Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Résumé

Nous décrivons ici un flux de travail pour analyser rapidement et collections d'images de microscopie de fluorescence à l'aide PhenoRipper, une plate-forme d'analyse d'image récemment développé explorer.

Résumé

Malgré les progrès rapides de la microscopie à haut débit, les tests basés sur l'image quantitatives posent encore des défis importants. Bien qu'une variété d'outils spécialisés d'analyse d'images sont disponibles, la plupart des workflows traditionnels à base de d'analyse d'image ont des courbes d'apprentissage (pour un réglage fin des paramètres d'analyse) et conduisent à longs délais d'exécution entre l'imagerie et l'analyse. En particulier, la segmentation de la cellule, le processus d'identification des cellules individuelles dans une image, est un obstacle majeur à cet égard.

Nous présentons ici un suppléant, sans segmentation des cellules workflow basé sur PhenoRipper, une plate-forme logicielle open-source conçu pour l'analyse et l'exploration des images de microscopie rapide. Le pipeline présentée ici est optimisé pour des images de microscopie par immunofluorescence de cultures de cellules et nécessite une intervention minimale de l'utilisateur. En une demi-heure, PhenoRipper peut analyser des données à partir d'une expérience typique de 96 puits et de générer des profils d'image. Les utilisateurs peuventalors explorer visuellement leurs données, effectuer un contrôle de la qualité de leur expérience, assurer une réponse aux perturbations et vérifier la reproductibilité de répétitions. Ceci facilite un cycle de rétroaction rapide entre l'analyse et l'expérience, ce qui est essentiel au cours de l'optimisation du dosage. Ce protocole est utile non seulement comme une première analyse de la transmission du contrôle de qualité, mais également peut être utilisée comme une solution de bout en bout, en particulier pour le criblage. Le flux de travail décrit ici échelles de grands ensembles de données tels que ceux générés par des écrans à haut débit, et a été montré à la catégorie des conditions expérimentales par phénotype précision sur une large gamme de systèmes biologiques. L'interface PhenoBrowser fournit un cadre intuitive pour explorer l'espace phénotypique et d'associer les propriétés d'image pour annotations biologiques. Dans l'ensemble, le protocole décrit ici permettra de réduire les obstacles à l'adoption analyse quantitative des écrans d'image en fonction.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, les progrès rapides de la technologie d'imagerie ont donné de nombreux laboratoires la possibilité d'effectuer la microscopie à haut débit. Le défi est maintenant passé de l'une des images à une analyse. Comment pouvons-nous caractériser, comparer, et d'explorer le torrent de phénotypes subtils complexes générées par un écran d'imagerie à haut débit typique?

Un certain nombre d'images d'analyse et de plateformes informatiques ont donné utilisateurs boîtes à outils sophistiqués ^1-3 pour extraire des informations biologiques provenant de grandes collections d'images. Pourtant, de nombreux obstacles restent importants dans l'analyse des données de écrans à base d'images à haut débit. Difficultés à choisir caractérisations appropriées des images et un réglage fin des paramètres algorithmiques (le système d'intérêt) entraînent souvent des délais d'établissement, en particulier pour les utilisateurs sans compétences d'analyse d'image. En particulier, la segmentation cellulaire, le processus d'identification de cellules individuelles dans unn l'image, est un obstacle majeur à cet égard. La segmentation peut être très sensible à des paramètres expérimentaux tels que le type de cellules, la densité cellulaire et des bio-marqueurs, et nécessite souvent l'ajustement répété pour un grand ensemble de données. Pour ces raisons, l'analyse d'image est souvent une étape terminale indépendante réalisée par des spécialistes plutôt que de faire partie intégrante du flux de travail expérimental. Cela empêche le cycle de rétroaction rapide entre l'analyse et l'expérimentation, un élément essentiel du développement de dosage.

Nous décrivons ici un autre flux de travail qui est optimisé pour haut débit de microscopie par fluorescence et évite bon nombre des difficultés mentionnées ci-dessus. À cette fin, nous faisons usage de PhenoRipper ^4, une plate-forme logicielle open-source pour l'exploration et l'analyse des images de microscopie rapide. De manière significative, PhenoRipper évite beaucoup de défis liés à la segmentation des cellules en n'essayant pas d'identifier des cellules individuelles. Au lieu de cela, PhenoRipper divise les images en pixelsblocs de taille subcellulaire et caractérise images en termes de blocs qu'ils contiennent. Plus précisément, PhenoRipper profils blocs en termes de base-colocalisation-marqueurs caractéristiques et identifie automatiquement ⁴ types de blocs les plus représentatifs dans les images d'apprentissage. PhenoRipper attribue alors à chaque bloc de type de bloc représentant le plus similaire, et finalement caractérise des images basées sur les types des blocs qu'elles contiennent.

