L'impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l'aide d'un flux continu Microspotter

Résumé

Cette technologie d’impression microfluidique 3D imprime des réseaux de cellules sur des surfaces immergées. Nous décrivons comment des réseaux de cellules sont délivrés de manière microfluidique dans des cellules d’écoulement 3D sur des surfaces immergées. En imprimant sur des surfaces immergées, des microréseaux cellulaires ont été produits qui permettent le dépistage de médicaments et l’évaluation de la cytotoxicité dans une multitude de domaines.

Résumé

L’impression de cellules pour des applications de puces à ADN présente des défis importants, notamment le problème de maintenir un phénotype cellulaire physiologiquement pertinent après l’impression, une mauvaise organisation et distribution des cellules souhaitées et l’incapacité à délivrer des médicaments et/ou des nutriments dans des zones ciblées de la puce. Notre technologie d’impression microfluidique 3D est capable de sceller et d’imprimer des réseaux de cellules sur des surfaces immergées de manière automatisée et multiplexée. La conception de la fluidique 3D du réseau de cellules microfluidiques (MFCA) permet d’abaisser la pointe de la tête d’impression dans un puits ou un plat rempli de liquide et de la compresser contre une surface pour former un joint. L’embout en silicone souple de la tête d’impression se comporte comme un joint d’étanchéité et est capable de former un joint réversible en appliquant une pression ou en reculant. D’autres technologies d’impression de cellules, telles que les imprimantes à broche ou à jet d’encre, ne peuvent pas imprimer dans des applications immergées. L’impression de surface submergée est essentielle pour maintenir les phénotypes des cellules et pour surveiller ces cellules sur une surface sans perturber les caractéristiques de surface du matériau. En imprimant sur des surfaces immergées, des microréseaux cellulaires sont produits qui permettent le dépistage de médicaments et l’évaluation de la cytotoxicité dans une multitude de domaines, notamment le cancer, le diabète, l’inflammation, les infections et les maladies cardiovasculaires.

Introduction

Les progrès récents dans l'industrie pharmaceutique ont conduit à un intérêt accru pour l'aide puces cellulaires dans le processus de découverte de médicaments pour le dépistage des drogues et de l'analyse cytotoxicological ^1,2,3. Le développement de tests in vitro à haut débit et les méthodes de dépistage à l'aide de puces à cellules devrait faciliter le développement rapide et rentable de candidats-médicaments ainsi que l'avance la compréhension fondamentale de la cellule ^1,4. L'approche traditionnelle de dépistage avec des cellules utilise des plates-formes et de plaques conventionnelles; Cependant cette approche est limitée en raison du coût élevé, le débit limité, et la capacité limitée d'informations quantitatives sur la fonction des cellules ^1,5. En raison de ces limitations, la recherche dans les technologies de puces à ADN cellulaire est en plein essor pour la caractérisation moléculaire biologique, l'ingénierie tissulaire, et le dépistage de drogue ^1,6. Les avantages de puces cellulaires comprennent l'utilisation réduite de l'échantillon, des effets minimes dephénotype cellulaire hétérogénéité masquage des informations, et surtout la possibilité d'automatiser des tests pour d'autres applications à haut débit ^1,7,8.

L'industrie pharmaceutique utilise actuellement à haut débit des essais de criblage à base de cellules avec 2D cultures monocouches de cellules pour le criblage de médicaments dans des plaques de microtitration ^9. Cellules de multiplexage dans les puits de plaques de microtitration offre la possibilité pour un débit plus élevé avec des options d'expérimentation uniques. En outre, les technologies actuelles de microarrays cellulaires permettent de sécher les cellules, qui pourrait modifier radicalement le phénotype des cellules in vivo à partir de ^10,11. Afin de surmonter ces problèmes, le MFCA a été conçu et est représenté sur la figure 1. La conception de la fluidique MFCA 3D permet à la pointe de la tête d'impression sur la figure 1 pour être descendu dans un bain et comprimé contre une surface pour former un joint. La pointe en silicone souple de la tête d'impression se comporte comme unjoint d'étanchéité et forme un joint réversible. La technologie MFCA est particulièrement bien adapté pour l'interface avec les surfaces immergées, qui est nécessaire à la fois pour les cultures de cellules et des systèmes de découpe du tissu, et il est difficile, voire impossible, avec la plupart des autres approches. Pins ou l'impression à jet d'encre ne fonctionnera pas, et des dispositifs microfluidiques 2D ne sont pas adaptés pour le dépôt ou l'interfaçage avec les grands réseaux de points discrets. En outre, par la miniaturisation et la localisation de l'expérience - la puce à ADN cellulaire - la MFCA surmonte les problèmes majeurs associés à haut débit avec des essais de criblage à base de cellules.

