Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l'IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Summary

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l'IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l'IL-1β peut être utilisé pour mesurer l'activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l'activation par l'IL-1β expression.

Abstract

Les processus inflammatoires résultant de la sécrétion de l'interleukine (IL) -1 cytokines de la famille par les cellules immunitaires conduisent à l'inflammation locale ou systémique, le remodelage et la réparation tissulaire, et le contrôle virologique ^{1, 2.} L'interleukine-1β est un élément essentiel de la réponse immunitaire innée et contribue à éliminer les pathogènes envahisseurs, tout en empêchant l'établissement d'une infection persistante ^5.1.

Inflammasomes sont la plate-forme de signalisation clé pour l'activation de l'enzyme de conversion de l'interleukine 1 (ICE ou la caspase-1). L'inflammasome NLRP3 nécessite au moins deux signaux dans les PED pour provoquer l'IL-1β sécrétion ^6. Pro-IL-1β expression de la protéine est limitée dans les cellules au repos; par conséquent, un signal d'amorçage est nécessaire pour l'IL-1β transcription et l'expression de la protéine. Un second signal détecté par les résultats NLRP3 dans la formation de la protéine multi-NLRP3 inflammasome. La capacité des cellules dendritiques à responsabilitéd pour les signaux nécessaires pour l'IL-1β sécrétion peut être testée en utilisant une purine synthétique, R848, qui est détecté par TLR8 dans monocyte humain dérivé des cellules dendritiques (moDCs) aux cellules de premier, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec la toxine bactérienne et ionophore de potassium, la nigéricine.

Monocytes PED dérivés sont facilement produites dans la culture et fournissent beaucoup plus de cellules que des DC myéloïdes humaines purifiées. La méthode présentée ici se distingue d'autres dosages de inflammasome en ce qu 'il utilise en humaine in vitro, à la place de la souris dérivée, DCs permettant ainsi l'étude de l'inflammasome dans la maladie humaine et l'infection.

Introduction

Activation du système immunitaire inné est nécessaire pour orienter les réponses immunitaires adaptatives cours de l'infection, la maladie et la vaccination ^7. Les cellules dendritiques sont le plus puissant antigène présentant des cellules du système immunitaire inné; ils sont spécialisés pour l'absorption des antigènes, la migration vers les ganglions lymphatiques, et l'activation des naïfs CD4 ⁺ et CD8 ⁺ cytolytiques des cellules T ^8-10. Pour activer la détection rapide des agents pathogènes du système immunitaire inné utilise de nombreuses lignées germinales codé reconnaissance de formes récepteurs (PRR) qui....

Protocol

Déclaration d'éthique: les échantillons de recherche sont obtenus et stockés pour la recherche avec le consentement des donateurs. Tous les échantillons doivent être codées ou rendues anonymes avant de les utiliser. Ce protocole suit les lignes directrices de notre comité d'examen institutionnel.

1. Différenciation des droits de périphériques monocytes sanguins dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes.

Remarque: couches leucocytaires humaines servent comme source de cellules du sang périphérique (CMSP) humaines et ont été obtenues à partir du Centre de New York Blood (New York, NY). Les donne....

Results

Ces techniques mesurent TLR8 amorçage avec R848. Coloration des cytokines intracellulaires pour la pro-IL-1β permet de microscopie et AAAF lectures du CD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. Les deux techniques peuvent être quantifiés par rapport à une non apprêté, ou de repos, de contrôle de cellules ainsi que d'un contrôle isotypique (figures 1 et 2). Pour cent des cellules pro-IL-1β ⁺ coloration est multiplié par la moyenne géométrique de cette population de fournir l'intensité de fluo.......

Discussion

Cytokines inflammatoires font partie intégrante de pilotage de la réponse immunitaire innée et adaptative pour combattre l'infection virale. IL-1β sécrétée a été démontré que l'augmentation lors de l'infection d'influenza ^{3, 43, 44.} Les mécanismes précis par lequel ces cytokines sont traitées en réponse à la reconnaissance du virus dans les cellules dendritiques humaines sont pas entièrement comprises. Kits d'isolement DC myéloïdes sont coûteux et fastidieux. kits d'isolement et FAC tr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IL-4	R& D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	Nous acquérons cet article par l’intermédiaire de notre pharmacie locale avec une ordonnance
RPMI 1640 avec L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Cellules mononucléées du sang périphérique	New York Blood Center		Les PBMC ont été isolés du sang de donneurs sains
12 plaques de culture tissulaire bien	Sigma-Aldrich	3516
96 plaques de culture tissulaire à fond rond	Sigma-Aldrich	3799
&alpha ;-IL-1&beta ;-FITC	R& D	IC201F
FITC contrôle isotype	Miltenyi Biotec	130-092-213
&alpha ;-&beta ;-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
&alpha ;-IL-1&beta ;	R& D	mab201
Membrane PVDF Immobilon-FL	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % gel de polycrylamide	Bio Rad	161-1159
Tampon d’échantillon Laemmli	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30 % solution stérile/filtrée
PFA	Microscopie électronique Sciences	15710	16 % solution
Kit de réseau de cytokines inflammatoires humaines	BD	551811
Nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
&alpha ;-CD14	BD	340436
&beta ;-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			Réserve sur place
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Bouchon de filtre, volume de travail de 70 ml, 30/Cs	Thermo 159933
20 &mu ; M Unités de filtration stériles jetables	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
Chèvre &alpha ;-souris IRDye 800CW	Licor	926-32210
Âne &alpha ;-lapin IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolore large gamme échelle protéique	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Méthanol - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
Récipient en polystyrène à 8 chambres Lame de verre traitée pour culture tissulaire	BD Falcon 354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707