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Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

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DOI :

10.3791/51285

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21 février 2014

 , 
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Dans cet article

Résumé

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Résumé

L'œstrogène joue un rôle vital dans le développement de la glande mammaire et la progression du cancer du sein. Il assure la médiation de la fonction de liaison à et activation des récepteurs des oestrogènes (RE), ERa et ERß,. ERa est souvent régulé à la hausse dans le cancer du sein et entraîne la prolifération de cellules cancéreuses du sein. Les salles d'urgence fonctionnent comme des facteurs de transcription et réguler l'expression des gènes. Considérant que le règlement de ERa de gènes codant pour des protéines est bien établi, la réglementation des non codantes microRNA (miRNA) est moins exploré. miARN jouent un rôle majeur dans la régulation post-transcriptionnelle de gènes, en inhibant leur traduction ou leur dégradation de l'ARNm. miARN peuvent fonctionner comme des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur et sont également biomarqueurs prometteurs. Parmi les essais de miRNA disponibles, puces à ADN et en temps réel la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) ont été largement utilisés pour détecter et quantifier les niveaux de miARN. Pour identifier les miARN réglementés par la signalisation des oestrogènes dans le cancer du sein, eeir expression dans des lignées cellulaires de cancer du sein ERa-positives ont été comparés avant et après activation à l'aide des œstrogènes à la fois les microarrays μParaflo-microfluidiques et des sondes marquées double-matrices de faible densité. Les résultats ont été validés à l'aide des analyses qPCR spécifiques, en appliquant à la fois cyanine à base de colorants et double étiqueté chimie à base de sondes. En outre, une analyse temps-points a été utilisée pour identifier des règlements au fil du temps. Avantages de l'approche d'analyse des miRNA utilisée dans cette étude est qu'elle permet un dépistage rapide de la réglementation maturité miRNA dans de nombreux échantillons, même avec des quantités d'échantillons limités. La mise en page, y compris les conditions spécifiques pour la culture cellulaire et le traitement d'oestrogène, répétitions biologiques et techniques, et un dépistage à grande échelle suivie confirmations en profondeur en utilisant des techniques distinctes, assure une détection robuste de réglementation miARN, et élimine les faux positifs et d'autres artefacts. Cependant, miARN mutés ou inconnus, ou des règlements à la leve de transcription primaire et précurseurl, ne sera pas détecté. La méthode présentée ici représente une enquête approfondie de la réglementation des miRNA oestrogène médiation.

Introduction

L'œstrogène est une hormone qui est important lors du développement de la glande mammaire. L'œstrogène joue également un rôle important dans le développement, la maintenance, le risque et le traitement du cancer du sein 1. L'œstrogène exerce sa fonction en se liant à des RE, qui sont des facteurs de transcription et réguler les gènes cibles spécifiques. Sur les deux variantes du récepteur, ERa est essentiel pour l'oestrogène-dépendante la prolifération des cellules du cancer du sein. La plupart des cancers du sein sont ERa-positif et dépend de l'oestrogène pour la croissance. Cela a rendu la signalisation des oestrogènes et ERa une cible pour le traitement de l'hormone-récepteur de cancer du sein positif. Comprendre le mécanisme sous-jacent de ERa est important d'améliorer les résultats du traitement, vaincre la résistance au traitement, et de comprendre comment le cancer du sein se développe.

miARN jouent un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires en raison de leur impact majeur dans la régulation génique post-transcriptionnelle. miARN sont 19-24 nucléotides courte, simple brin, Non codantes des ARN qui sont d'abord transcrits par l'ARN polymérase II dans les transcriptions primaires miARN (pri-miARN). Elles sont traitées dans le noyau par Drosha en précurseurs-miARN courts en épingle à cheveux (pré-miARN) et ensuite traitées par Dicer et séparés en simples brins pour former miARN matures dans le cytoplasme. Les miARN matures simple brin sont transférés à des protéines Argonaute pour former un complexe RISC. Ensuite, les miARN peuvent s'hybrider aux régions 3 'non traduites (3' UTR) d'un ARNm cible, conduisant à la régulation post-transcriptionnelle par blocage de la traduction ou dégrader les ARNm cible 2.

