sec en mode d'exposition et de noter le nombre d'électrons par Å ^2. Prenant en compte le rapport de distribution de dose, calculer le nombre total d'images pouvant être enregistrées pour une dose totale spécifique d'électrons (par exemple, <40 e ^- / Å ² pour la détermination de la structure et ~ 160 e ^- / Å ² pour la morphologie).
   5. Déterminer l'intervalle d'inclinaison approprié pour la collecte de tomographie en divisant la plage verticale (par exemple, 120 ° pour ± 60 °) par le nombre total d'images calculées en 3.3.4.
4. Mettre en place et enregistrer une tomographie avec les paramètres déterminés ci-dessus en utilisant un logiciel de collecte automatique de données approprié ^{33, 34.} série Tilt débute habituellement à ± 20 ° et passent par 0 ° avant d'atteindre élevés s'incline afin de maximiser le contenu de l'information d'images à faible inclinaison qui est détruit par augmentation de la dose d'électrons.

4 Création et segmentation des volumes tomographiques

Cette section décrit comment volumes tomographiques de mitochondries sont générés à partir de séries d'inclinaison et la façon dont les volumes sont présents pour l'affichage général.

1. Enregistrer la série tomographique d'inclinaison pour un répertoire approprié. Générer une pile d'images et de les convertir dans un format de fichier approprié avec le logiciel open-source, comme dm2mrc ou tif2mrc (paquet MID), qui convertissent .dm3, .dm4 ou .tif fichiers à piles mrc. mrc piles sont nécessaires pour la reconstruction tomographique avec MID ^35. Autres forfaits exigent des formats.
2. Aligner les images et générer une tomographie en suivant les étapes décrites dans le tutoriel MID ( http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
3. Améliorer le contraste de l'tomogramme en utilisant le filtre de diffusion anisotrope non linéaire distribués avec IMOD. Ce filtre fonctionne bien pour les membranes et les particules associées à la membrane, tels que l'ATP synthase.
4. Pour la visualisation, le segment manuellement la tomographie en utilisant des programmes disponibles dans le commerce par exemple, Amira. Attribuer voxels correspondant à la membrane interne ou externe et de générer une surface. Utilisation de l'option de clicker dans le plugin EM-paquet pour AMIRA ³⁶ marquer l'emplacement des particules de l'ATP synthase.

5. Subtomogram Moyenne de l'ATP synthase dimères et pose de X-Ray Structures

La section suivante décrit comment moyennes subtomogram de l'ATP synthase dimères peuvent être obtenus.

1. En utilisant les particules marquées en entrée et un logiciel approprié tel que la «PartieEstimation icle programme tomographie électronique »pour, calculer une moyenne de subtomogram.
2. Pour obtenir une estimation de la résolution, de comparer deux moyennes de subtomogram déterminés indépendamment par Fourier coque corrélation ^37.
3. Si disponibles, quai connu structures de rayons X dans la moyenne de subtomogram par corps rigide montage, soit manuellement, soit en utilisant des routines automatiques d'accueil séquentiel, tels que ceux du programme Chimera ^38.

Résultats

Cryo-tomographie de mitochondries révèlent clairement la morphologie 3D de l'organite (Figure 2). Segmentation manuelle de membranes dans un volume tomographique illustre la structure de l'une des crêtes dans la mitochondrie. En imagerie de mitochondries à partir de différentes souches de levure knock-out dépourvues de certains composants de la protéine, l'effet de ces protéines sur la morphologie des crêtes peut par évalué. Figure 3 montre une mitochondrie d'une souche de levure dépourvue de sous-unité de l'ATP synthase e. Ce composant du complexe ATP synthase est nécessaire pour la dimérisation de l'ATP synthase mitochondriale. Les mitochondries à partir de cette souche manque les crêtes lamellaire normale des mitochondries de type sauvage (figure 2) et contient à la place d'un certain nombre de compartiments de la membrane interne. Ces compartiments sont soit dépourvues de crêtes ou contiennent de petites invaginations de la membrane en forme de ballons (figure 3).

Dans tomogrammes avec un bon contraste, grands complexes de protéines mitochondriales, dans ce cas ATP synthase dimères, sont facilement visibles (Figure 4; Film 1). Les structures des complexes peuvent être déterminés à la résolution de 2-3 nm par subtomogram moyenne (Figure 5; Film 2). Les volumes moyens peuvent être mis de nouveau dans le tomogramme en vue d'évaluer la structure des complexes individuels par rapport à l'autre et à d'autres complexes de protéines dans la membrane (figure 6; Film 3).