Comparé à-cellulaires simples approches plus traditionnelles, cette approche nécessite un réglage amende minimale et l'expertise. Ainsi, les utilisateurs ne doivent régler deux paramètres: la taille de bloc et une intensité de seuil (à jeter parties non cellulaires d'une image), qui sont tous deux mis à la rétroaction graphique. Surtout, le flux de travail décrit ici a été démontré à l'échelle ⁴ facilement à beaucoup de plus grands ensembles de données, où la vitesse et le réglage amende minimale fournit grand temps et des gains de fiabilité. Dans la pratique, nous constatons que cette applicationgardon réduit le temps nécessaire à la fois pour l'installation et l'exécution de plusieurs ordres de grandeur ^4.

La sortie principale du PhenoRipper est une représentation visuelle de l'image de similitude, ce qui permet à l'utilisateur d'identifier des groupes de conditions expérimentales qui causent des cellules à afficher des phénotypes similaires. Les groupements PhenoRipper trouve généralement ont "intelligibilité biologique" comparables à ceux générés par d'autres méthodes, à base de cellules fastidieuses ^4. Dans la pratique, cela signifie que, souvent, dans une demi-heure de l'exécution d'une expérience typique de 96 puits microscopie de fluorescence, un expérimentateur sans expérience d'analyse d'image avant peut obtenir une lecture fiable de la performance de son expérience. L'expérimentateur peut alors commencer à explorer les relations entre les différentes conditions expérimentales et concernant ces relations à des phénotypes d'image.

Nous démontrons ce flux de travail ici en analysant les effetsdes médicaments dans les classes mécanistiques distinctes sur les cellules HeLa colorées pour les marqueurs d'ADN et du cytosquelette. Images de cellules traitées avec la même classe de médicaments ont été regroupés, et des images de mauvaise qualité (artefacts de coloration, sur des cellules de réflexion et ainsi de suite) sont apparus comme des valeurs aberrantes, ce qui les rend faciles à identifier et potentiellement jeter.

Bien que ce flux de travail est utile pour un grand nombre d'essais basés sur l'image, il ya clairement de nombreuses situations où une approche différente pourrait être plus informatif. Par exemple, la sortie de PhenoRipper est essentiellement une comparaison relative des motifs de fluorescence dans des conditions expérimentales. Si une caractérisation absolue d'une caractéristique spécifique d'une cellule unique est nécessaire à la place (par exemple le nombre de mouchetures dans une cellule), une seule analyse à base de cellules serait nécessaire. Néanmoins, même dans ce type de situation, PhenoRipper est susceptible de détecter des changements dans ces phénotypes unicellulaires et donc être un outil utile pour le dosage optisation.