En raison du rôle important que jouent les œstrogènes et miARN dans la progression tumorale, l'identification des miARN associés à la signalisation des oestrogènes normale ou perturbée est important afin d'améliorer notre compréhension du développement et de l'amélioration du traitement du cancer du sein. Bien qu'il y ait une bonne compréhension de la façon dont ERa régule les gènes codant pour des protéines, l'extensionet les détails de la réglementation non codantes de l'ARN reste à une enquête approfondie. Les premières études visant à élucider la réglementation ERa de miARN dans les lignes cancers du sein de cellules ont donné des résultats contradictoires, même lorsque la même lignée cellulaire a été analysé 3-6. Cela peut être le résultat de traitements différents, les variations biologiques, l'utilisation de différentes techniques, et le fait que la petite taille du miARN rendre difficile à analyser. Ici, un protocole qui contrôle les variations et les artefacts méthode est décrite.

Pour identifier les miARN sont régies par les œstrogènes, le profilage d'un modèle de cancer du sein bien défini de l'activité ERa est une première étape. Plusieurs lignées cellulaires ont été générées à partir de tumeurs de cancer du sein humain ERa-positives, qui sont dépendants de l'œstrogène similaire à la majorité des cancers du sein cliniques. Les propriétés moléculaires des deux de ces lignées cellulaires, T47D et MCF7, y compris l'expression de ERa et sa cible en aval,le récepteur d'hormone de progestérone (PR), un manque d'expression de récepteur membranaire HER2, en même temps que l'expression de gènes de différenciation oestrogène-sensibles et luminales-épithéliale, les rendent appropriés en tant que modèles pour le sous-type luminal des tumeurs du sein 7-10. 17β-estradiol (E2) est la forme dominante de l'oestrogène, et les concentrations et les points de temps pour l'activation de la transcription optimale de ERa ont été caractérisées dans plusieurs études. Dans ce protocole, 10 nM traitement E2 pendant 24 heures est utilisé et T47D et MCF7 comme modèles pour l'activité ERa dans les cellules de cancer du sein 1. En outre, les règlements de miRNA dépendant du temps peuvent être analysés en particulier dans un intervalle de temps, par exemple de 1-72 h.