Le CFM utilise des réseaux de canaux 3D à vélo de petits échantillons de fluide de volume sur les emplacements ponctuels microscopiques sur une surface ^12,13. En imprimant avec écoulement, des biomolécules, des cellules, et d'autres réactifs sont maintenus dans un milieu liquide pendant tout le processus d'impression, ce qui permet l'impression des biomolécules et des cellules sensibles sans exposition à l'air, ce qui empêche les techniques d'impression actuelles de la cellule. Il est également possible d'imprimer directement à partir d'un matériau brut comme hybridome ou surnageants fournis il ya un mécanisme de capture sur la surface du tableau. L'objectif de ce manuscrit est d'expliquer en détail l'impression submergé de deux types de cellules sur une surface.

Protocole

1. Culture cellulaire Préparation

1. Stocker les stocks de cellules NIH/3T3 dans l'azote liquide jusqu'à utilisation.
2. Préparer un milieu complet pour cellules NIH/3T3 à l'aide du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 10 mM de tampon HEPES, 50 unités / ml de pénicilline, et 50 pg / ml de streptomycine.
3. Décongeler les cellules pour 2-3 min dans un bain d'eau sous agitation à 37 ° C.
4. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu complet et centrifuger à 1500 g pendant 3 min.
5. Retirer le surnageant de cellule, sans perturber le culot cellulaire.
6. Remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu et compter les cellules en utilisant un hématimètre.
   1. Retirer 10 pi de la suspension cellulaire et le placer dans un tube à centrifuger de 0,5 ml.
   2. Ajouter 10 ul de bleu trypan à la suspension de cellules et les mélanger avec le bout de la pipette.
   3. Introduire à la pipette 10 ul de cellules colorées dans une chambre d'hémocytomètre.
   4. Compter les cellules en hématimètre à 10xgrossissement.
      1. Compter les cellules vivantes (petites boules blanches) pour 4 des 9 grands carrés. Compter que les cellules vivantes qui ne semblent pas bleu foncé de la tache bleu Trypan.
      2. Calculer le nombre moyen de cellules par grande place, résultant du nombre de cellules x 10 ⁴ cellules / ml dans la suspension de cellules d'origine.
      3. cellules de semences à une densité de 1 x 10 ⁵ cellules / ml avec un total de 5 ml dans chaque flacon T25.
   5. Culture de cellules à entre 70% et 80% de confluence avant commençant expériences. Actualiser les médias tous les 2-3 jours ou au besoin.

2. Impression Préparation de la surface

1. Marquer un rectangle avec le marqueur sur le fond d'une culture traitée du tissu polystyrène (TCTPS) 12 de la plaque ainsi la taille de la tête d'impression (7 mm x 19 mm).
2. Ajouter 50 ul de sérum de veau foetal dans la zone rectangulaire et l'étaler sur toute la région de la pointe.
3. Laissez la boîte de Pétridans un stérile biosécurité capot O / N pour permettre au lieu de sérum sécher complètement. Ces plaques doivent être préparés à pas plus de 2 jours avant l'utilisation.