Protocole

Une. Préparation des échantillons et d'imagerie

1. La culture cellulaire
   1. Diviser les cultures régulièrement et maintenir à 20-70% de confluence. Un jour avant l'expérience, la croissance des cellules HeLa dans du DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, voir le tableau des matériaux) et supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) et 1x pénicilline / streptomycine.
   2. Au jour de l'expérience, les cellules en croissance par division en culture (environ 50% de confluence).
   3. Laver les cellules avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), exposer à environ 2 ml de trypsine / EDTA (acide éthylène diamine) pendant quelques secondes. Aspirer excès de trypsine / EDTA et maintenir les cellules baignant dans un film mince de trypsine / EDTA dans la hotte à température ambiante pendant environ 3 min.
   4. Agiter mécaniquement flacons à deux reprises et détacher les cellules avec les médias de sérum complété. Compter les cellules et diluer à 5000 cellules/50 ul de milieu et immédiatement la plaque 50 pl / puits sur une plaque de fond de verre de 384 puits en utilisant une manipulation du liquide robot automatisé (seulement 30 biens de la plaque sont utilisés ici).
   5. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 min afin de minimiser les effets de bord dans les puits ^5. Après RT incubation, placer les plaques dans une ° C / 5% de CO ₂ incubateur à 37 pendant la nuit.
   6. Chaque médicament sera testé en double. Ajouter 25 ul de médicament dans les puits correspondants de la plaque support contenant déjà.
   7. Fixer la plaque avec une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 24 heures après un traitement médicamenteux.
2. Coloration
   Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence et d'autres colorants fluorescents qui ont été utilisées ici sont énumérés dans le tableau de matériaux.
   1. Cellules perméabilisent fixe avec 0,2% de Triton X-100 solution dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pendant 3 min, et laver avec TBST (solution saline tamponnée au Tris + Tween 20) 3x. Ajouter 5% de BSA (Bovine Serum Albumine) en solution TBST pour bloquer.
   2. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver avec du TBST 3x.
   3. Faire DILUT anticorps primaireions dans 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver 3x avec TBST.
   4. Faire dilutionin anticorps secondaire 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits.
   5. Incuber la plaque dans l'obscurité à la température ambiante pendant 2 heures puis laver deux fois avec TBST.
   6. Préparer des dilutions pour Hoechst et phalloidin (voir le tableau des matériaux) dans du PBS et ajouter 10 ul / puits.
   7. Incuber la plaque à l'obscurité pendant 30 min à température ambiante.
   8. Après 2 lavages de TBST, plaques de recouvrement en aluminium et conserver à 4 ° CO / N.
3. Imagerie
   Acquérir des images à l'aide d'un microscope à épifluorescence en utilisant un objectif 20x avec caméra 1x1 binning. Acquérir seize images pour chaque bien, pour un total de 480 images (canaux x3).

2. Analyser Images

Téléchargez et installez PhenoRipper de phenoripper.org, et lancer PhenoRipper pour commencer l'analyse des images. PhenoRipper prend actuellement en charge TIFF, PNG et JPEG et tous les autres formats pris en charge par MATLAB (logiciel de microscope prennent généralement en charge l'exportation au format TIFF).

2.1 Chargement des données

1. Il n'existe pas de convention de nommage / organisation standard pour les images de microscopie, ce qui peut rendre le chargement des images et des métadonnées à associer (c. annotation expérimentale tels que le type de traitement, bien nombre et ainsi de suite) la partie la plus difficile du flux de travail. Choisissez l'une des méthodes présentées (décrit ci-dessous).
   1. PhenoLoader: Choisissez cette option pour semi-charger automatiquement les données lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d'informations pour des images de groupe comme vous le souhaitez (par exemple B16 HeLa_Drug5-DAPI.png pourrait indiquer que l'image est de bien B16, les cellules sont traitées avec le médicament dont l'ID est 5, et l'image capture la tache de DAPI nucléaire - avec cette convention de nommage, toutes les images du puits A1 ou traités avec des médicaments 5 pourraient facilement être regroupées). L'assistantguider l'utilisateur étape par étape d'associer des métadonnées avec des groupes d'images et de définir les marqueurs de la manière suivante:
      1. Cliquez sur "Structure de fichiers" pour accéder à la fenêtre PhenoLoader.
      2. Cliquez sur "Définir le répertoire racine" pour sélectionner le répertoire contenant l'image ensemble de données. Puis filtrer les fichiers qui ne sont pas utilisés (fichiers inutilisés) pour l'analyse (en option, peut être laissé vide).
      3. Cliquez sur "Définir" marqueurs pour indiquer les biomarqueurs utilisés dans l'expérience et les associer aux images. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom de fichier qui identifie les biomarqueurs. Enfin, entrez un nom pour chaque biomarqueur.
      4. Cliquez sur "Définir métadonnées" pour associer des informations à chaque image. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom du fichier des informations d'identification de l'image (par exemple "B16" pour le nom de bien). Une fenêtre demandant un nom de groupe (par exemple, «Nousll ") apparaîtra, entrez un nom. membres du groupe extrait du fichier sera affiché sur le tableau de groupe (par exemple, la liste complète des noms et). Pour ajouter des informations supplémentaires non présentes dans le nom de fichier, cliquez sur le" (facultatif) Suivant ". Cliquez sur" Ajouter des métadonnées Groupe ", entrez le nom du groupe supplémentaire (par exemple" des médicaments ") et pour chaque valeur du groupe prédéfini (par exemple:« Eh bien »), entrez la valeur (par exemple,« Taxol ») . Il n'y a pas de limite au nombre de groupes supplémentaires qui peuvent être ajoutés.
      5. Enfin, cliquez sur "Créer MetadataFile" pour générer le fichier de métadonnées et de poursuivre l'analyse. Si un fichier de métadonnées a été généré précédemment, les étapes ci-dessus peuvent être évités en chargeant directement le fichier en utilisant l'option "Fichier de métadonnées" (décrit dans 3 ci-dessous).
   2. Modèles Expression régulière base: Les expressions régulières sont une approche standard pour les modèles correspondantdans le texte. Choisissez cette option lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d'informations pour des images de groupe et la convention de dénomination correspond à un des modèles pré-existants. Les modèles personnalisés basés sur les expressions régulières peuvent également être définis et réutilisés manuellement. Cette option avancée est recommandé uniquement pour les utilisateurs familiers avec les expressions régulières.
   3. Métadonnées Fichier: Choisissez cette option pour personnalisation ultime. Définir et charger un séparées par des virgules valeurs (CSV) contenant les noms de fichiers et les métadonnées associées à chaque image. Un exemple de format de fichier est disponible sur la partie téléchargement du site web (phenoripper.org). Il suffit de charger le fichier via l'interface pour afficher les informations qu'il contient.
2. Sélectionnez le champ de métadonnées qui définit répétitions dans l'expérience d'éviter l'échantillonnage redondant. Pour les jeux de données qui contiennent des répétitions (par exemple toutes les images dans un puits devraient être similaires), les regrouper (par exemple en bien) peut améliorperformances ove. Dans la plupart des cas, il est raisonnable de choisir l'option par défaut "au hasard (je ne sais pas)", qui sélectionne un sous-ensemble aléatoire.