Deuxièmement, l'analyse des miRNA a des défis distincts, en partie en raison de leurs tailles courtes. miARN ne sont pas bien conservés dans la préparation de l'ARN total lorsque réguliers guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol précipitations d'ARN sont effectuées, ou lorsque rpurifications de colonne Andard sont utilisés. Précautions particulières doivent être prises pour maintenir ou enrichir pour la plus petite fraction d'ARN. En augmentant le volume d'isopropanol, l'abaissement de la température avant la centrifugation (80 ° C), et en omettant le lavage à l'éthanol à 70%, la rétention des miARN peut être accrue au cours de la précipitation. Ou, colonnes et des tampons spécifiques pour une préparation de haute qualité et robuste de l'ARN total contenant miARN peuvent être utilisés. Aussi pour l'analyse elle-même, leurs tailles courtes créent des défis. Pour le dépistage du miRNA génome, il ya trois miARN communes profilage techniques au choix: microarrays, qPCR, et le séquençage de prochaine génération. Chaque technique peut être réalisée en utilisant de multiples plates-formes différentes, et les différentes préparations d'échantillons sont requis, chacun avec des risques d'introduction d'artefacts. En miRNA microréseau, une diapositive est repéré ou synthétisé avec des milliers d'oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont utilisés en tant que sondes, et chacune de la sondes est conçu pour s'hybrider à une séquence de miARN particulier. La préparation des échantillons pour les microarrays, telle que pratiquée dans cette étude, enrichit d'abord pour miARN puis introduit Cy5 et Cy3 étiquetage sur les miARN. Biopuces donne l'occasion d'observer les niveaux d'expression relatifs d'un grand nombre de gènes simultanément, c'est rapide et appropriée pour le dépistage d'un grand nombre d'échantillons, mais ne peut analyser les séquences présentes sur la puce et par exemple ne pas détecter les changements dans inconnu ou muté miARN. analyse de puces à ADN telle que pratiquée dans ce protocole exige également des quantités relativement importantes, environ 5 ug, de l'ARN total par échantillon pour analyse. De basse densité qPCR miRNA profilage nécessite moins de matière (700 ng / échantillon et reproduire), et permet la détection et la quantification de miARN. niveaux de transcription peuvent être déterminées, et la quantité peut être une valeur absolue ou une quantité relative. analyse qPCR nécessite d'abord la conversion des miRNA en ADNc, ici en utilisant une boucleamorce pour chaque miARN spécifiques assurant l'analyse de seulement mûrir miARN. Cela génère un modèle plus qui peuvent être amplifiée en utilisant une amorce sens spécifique de miARN et une amorce universelle inverse complémentaire de la séquence en boucle, et peut abriter l'insertion d'une sonde à double spécificité pour étiqueté. qPCR peut être utilisée dans un format à faible densité où des centaines de miARN peuvent être détectées en parallèle en utilisant une ou plusieurs plaques de 384 puits avec différentes paires d'amorces dans chaque puits 11. Séquençage de nouvelle génération, d'autre part, est la seule de ces techniques qui permettent à la découverte de nouvelles, miARN mutées ou modifiées, comme tous les ARN dans un échantillon peuvent être séquencés 11. Cette technique, cependant, nécessite de multiples étapes pour enrichir petits ARN et de produire une petite bibliothèque d'ARN en utilisant plusieurs étapes de ligature des lieurs et des purifications ultérieures avec risques accrus de moduler les niveaux d'expression relatifs entre les échantillons. Elle exige également bioinformati importantsanalyse cs. Compte tenu des diverses techniques de profilage miRNA, la technique la plus appropriée dépend des applications. Les puces à ADN sont les plus appropriés lorsque le matériel est relativement abondante et l'intérêt est de définir l'expression différentielle des miARN déjà connus. Faible densité des réseaux qPCR sont les plus appropriés quand une quantité limitée de l'échantillon est disponible et une sensibilité élevée de miARN peu exprimé est nécessaire. Le séquençage est le mieux adapté pour l'analyse des miARN inconnus, des mutants ou des différentes isoformes d'une miARN est nécessaire.

Dans l'étude de miARN régulés par les œstrogènes dans le cancer du sein, deux modèles de lignées cellulaires sont utilisés, T47D et MCF7, où de grandes quantités d'ARN sont facilement disponibles. Chaque lignée cellulaire a été analysée dans des cultures de cellules répliquées à l'aide de différents passages, chacun dans réplicats techniques de traitement. Cela permet la détection robuste de manière reproductible, miARN ERa réglementés. Les niveaux relatifs d'expression des miRNA ont été comparées en utilisant deux miARN microarray etSondes double labellisés - tableaux de faible densité (DLP-LDA) et validé les résultats de qPCR spécifique utilisant à la fois cyanine et de la chimie de DLP. règlements de miARN ont ensuite été analysées plus loin dans les séries chronologiques de définir leur régulation exacte dans le temps, ce qui peut aider à différencier des variations aléatoires ou circadiens de la réglementation induite par les oestrogènes, et indiquer des effets primaires de effets secondaires. Comparaisons bioinformatiques des études de la chromatine liaison de ERa peuvent favoriser l'aide à la différenciation de l'enseignement primaire par rapport à des effets secondaires. L'analyse a donné lieu à une évaluation fiable de la réglementation miARN où il a pu être établi que, après traitement de l'E2 24 h transcriptions codant pour des protéines ont été facilement réglementés mais miARN matures n'ont pas été affectées 1. Cependant, il est possible que les miARN sont réglementés au plus tard points dans le temps, comme le montre l'analyse des séries chronologiques des miARN sélectionnés 1. Les détails doivent encore être explorées et le protocole présenté ici fournit une robust moyen d'étudier la régulation hormonale des miARN matures dans des lignées cellulaires de cancer du sein.