Figure 1 organigramme montrant les étapes de la cryo-tomographie. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2: Morphologie d'une mitochondrie de type sauvage S. Cerevisiae. Tranche de centrale à travers un volume tomographique d'un type sauvage S. mitochondrie cerevisiae (à gauche) et le volume de la surface-rendu correspondant (à droite). Le volume segmenté la membrane externe est représentée en gris et les volumes de la limite intérieure et crêtes membranes en bleu clair. Adapté de Davies et al ^8. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3 mitochondrie d'une S. Cerevisiae manque une sous-unité nécessaire pourATP synthase dimérisation. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume d'accompagnement (à droite) en surface rendue d'une mitochondrie d'une S. Cerevisiae manque le e de la sous-unité de la protéine nécessaire à l'ATP synthase dimérisation. En comparaison avec la figure 2, la mitochondrie de la souche mutante manque de la normale lamellaire crêtes des mitochondries de type sauvage. Au lieu de cela, la mitochondrie a de nombreux compartiments membranaires intérieure avec soit sans crêtes ou crêtes en forme de ballon. Ainsi cryo-tomographie souligne modifications de la morphologie de la membrane due à la délétion de gènes. Adapté de Davies et al ^8. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4 mitochondrie du champignon P. anserina. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d'accompagnement (à droite) d'une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Dans ce tomographie, des rangées de 10 particules nm (têtes de flèches jaunes) sont situés au-dessus des crêtes de la membrane fortement incurvées dans les crêtes de la membrane interne (voir vidéo 1). Ces particules ont été identifiées comme l'ATP synthase dimères par subtomogram moyenne. De Davies et al ^9. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5 Structure et organisation de l'ATP synthase mitochondriale. Side et vue de dessus montrant la densité électronique d'un dimère ATP synthase de S. c erevisiae tel que déterminé par subtomogram moyenne avec des modèles atomiques équipés (à gauche). Mitochondrial vésicule membranaire interne montrant l'organisation de l'ATP synthase dimères en rangées (à droite). La figure a été produite par le moyen de positionnement subtomogram de l'ATP synthase dimère dans le volume segmenté de la vésicule de la membrane, en utilisant les coordonnées calculées au cours de la moyenne. Adapté de Davies et al ^8. Modèles atomiques: F ₁ / rotor torique [APB: 2WPD] ³⁹ (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] ⁴⁰ (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] ¹ avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS] ² (jaune et rouge) (voir vidéo 2). Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Figure 6 isolé crête vésicule d'un P. anserina mitochondrie. tranches d'un volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d'accompagnement (à droite) d'une vésicule de crête de P. anserina. les densités de protéines dépassant de la membrane sont nettement visibles. Les densités indiquées par des flèches jaunes sont des dimères de l'ATP synthase, comme identifié par subtomogram moyenne. Flèches vertes indiquent des densités identifiées par marquage de l'anticorps comme NADH déshydrogénase (complexe 1, pour plus de détails voir ^9). Segmentation des densités de protéines révèle leur organisation dans des crêtes, des dimères de l'ATP synthase (rouge et jaune) qui forment des rangées le long des crêtes des crêtes très incurvés et les complexes NADH déshydrogénase (vert) dans les régions de la membrane de part et d'autre des rangées (voir Film 3). De Davies et al ^9.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Film 1 Electron cryo-tomographie d'un P. anserina mitochondrie. Le film montre des tranches successives par un volume tomographique pris d'une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Des rangées de l'ATP synthase sont indiqués par des flèches jaunes. Le volume segmenté tensio-rendu indique l'emplacement de l'ATP synthase (sphères jaunes) par rapport à la structure 3D de crêtes. Membrane externe, gris; membrane limite intérieure, bleu transparent; crêtes membranes, bleu opaque. De Davies et al ^9. Voir aussi la figure 4. Cliquez ici pour voir la vidéo.

Film 2. moyenne de Subtomogram du mitochondriale d'ATP synthase dimère de S. Cerevisiae avec des modèles atomiques équipés. La moyenne était decalculée à partir de 121 sous-volumes. La densité est affiché à trois niveaux de contour: 1s - maille, 2s - gris clair et gris foncé - 3s. Modèles atomiques ont été installés dans la densité en utilisant la routine ajustement séquentiel dans Chimera. Modèles atomiques: F ₁ / rotor torique [APB: 2WPD] ³⁹ (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] ⁴⁰ (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] ¹ avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS]. ² (jaune et rouge) Cliquez ici pour voir la vidéo.