2.2 Réglage Paramètres d'analyse

Cliquez sur "Définir les paramètres" pour définir les paramètres nécessaires pour traiter l'ensemble de données. Les paramètres à définir sont sur le panneau de gauche. Le panneau de droite affiche un échantillon fusionné de l'ensemble de données. Cliquez sur les flèches gauche / droite pour basculer entre les différentes images.

1. Seuil Intensité: Choisissez une valeur de seuil approprié pour identifier plus ou moins les parties cellulaires (plutôt que le fond, les régions non cellulaires) d'images. Un seuil est précalculée par PhenoRipper, mais peut être ajusté pour améliorer la mise en évidence des régions cellulaires en utilisant la barre de défilement sur le dessus de l'image. Si un seuil choisi ne fonctionne pas sur toutes les images, abaisser le seuil de façon à inclure des régions non cellulaires plutôt que de laisser tomber les régions cellulaires.
2. Bloquer Siser: Choisissez une taille de bloc appropriée (en pixels) de la grille de l'image. Blocs de taille spécifiée seront superposés sur l'image. Ajuster la taille du bloc pour obtenir une moyenne de 20-30 blocs / cellule. Pour superposer la grille sur l'image, cliquez sur la case en face du champ "Block Size".
3. Paramètres optionnels: Si les images auto-échelle ne présentent des marqueurs avec des intensités relatives souhaitées (par exemple, une couleur est saturée) ou si les marqueurs doivent être larguées à partir de l'analyse, utilisez l'option "Ajuster l'intensité du canal». Pour identifier les régions cellulaires sur un sous-ensemble de marqueurs utiliser les "canaux utilisés pour Threshold" option. Les choix par défaut des autres paramètres sont généralement suffisant, mais si nécessaire, les régler en utilisant les "Options d'analyse avancée".
4. Exécutez l'analyse en appuyant sur "PhenoRip" sur le panneau principal de l'application. PhenoRipper identifie automatiquement les types de blocs récurrents dans les images. Profils phénotypiques seront générés pourchaque image en fonction des fractions de différents types de blocs à l'intérieur.