Protocole

Une. Préparation de la Cellule Culture, des Médias

  1. Pour T47D ligne de milieux de culture cellulaire:
    1. Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 500 ml de F12 [DMEM/F12 (1:1)] dans un autoclave de 1 L bouteille.
    2. Ajouter 50 ml de sérum de veau fœtal (ce qui rend 5% de FBS), puis 10 ml de pénicilline streptomycine (cela fait 1% PEST). Mélanger le contenu complètement.
    3. Stocker à 4 ° C.
  2. Pour MCF7 ligne de milieux de culture cellulaire:
    1. Mélanger 500 ml de DMEM avec 25 ml de FBS (5% de FBS), puis 5 ml de pénicilline streptomycine (1% PEST).
    2. Stocker à 4 ° C.
    3. Pour le sérum réduit milieux de culture:
      1. Pour T47D: Mélanger 500 ml de phénol DMEM sans rouge de 500 ml F12 (1:1) dans un autoclave bouteille de 1 L, et ajouter 50 ml de dextran-enduit traité au charbon (CDC) FBS 5% DCC-FBS. Faire une bouteille séparée avec 5 ml DCC-FBS 0,5% DCC-FBS. Ensuite, ajouter 10 ml de PEST (1% PEST) pour chaque bouteille. Mélanger le contenu complètement, le stockagee à 4 ° C.
      2. Pour MCF7: Mélanger 500 ml de phénol DMEM sans rouge avec 5 ml de 100x L-glutamine (200 mM concentration finale). Ajouter 25 ml de DCC-FBS (5% de DCC-FBS). Faire une bouteille séparée avec 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Ensuite, ajoutez 5 ml de PEST (1% PEST) pour chaque bouteille. Mélanger le contenu complètement, conserver à 4 ° C.
    4. Pour une solution saline (PBS) solution tamponnée au phosphate:
      1. Remplissez un autoclave bouteille en verre de 1 L avec de l'eau ultra-pure ou de l'eau distillée.
      2. Ajouter une pastille de PBS et agiter de temps en temps jusqu'à ce que la tablette soit dissous.
      3. Autoclave solution PBS et stocker à température ambiante.
    5. Préparation des stocks de ligands:
      1. Préparer une solution stock de 100 mM de E2 en dissolvant 2,72 mg de 17β-estradiol dans l'éthanol 100 pi ou de DMSO dans un tube de 1,5 ml microtubes stériles, et le contenu mélanger doucement. Centrifuger brièvement et faire des dilutions en série (1:10) pour donner 10 mM, 1 mM, et 0,1 mM concentrations à l'aide du solvant. Conservez toutes les solutions d'E2 à -20 ° C.
      2. Préparer une solution stock de 100 mM de ICI en dissolvant 6,07 mg d'ICI 182,780 dans 100 ul EtOH ou DMSO dans un tube de 1,5 ml microtubes stériles, et le contenu mélanger doucement. Centrifuger brièvement et faire des dilutions en série (1:10) pour donner 10 mM, 1 mM, 0,1 mM d'concentrations en utilisant le solvant. Conservez toutes les solutions d'ICI à -20 ° C.
      3. Le véhicule est le solvant (l'éthanol ou le DMSO). Placez 0,5-1 ml d'éthanol à 100% ou le DMSO dans un tube de 1,5 ml microtubes stériles et conserver à -20 ° C.

2. Culture cellulaire et traitement

Effectuez chaque traitement en plaques doubles ou triples pour les répétitions techniques. Répéter la procédure et le traitement de cellules de la culture au moyen d'un passage différent de la même lignée cellulaire, qui servirait de réplication biologique de cette lignée cellulaire. Répétez la procédure avec une lignée cellulaire différente de replicat résultats dans plus d'une lignée cellulaire. Toutes les techniques de culture cellulaire doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire.

