Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Résumé

Nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique, lipides nanotechnologies, et l'analyse de la structure appliquée pour résoudre la structure membranaire des deux formes de FVIII hautement homologues: les droits et les porcins. La méthodologie développée dans notre laboratoire à organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite.

Résumé

Cryo-microscopie électronique (cryo-ME) ¹ est une approche puissante pour étudier la structure fonctionnelle des protéines et complexes dans un environnement hydraté de l'Etat et de la membrane ^2.

Le facteur de coagulation VIII (FVIII) ³ est une glycoprotéine du plasma sanguin multi-domaines. Défaut ou l'insuffisance de facteur VIII est la cause pour le type d'hémophilie A - un trouble de saignement grave. Lors de l'activation protéolytique du FVIII se lie à la sérine protéase du facteur IXa sur la membrane plaquettaire chargée négativement, ce qui est essentiel pour la coagulation sanguine normale ^4. Malgré le rôle essentiel dans la coagulation FVIII joue, des informations structurelles pour son état ​​membranaire est incomplète ^5. Recombinant concentré de facteur VIII est le médicament le plus efficace contre le type de l'hémophilie A et disponibles dans le commerce FVIII peut être exprimée comme humaine ou porcine, les deux complexes fonctionnels formant avec le facteur humain IX ^6,7. "> Dans cette étude, nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique (cryo-ME), lipides nanotechnologie et de la structure d'analyse appliquée pour résoudre la structure de deux formes de FVIII hautement homologues membranaire. Humain et porcin La méthodologie développée dans notre laboratoire d'organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite. Les résultats représentatifs montrent que notre approche est suffisamment sensible pour définir les différences dans l'organisation hélicoïdale entre les deux fortement homologue en séquence (identité de séquence de 86% ) des protéines. protocoles détaillés pour l'organisation hélicoïdale, Cryo-EM et la tomographie électronique (ET) d'acquisition de données sont donnés. bidimensionnel (2D) et en trois dimensions (3D) analyse de la structure appliquées pour obtenir les reconstructions 3D humaine et porcine FVIII-LNT est discutée. Les structures humaines et porcines FVIII-LNT présentés montrent le potentiel de la méthodologie proposée pour Calculate l'organisation fonctionnelle, liée à la membrane de la coagulation sanguine facteur VIII à haute résolution.

Introduction

La coagulation du sang de facteur VIII (FVIII) est une grande glycoprotéine de 2332 acides aminés organisés en six domaines: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3. Lors de l'activation de la thrombine FVIII agit comme cofacteur pour le facteur IXa dans le complexe tenase liée à la membrane. La liaison de FVIII activé (FVIIIa) pour FIXa d'une manière à la membrane augmente en fonction FIXa efficacité protéolytique plus de 10 ⁵ fois, ce qui est critique pour l'efficacité de coagulation de sang ^4. Malgré le rôle important dans la coagulation FVIII joue et la formation du complexe tenase, la structure de FVIII membranaire fonctionnel est encore ....

Protocole

1. Préparation de l'échantillon

1. l'échange de tampon FVIII humain BDD-FVIII porcin et ^{14 BDD-15} contre du tampon HBS-Ca (20 mM d'HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de _CaCl2, pH = 7,4) et on concentre à 1,2 mg / ml. Conserver la solution de protéine à -80 ° C.
2. Préparer nanotubes lipidiques (LNT) en mélangeant galactosylcéramide (GC) et la phosphatidylsérine (PS) à 01:04 en poids / poids dans du chloroforme rapport. On évapore le chloroforme sous atmosphère d'argon et de solubiliser les lipides dans un tampon HBS à 1 mg / ml. Conserver la solution de LNT à 4 ° C.

2. Cryo-microscopie éle....

Résultats

FVIII porcin recombinant humain et ont été organisés avec succès en hélice sur chargée négativement unique LNT bicouche, ressemblant à la surface des plaquettes activées. L'organisation hélicoïdale de l'humain et porcin FVIII-LNT était conforme à travers les micrographies numériques collectées (Figure 2). La LNT de contrôle et de l'humain et de tubes hélicoïdaux FVIII-LNT porcine ont été sélectionnés et segmentés avec l'interface graphique de e2helixboxer.py et des ensem.......

Discussion

Dans ce travail, une méthodologie est présentée à la différence entre les deux organisations de protéines hautement homologues membranaires: FVIII humain et porcin auto-assemblée sur des nanotubes lipidiques dans les conditions rencontrées dans le corps humain.

Dans la procédure décrite, humain et porcin FVIII sont organisées de façon hélicoïdale avec succès sur des nanotubes de lipides, qui est l'étape la plus critique. La prochaine étape cruciale est de cons.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
JEM2100 avec LaB6	JEOL Ltd.	Le JEM-2100	fonctionnait à 200 kV
avec le logiciel TEMCON	JEOL Ltd.
Gatan626 Porte-cryo-porte	Gatan, Inc.	626.DH	refroidi à -175 ° ; C
avec unité de contrôle de température	Gatan, Inc.
Caméra CCD Gatan 4K x 4K	Gatan, Inc.	US4000	4 096 x 4 096 pixels à 15 &mu ; Résolution physique m/pixel
Nettoyeur plasma Solarus Model 950	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Grille en cuivre de 300 mailles de 3 mm revêtue de carbone	Ted Pella	01821	nettoyée au plasma pendant 10 secondes sur haute puissance
Quantifoil R2/2 300 mailles	Microscopie électronique Sciences	Q225-CR2	Grilles de Cu de 300 mailles revêtues de carbone avec trous de 2 mm de diamètre.
Acétate d’uranyle dihydraté	Ted Pella	19481	solution à 1 %,
céramide de galactosyle	Avanti Polar Lipids Inc.
Dioleoyl-sn-glycéro-phospho-L-sérine	Avanti Polar Lipids Inc.
logiciel EM Micrographie numérique	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	téléchargement		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/  ;
EM software Spider	téléchargement		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	téléchargement		Programmes disponibles auprès de Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	téléchargement gratuit		http://bio3d.colorado.edu/imod/  ;
EM software (SerialEM)	téléchargement		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	téléchargement		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

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