Adapté de Davies et al ^8. Voir aussi la figure 5.

Film 3 isolé crêtes vésicule d'un P. anserina mitochondrie. tranches successives à travers le volume tomographique sont présentées, suivie par le volume de la surface-rendu segmenté. densités de protéines qui dépassent de la membrane d'e sont clairement visibles. Densités rouges et jaunes sont des dimères de l'ATP synthase. Densités verts sont NADH déshydrogénase (complexe I), telle que déterminée par marquage de l'anticorps. De Davies et al ^9. Voir aussi la figure 6. Cliquez ici pour voir la vidéo.

Discussion

Le protocole présenté ici fournit une introduction de cryo-ET et subtomogram moyenne des mitochondries, mais essentiellement la même procédure peut être appliquée à n'importe quel autre compartiment de la cellule ou de la membrane. Pour obtenir les meilleures données possibles, les étapes critiques de la procédure sont la préparation des échantillons, la stratégie d'acquisition de données et des processus de congélation plongeon. Qualité échantillon, ce qui est essentiel pour le succès, dépend d'un protocole de congélation optimisé pour garantir une épaisseur de glace appropriée, qui est d'une importance primordiale pour un bon contraste d'image. La stratégie optimale d'acquisition de données dépend de l'instrument et de l'échantillon. Paramètres à optimiser comprennent dose d'électrons par image, système d'inclinaison et défocalisation. L'acquisition d'une bonne tomographie d'un bon échantillon rend tout traitement ultérieur étapes plus facile et assure un résultat final satisfaisant.

Cryo-ET combiné avec subtomogram moyenne et atomique ajustement du modèle fournit des détails sur la façon dont les complexes de protéines sont disposées en eenvironnement cellulaire natif leu. La technique est également adaptée à l'étude de la structure de grands complexes de protéines membranaires, tels que supercomplexes respiratoires de chaîne (1,7 MDA), les dimères de l'ATP synthase (2x500 kDa), ou le complexe du pore nucléaire (~ 120 MDa) ^{8, 9, 17.} L'organisation de l'ATP dimères synthase en lignes ne peut être observée par des techniques à haute résolution tels que la cristallographie aux rayons X, RMN ou une particule cryo-EM, parce que les rangées de dimères sont perturbés par extraction au détergent, qui est une étape nécessaire dans l'isolement et la purification de complexes protéiques de la membrane.

L'agencement de l'ATP synthase dans des rangées de dimères long des crêtes de crêtes est un principe d'organisation universelle des mitochondries dans toutes les espèces. Les complexes de pompage de protons de la chaîne de transport d'électrons, en particulier complexe I (NADH déshydrogénase), sont situés dans les zones de chaque côté des rangées de membrane ^8,9. Cette organisation de la chaîne respiratoire a un impact profond sur la bioénergétique mitochondriale. Si les rangées de dimères ne peuvent se former en raison de l'absence de sous-unités protéiques spécifiques aux dimères, les cellules présentent des temps de génération et de remise en forme cellulaire réduite, comme observé dans le mutant de levure représenté sur la figure 3 ^41. Avec l'intérêt croissant pour les maladies mitochondriales, un détail compréhension de la base moléculaire régissant ultrastructure et la fonction mitochondriale est d'une importance primordiale. Cryo-tomographie fournit un lien entre la structure de la protéine déterminée par des méthodes à haute résolution, et la distribution et la disposition de ces protéines dans la membrane à l'échelle du nanomètre. Cela rend cryo-ET un outil essentiel pour comprendre la structure et la fonction mitochondriale dans la santé et la maladie.