  1. Culture cellulaire démarrage
    1. Réchauffez les médias à 37 ° C dans un bain d'eau chaude stérile.
    2. Décongeler un flacon congelé des cellules T47D ou MCF7.
    3. Nettoyer l'extérieur du flacon et une bouteille de médias avec 70% d'éthanol, puis placez les deux flacon et une bouteille dans une hotte à flux laminaire stérile.
    4. Étiqueter un flacon T-75 stérile en conséquence (dans le capot).
    5. Ajouter 12-15 ml de médias appropriés dans le ballon à l'aide d'une pipette sérologique stérile (s'assurer que la surface est complètement recouverte avec les médias).
    6. Transférer les cellules du flacon dans le ballon, et mélanger doucement.
    7. Placer ballon dans un incubateur à 37 ° C, fourni avec 5% de CO 2.
  2. Préparation des cellules pour le traitement
    1. Prendre des cellules de l'incubateur et à observer sous un microscope pour s'assurer que les cellules sont au moins 80% de confluent. Il s'agit de s'assurer qu'il ya suffisamment de cellules pour l'expérience. Transfert ballon à hotte stérile.
    2. Retirez le support de flacon à l'aide d'une pipette Pasteur stérile raccordée à un vide. Lavez délicatement les cellules attachées deux fois avec PBS.
    3. Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA chaude dans le ballon, et mettre flacon dans l'incubateur pendant 2 min. Il s'agit de rendre les cellules se détachent du flacon.
    4. Ajouter 3-4 ml de milieu chaudes appropriées dans le ballon et triturer les cellules individuelles en utilisant une pipette de 5 ml sérologique. Triturer en reprenant les cellules dans la pipette sérologique et de libérer les cellules de la pointe de la pipette placée contre le fond du flacon pour augmenter la pression. C'est pour briser les cellules à l'écart dans des cellules individuelles.
    5. Compter les cellules, par exemple en utilisant un compteur de cellules, selon le protocole du fabricant.
    6. Étiqueter les plaques de 100 mm (selon le besoin) et ajouter 10 ml de milieu aux plaques. Plate environ 2,0 x 10 6 cellules / plaque. Distribuer des cellules par GEtourbillonnant ntle les plaques.
    7. Incuber les cellules pendant 24-48 h, jusqu'à environ 80% de confluence.
    8. À 80% de confluence, laver les cellules deux fois avec du PBS, et ajouter les 5% les médias DCC-FBS appropriées. Ensuite, incuber les cellules pendant 24 h.
    9. Après 24 heures, laver les cellules deux fois avec du PBS, et ajouter les 0,5% médias DCC-FBS appropriées. Ensuite, incuber les cellules pour 48 heures supplémentaires.
  3. traitement cellulaire
    1. Après 48 h, laver les cellules deux fois avec PBS. Soyez sûr d'enlever autant de PBS que possible.
    2. Dans un tube de 15 ml conique, ajouter 10 ml de 0,5% les médias DCC-FBS appropriées. Puis, ajouter 1 pl du ligand actions de 0,1 mM (E2 ou ICI) pour une concentration finale de 10 nM. En outre, ajouter 1 pl de véhicule pour 10 ml de milieu dans un tube séparé pour l'expérience témoin.
    3. Mélanger doucement le contenu dans le tube et ajouter aux cellules de la plaque. Cela devrait être un ligand par plaque.
    4. Incuber les cellules pour le point de temps choisi (0-72 h).