3. Impression immergé

1. Rincer la tête d'impression avec de l'eau distillée.
   1. Remplissez une boîte de Pétri de 60 mm avec de l'eau distillée et ancrer la tête d'impression sur la surface.
   2. Couler de l'eau distillée à travers chacune des lignes pendant 2 minutes à 150 pl / min en utilisant une pompe pneumatique.
   3. Jeter l'eau de la boîte de Pétri et le remplir avec de l'eau propre.
   4. Déplacez la tête d'impression de haut en bas dans l'eau 3 fois.
2. Ancrer le centre de la tête d'impression sur la place de sérum revêtue de la plaque 12 et pré-établi.
3. Amorcer le tête d'impression avec les médias complets pré-chauffées, 300 pl par canal.
4. Imprimer des cellules en suspension à une concentration de 50 000 cellules / ml sur la surface et 60 ul / min, 100 ul par canal.
5. Placez la tête d'impression, à gauche amarré contre lasurface, et le collecteur dans un incubateur de culture cellulaire défini à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 2 heures.
6. Après l'incubation de 2 heures, retirer la tête d'impression et placez le couvercle sur la boîte de culture. Le moment où la tête d'impression retirée est considéré comme le point de temps 0 h.

4. Portable standard Culture

1. Ajouter 1 ml de milieu préchauffées à une de la plaque TCTPS 12 puits de sérum repéré préparé à l'étape 2.
2. Prélever 1 ml de la suspension cellulaire restant de l'étape 2 à la pipette dans un seul puits d'une 12 bien TCTPS plaque. Ceci va produire une culture contenant 50 000 cellules dans le plat.
3. Placer la plaque de culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 heures.
4. Après l'incubation de 2 h commencer le chronométrage; la cohérence entre les échantillons imprimés et semis, cela est considéré comme le point de temps 0 h.

5. Culture Visualisation

1. Après 0, 2, 24, et 48 h cellules de prendre de chacune des deux méthodes described ci-dessus et de l'image en utilisant un microscope inversé standard.
   1. Colorer les cellules en utilisant l'iodure de propidium, un colorant fluorescent rouge qui est seulement incorporée dans le noyau des cellules mortes.
      1. Rincer délicatement les cellules 3 fois avec 1 ml de tampon phosphate salin avec le calcium et le magnésium (PBS + +) pour enlever les débris.
      2. Ajouter 1 ml de PBS + + préchauffée à chaque récipient de culture.
      3. Ajouter 1 ul d'une solution d'iodure de propidium stock (1 mg / ml) pour chaque récipient de culture.
      4. Incuber les cellules colorées avec de l'iodure de propidium à 37 ° C pendant 10 min.
   2. L'image des cellules en utilisant un microscope inversé à 10x et 40x.
2. Jeter les cellules dans un container prévu appropriée.

Résultats

Les cellules NIH/3T3 de lignées cellulaires de fibroblastes ont été imprimées ou ensemencées sur une surface immergée. Les cellules ont été cultivées à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules par ml. Les cellules ont été ensemencées en utilisant des techniques de culture cellulaire classiques. Les cellules ont été imprimées à l'aide d'un grand format, douze flux de tête d'impression de la cellule où les canaux sont plus grands (~ 500 um) de la CFM utilisé pour des protéines et d'autres biomolécules. Les cellules ont...

Discussion

La technologie d'impression 3D microfluidique décrit ici est le seul à pouvoir impression microfluidically réseaux de cellules dans un liquide bien remplie, c'est à dire une surface immergée. En imprimant sur ​​les surfaces immergées, puces à cellules peuvent être produites qui maintiennent le phénotype cellulaire physiologiquement pertinente de cellules ainsi que la possibilité de multiplexer les cellules dans le fond d'un puits unique figure 4. Les résultats de cette étude montren...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microspotter à flux continu	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cellules	ATCC	CRL-1658
Dubbleco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Milieu de base pour cellules
HEPES buffer	Invitrogen	15630-080	Additif de milieu cellulaire (contrôle du pH)
Pyruvate de sodium	Invitrogen	11360-070	Additif pour milieux cellulaires
Pénicilline-streptomycine  ;	Invitrogen		Additif de milieu cellulaire
Trypan blue	Invitrogen	15250-061	Cellule de coloration pour le comptage
Hémocytomètre	Fisher	267110	Chambre cellulaire pour le comptage des cellules
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Utilisé pour le contrôle des cellules
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Utilisé pour la collecte d’images
Solution saline tamponnée au phosphate (avec du calcium et du magnésium)	Invitrogen	14040-133	Rincer les cellules avant le passage et avant la coloration avec PI
TrypLE Express  ;	Invitrogen	A12177-01	Utilisé pour retirer les cellules de la surface