3. Résultats Explorer

1. Explorer les relations entre les profils phénotypiques des images en utilisant le PhenoBrowser (Figure 1). L'interface PhenoBrowser se compose de quatre panneaux: le panneau en haut à gauche est une représentation graphique (nuage de points) de la relative similitude entre les différentes images / conditions, les deux panneaux sur les bons exemples d'images d'affichage de certaines conditions, et le panneau final (graphique à barres ) compare leurs profils phénotypiques.
2. "Jeter Cadres vides" en utilisant le menu "Traitement des données".
3. Supprimer les images de mauvaise qualité: Tout d'abord, pour étudier des images individuelles s'éteignent groupe dans le menu "Traitement des données". Ensuite, cliquez sur les points de aberrantes dans le nuage de points et jetez les images de faible qualité (par exemple, de se concentrer, artefact coloration).
4. Explorez les données: Décidez qui définit les métadonnées sur le terrainune unité de base de comparaison (par exemple, pour comparer les médicaments, les images ayant la même valeur du champ de métadonnées «drogue» doivent être regroupées). Réduire toutes les images avec la même valeur de ce champ de métadonnées dans un seul point de données avec "Groupe par". Par exemple, le regroupement par médicament moyenne des images au sein de chaque médicament pour obtenir un point par médicament. Le secteur abrite (ou éloignés) dans le nuage de points reflètent les conditions qui suscitent des phénotypes cellulaires similaires (ou différents). Couleur ou étiquettes des points (menu d'affichage de données) sur la base de métadonnées disponibles pour aider l'intelligibilité. L'intrigue est rotatif 3D en cliquant sur la case à cocher "tourner" et en cliquant sur le bouton gauche et en faisant glisser la souris dessus.
5. Sélectionnez deux points différents pour les comparer directement. Les panneaux d'image affiche des images échantillons pour chaque point, et le panneau graphique à barres affichent les types de blocs dont les fréquences occurrence sont les plus différents entre les deux points.
6. Lancer la clustergram dans le menu "Clustergram" pour fournir une vue plus globale de la relation entre les types de blocs et des conditions expérimentales. En regroupant les deux types et conditions bloc, cette représentation met en évidence les phénotypes cellulaires qui distinguent le mieux les groupes de conditions (figure 5).

Résultats

Ici, nous avons testé la capacité de ce flux de travail à des médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d'action. Des cellules HeLa ont été ensemencées dans 30 puits d'une plaque à 384 puits et on les colore pour l'ADN / actine / α-tubuline. Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence, et d'autres colorants fluorescents qui ont été utilisés sont listés dans le tableau de matériaux. Les puits ont été traités avec des 15 médicaments appartenant à trois ...

Discussion

Le flux de travail décrit ici permet de caractériser rapide et facile et la comparaison des images de microscopie. Nous avons d'abord montré comment ce flux de travail peut aider à l'optimisation de l'expérience, par exemple en effectuant rapidement le contrôle de la qualité sur les images de microscopie. Ensuite, nous avons démontré son potentiel pour l'analyse des données de criblage à haut débit: nous étions en mesure de médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d'action. Le regroupement...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM, haute teneur en glucose	Invitrogen	11965	Teneur élevée en glucose, L-glutamine
Marqueur Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Coloration de l’ADN, dilution 1:2 000 de 5 mg/ml
Marqueur phalloidin-Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379	Phallotoxine conjuguée, dilution 1:200
Anticorps primaire &alpha ;-tubuline	Sigma	T9026	Anticorps primaire de souris monoclonal, dilution 1:200
Antivody secondaire anti-souris TRITC	Jackson	115-025-166	Anticorps secondaires conjugués, 0,5 mg dans 1 ml de PBS + 1 ml de glycérol
d’aldostérone			utilisée : 0,2 &mu ; M
Concentration d’apicidine			utilisée : 20 &mu ; M
Concentration de colchicine			utilisée : 0,16 &mu ; M
Concentration de cortisol			utilisée : 0,2 &mu ; M
Concentration de dexaméthasone			utilisée : 0,2 &mu ; Concentration
M docétaxel			utilisée : 0,2 &mu ; Concentration M
M344			utilisée : 20 &mu ; M
MS-275			concentration utilisée : 5 &mu ; M
Concentration de nocodazole			utilisée : 0,3 &mu ; Concentration
de prednisolone			M utilisée : 0,2 &mu ; Concentration M
RU486			utilisée : 0,2 &mu ; M
Concentration Scriptaid			utilisée : 70 &mu ; M
Concentration de Taxol			utilisée : 0,3 &mu ; M
Concentration de trichostatine A			utilisée : 0,2 &mu ; M
Concentration de vinorelbine			utilisée : 0,3 &mu ; L

Concentration de