3. Extraction et contrôle de la qualité de l'ARN

  1. extraction de l'ARN
    1. Après la fin du traitement pour la période de temps désirée, laver les cellules deux fois avec du PBS, puis ajouter environ 1 à 2 ml de solution de thiocyanate de guanidinium-phénol pour les cellules de la plaque. ATTENTION: solution de thiocyanate de guanidinium-phénol est toxique par contact avec la peau ou les yeux, par inhalation ou par ingestion. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et une protection des yeux / du visage, et d'utiliser une hotte.
    2. Assurez-vous que le volume des cellules est d'au plus 10% du volume de solution de thiocyanate de guanidinium-phénol, et que la plaque est recouverte avec la solution et le laisser au repos pendant 1 min. Ensuite, gratter les cellules en utilisant un grattoir en caoutchouc et transférer dans un tube à centrifuger. Les cellules peuvent être stockées dans cette solution à -80 ° C pendant plusieurs semaines.
    3. Extraire et de purifier l'ARN total de chaque traitement en utilisant la méthode du thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium suivie par une purification sur colonne de spin et de la DNaseProcédé de dégradation de l'ADN I pour des cellules animales.
    4. Après extraction, les cellules sont élués dans 60 l'eau sans RNase ul. Aliquote 1-2 ARN pi pour l'analyse de la quantification et de l'ARN de conserver à -80 ° C.
    5. Mesurer les concentrations d'ARN en utilisant 1 ul d'ARN et aspectrophotometer. Assurez-vous que il ya un vide prises avant toute mesure est effectuée. Aussi, essuyez complètement le temps spectrophotomètre de portée d'une mesure est prise. Les concentrations sont généralement présentés en ng / ul. Enregistrer les résultats montrant les concentrations d'ARN.
  2. contrôle de la qualité de l'ARN
    1. Prenez environ 100 ng d'ARN de chaque échantillon et le placer dans un tube à centrifuger.
    2. Mesurer l'intégrité de l'ARN en utilisant une Bioanalyseur. Habituellement 12 échantillons peuvent être exécutés en même temps dans un Bioanalyseur. Exécutez prend habituellement environ 25 min.
    3. Comparer les résultats avec l'échelle d'ARN de veiller à ce que l'ARN qui est bon pour l'expérience. Enregistrer et imprimer les résultats.

4. Confirmation de Treatment: qPCR des gènes codant pour des protéines

  1. synthèse d'ADNc
    1. Prenez 500 ng ou 1 pg de l'ARN total (de chaque échantillon) et mettre dans un tube de 1,5 ml. Amener le volume de chaque tube jusqu'à 10 ul avec de l'eau sans RNase.
    2. Ajouter 2 ul de 50 uM des amorces hexamères aléatoires et les tubes de chaleur à 70 ° C pendant 10 min.
    3. Transfert tubes de glace pendant 5 min.
    4. Pour chaque échantillon, ajouter 4 pi de tampon premier brin 5 x, 1 ul de DTT 0,1 M, 1 ul de dNTP 10 mM, 0,5 pl d'exposant III, et 1,5 d'eau sans RNase ul.
    5. Placer les tubes dans un bloc de 25 ° C à la chaleur ou à bain-marie pendant 10 min.
    6. tubes de transfert à un bloc thermique 46 ° C pendant 1 heure. Ensuite, les tubes de transfert à un bloc chauffant à 70 ° C pendant 15 minutes pour arrêter la réaction.
    7. Diluer l'ADNc de 5 ng / stock pi (calculé en utilisant la saisie de l'ARN total) avec de l'eau sans RNase pour les dilutions et conserver à -20 ° C.
  2. qPCR
    1. Obtenir des amorces pour les gènes de gènes d'intérêt et de référence. Amorces peuvent facilement être conçus en utilisant l'outil de conception d'amorce sur le programme Primer-BLAST du NCBI 12. Ceci génère habituellement une amorce directe et inverse pour chaque gène d'intérêt. Les amorces devraient être de 18 à 22 pb de longueur, ont une température de fusion de 52-58 ° C, ont une teneur en GC de 40 à 60%, et une longueur d'amplicon de 100 à 180 pb.
    2. Pour chaque réaction qPCR bien, ajouter 10 ng d'ADNc (2 pi de concentration des actions de l'étape 4.1.7), 1 pmol de chacune des amorces sens et antisens du gène d'intérêt (de l'étape 4.2.1), et 5 pi de 2x cyanine PCR Master Mix. La réaction de chaque puits doit avoir un volume réactionnel final de 10 ul.
    3. Assurez-vous que il ya des puits en triple pour chaque échantillon pour chaque gène (pour les répétitions techniques). Un plateau de réaction à 96 puits peut être utilisé.
    4. Sur le logiciel de système qRT-PCR, assigner le journaliste et la cible, entrez le volume de réaction, sélectionnez le comparatifméthode cycle seuil (ΔΔCt), et de définir des puits d'échantillon.
    5. Assurez-vous d'effectuer l'analyse des courbes de fusion pour toutes les courses de colorant cyanine pour confirmer l'amplification d'un fragment spécifique. Exécutez plaques en utilisant les paramètres par défaut pour la course.
    6. Enregistrer les résultats après l'exécution, et d'exporter des données (en particulier les valeurs CT vers MS Excel).
  3. l'analyse des données qPCR en utilisant la formule de ΔΔCT
    La variation de l'expression relative de l'ARNm peut être calculé comme un facteur de changement par rapport au témoin sur Excel pour chaque échantillon en utilisant les étapes suivantes:
    1. Tous les résultats exportés de la qPCR ci-dessus doivent avoir les valeurs de Ct inclus. Calculer la valeur ACt en utilisant la formule ci-dessous:
      • ACt = CT (gène cible) - CT (gène de référence)
      Ceci doit être fait pour chaque échantillon. La cible est le gène ou miRNA d'intérêt.
    2. Ensuite, calculer l'écart type total (SD) pour chaque échantillon. Première calculerle SD pour le gène de référence et ensuite calculer la SD pour le gène cible (ce qui peut être fait sur Excel en utilisant la fonction STD DEV sur les valeurs CT). Calculez ensuite le SD total pour chaque échantillon en utilisant la formule suivante:
      • SD total = (SD2 (cible) + SD2 (référence)) 1/2
    3. Calculer la ΔΔCT de chaque échantillon dans un gène (cible) par:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (traité de l'échantillon / test) - ΔΔCT (contrôle / échantillon d'étalonnage)
      L'échantillon d'étalonnage est l'échantillon non traité.
    4. Enfin, calculer les changements-pli (FC) valeurs de chaque échantillon en utilisant la formule:
      • FC = 2 ΔΔCT
      La valeur de facteur de variation de chaque échantillon donne l'expression relative du gène / miARN qui a été normalisée par rapport au gène de référence et l'échantillon de contrôle.
    5. Test t de Student peut être utilisé pour l'analyse statistique en utilisant distribution bilatérale et deux échantillons variance inégaleparameters: (P <0,001 (***) P <0,01 (**), et P <0,05 (*)). Ceci peut être réalisé sur Excel. Assurez-vous que le traitement a abouti à la réglementation des cibles connues avant de procéder à miARN profilage.