Développements et améliorations techniques complémentaires en cryo-ET comprennent des stratégies protéine d'étiquetage pour identifier la position de protein sous-unités dans des complexes macromoléculaires ou la localisation de protéines distinctes plus petites ou moins (<0,5 Mda) dans les cellules. En outre, les méthodes de traitement hybride EM, qui se combinent avec une moyenne subtomogram analyse de particules isolées ou de reconstruction hélicoïdale ont récemment déterminé les structures des protéines à ~ 8 A ^{42, 43.} Ces méthodes de traitement sont actuellement limitées aux protéines purifiées, qui sont bien séparés dans la glace ou forment des ensembles hélicoïdaux et sont actuellement pas applicable aux environnements cellulaires très fréquentés comme les mitochondries et les membranes des crêtes. Pour la collecte des données, de nouveaux outils informatiques et de matériel sont en cours d'élaboration pour permettre l'acquisition de tomographie automatisée, augmenter le contraste d'image et de réduire la dose totale d'électrons nécessaire. La seule limitation fondamentale dans cryo-ET est dégâts d'irradiation de l'échantillon par le faisceau d'électrons. Cela signifie que seulement de très faibles doses d'électrons peuvent être utilisés pour enregistrer chaque image d'une série d'inclinaison tomographique, entraînant un mauvais rapport signal trapport qui limite finalement la résolution réalisable o-bruit. Les nouveaux détecteurs d'électrons directe, publié il ya moins d'un an, sont actuellement en train de révolutionner le domaine de la seule particule cryo-EM ^{44, 45.} Ces nouveaux détecteurs offrent un contraste plus élevé et une meilleure résolution à des doses plus faibles d'électrons. Par cryo-tomographie, cela signifie que les séries de basculement avec de plus petites tailles de pas ou des tomographies de l'axe même doubles peuvent être collectées sans s'inquiéter de dégâts d'irradiation excessive (une image CCD est équivalente à la dose d'électrons de 5 images directes de détecteur d'électrons). Les vastes quantités de données produites par ces détecteurs de créer leurs propres défis en matière de manutention, le traitement et le stockage, qui devront être surmontés.

En outre, les plaques de phase, qui fonctionnent sur ​​les mêmes principes que ceux qui sont utilisés en routine dans la microscopie optique pour augmenter le contraste de phase, sont actuellement en cours de développement pour la microscopie électronique à transmission ^{46, 4}7. Cela devrait permettre tomographies à collecter plus proche de focaliser et donc à la résolution plus élevée, tout en préservant en même temps basse résolution propose nécessaire pour l'alignement et l'interprétation des volumes tomographiques. Pris ensemble, ces avancées technologiques seront grandement élargir la gamme des questions biologiques qui peuvent être traités par cryo-ET.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saccharose	Roth	4621.2
Tréhalose	Sigma-Aldrich	T9449
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Zymolase	biomol	Z1000.1
Gradient de densité moyen	Sigma-Aldrich	D1556 ou P1644
Protéine A or	Aurion	810.111	10 nm
Ethane	Air Liquide	P0502S02R0A001
Azote	Air Liquide	I4150RG
Consumables
Papier filtre	Whatman, GE Healthcare	1004 090	Nr 4
Pince à épiler	Dumont	T506	Non magnétique, motif #5
EM grille de test combinée	Plano GmbH	S142	Grapite et Îles d’or sur film de carbone troué
Grilles de carbone Holey	Quantifoil Micro Tools GmbH ou C-flat		R2/2 300 Cu
mesh Boîtes de grille cryogénique	Plano GmbH	160-42	Boîtes métalliques alternatives faites maison
Potter	Sigma-Aldrich	P7984
Blender	Waring	8011S
Broyeur à billes de verre - batteur de billes	BioSpec Produits	1107900-105	Y compris billes de 0,5 mm
	Homogénéisateur à roulement à billes (Balch)	Centrifugeuse Thermo
	Scientific	46915	Sorvall RC6+
Appareil à décharge luminescente	Bal-Tec A.G.	CTA 010
Appareil de vitrification de grille	FEI, Gatan ou Leica		Piston alternatif fait maison
Microscope électronique	à transmission FEI ou Jeol		300 keV
Détecteur d’électrons direct	Gatan	K2 sommet	4k x 4k pixels, mode compté
Dispositif à couplage de charge (CCD)	Gatan	US4000	4k x 4k pixels (alternative au détecteur d’électrons direct))
Filtre énergétique	Gatan ou Jeol
Software
Logiciel d’acquisition d’images	Gatan
Logiciel d’acquisition de tomogrammes	Gatan, FEI, USCF ou UC-Boulder		4 alternatives
logiciel de traitement de tomogramme	FEI, UCSF ou UC-Boulder		3
alternativesLogiciel de calcul de la moyenne des sous-tomogrammes	UC-Boulder ou Université de Bâle		2 alternatives
Logiciel de visualisation de tomogramme	UC-Boulder, FEI ou Université de l’Utah		3 alternatives
Logiciel de visualisation Plugin de logiciel de visualisation	Goethe		http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/
Logiciel de visualisation	de structure UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Logiciel de calcul numérique	MathWorks		http://www.mathworks.de/academia/