5. miRNA profilage Analyse

  1. miRNA microarray
    1. Prenez 5 ug d'ARN isolé à partir de cellules traitées avec le véhicule ou ligand, et le placer dans un tube à centrifuger. Régler le volume dans le tube de 20 pi. Chaque comparaison doit être effectuée en double ou en triple.
    2. Effectuer la puce miRNA en utilisant les échantillons d'ARN ci-dessus. les profils d'expression des miARN de puces à ADN devraient être déterminées en utilisant puce à miARN humain bicolore échantillon tableau par μParaflo microfluidique technologie des biopuces (Sanger miRBase sortie 14.0) 13.
    3. Les résultats doivent montrer miARN exprimés de manière différentielle. Considérez expressions de miRNA significatives lorsque p <0.05.p-value <0.10 peut également être considéré comme un meilleur partageanalyse nfirmatory utilisant qPCR. Envoyer cette liste de miARN pour une validation supplémentaire de qPCR.
  2. miRNA profilage: DLP-LDA
    1. Chaque échantillon doit être analysé en double ou en triple. Prenez 700 ng d'ARN total à partir de cellules traitées avec le véhicule ou ligand, et placer dans un tube à centrifuger. Régler le volume dans le tube à 3 pi.
    2. Effectuer la synthèse d'ADNc en utilisant la méthode de dosage sondes miARN double marqué et le 10x amorces de RT. Le volume total pour chaque réaction devrait être de 7,5 pi.
    3. Placer le tube de réaction dans le système Thermocycleur PCR, et définir les paramètres recommandés comme indiqué dans deux étiquetages méthode de dosage sondes miARN. Démarrez la course. Cela va générer ADNc. Notez que l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant au moins 1 semaine.
    4. Bien que la réaction RT fonctionne, retirer les plaques DLP-LDA et laisser reposer à la température ambiante. Chaque plaque de tableau contient 384 puits qui contiennent des amorces miRNA uniques et des amorces de contrôle.
    5. Take 6 pi de l'ADNc (de 5.2.3) et placer dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Ajouter 450 pi de la double sondes marquées 2x Universal PCR Master Mix et ajouter 444 de l'eau sans RNase-pi.
    6. Inversez tube d'environ six fois pour mélanger le contenu, et centrifuger brièvement.
    7. Lorsque la plaque DLP-LDA a atteint la température ambiante, charge 100 pi dans chacun des huit «Remplir port 'de la plaque. Ensuite, centrifuger la plaque de tableau.
    8. Ouvrez le système qRT-PCR et vérifier que le bloc est que pour la plaque 384 puits. Mettre en place l'exécution en utilisant le logiciel SDS. Sélectionnez quantification relative (Ct), sélectionnez le nombre de puits et le type de réseau, et de saisir la description échantillon de définir puits.
    9. Exécutez tableau en utilisant les conditions de cyclage thermique par défaut. Lorsque l'exécution est terminée, enregistrer les résultats et l'exportation vers MS Excel et enregistrer pour une analyse plus approfondie en utilisant la formule de ΔΔCT (étape 4.3).

6. Confirmation du Règlement miRNA utilisant indépendanteAnalyse qPCR

  1. Cyanine analyse qPCR
    1. amorces de conception pour l'analyse des miRNA souhaitée. Séquence du miRNA mature, ce qui équivaut à l'amorce de l'avant, peut être obtenu à partir de mirbase.org 14. Convertissez tous les «U» à «T».
    2. Préparer ADNc: Prendre 1 ug d'ARN total et le placer dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse. Suivez les instructions pour polyA tailing et la synthèse de l'ADNc premier brin de miRNA d'un protocole de synthèse d'ADNc et qRT-PCR miRNA premier brin. Diluer l'ADNc résultant (1:10) et conserver à -20 ° C.
    3. Obtenir une plaque de réaction de 96 puits.
    4. Pour chaque réaction miRNA qPCR puits, ajouter 16 ng d'ADNc polyA (étape 6.1.2), 2 pmol de chacune des amorces spécifiques de l'avant (à partir de l'étape 6.1.1) et l'amorce universelle (provenant du kit de l'étape 6.1.2 ), et 5 ul de 2x qPCR Master Mix. Le volume réactionnel final est de 10 l / puits.
    5. Assurez-vous que il ya des puits en triple pour chaque échantillon pour chaque miARN (pour les répétitions techniques). Aussi, Assurez-vous qu'un gène de référence (généralement U6 snRNA) est inclus.
    6. Sur le logiciel de système qRT-PCR, assigner le journaliste et la cible, entrez le volume de réaction, sélectionnez le cycle de seuil comparative (ΔΔCT) de la méthode, et de définir des puits d'échantillon.
    7. Exécutez plaques en utilisant les paramètres par défaut pour la course. Assurez-vous d'effectuer l'analyse des courbes de fusion pour toutes les courses de colorant cyanine. Chaque courbe de fusion devrait montrer un seul pic spécifique pour confirmer l'amplification d'un fragment spécifique. Si plus d'un pic ou pas de pic limpide sont observés, les amorces ne sont pas spécifiques et les données ne peuvent pas être utilisés.
    8. Enregistrer les résultats après l'exécution, et d'exporter des données (en particulier les valeurs CT vers MS Excel).
  2. Double étiqueté analyse sondes qPCR
    1. Prenez 10 ng de chaque ARN total, chacun dans un volume de 5 pi et le lieu dans 0,2 ml microtube.
    2. Suivez les instructions du protocole sur l'exécution de la transcription inverse (RT) en utilisant les sondes Micro double étiquetéARN transcriptase inverse Kit 15. Chaque volume total de réaction devrait être de 15 pi. Notez que pour les réactions sondes RT double labellisés, il ya des amorces spécifiques pour chaque miARN être étudiés.
    3. Placer le tube de réaction dans le système thermocycleur, et définir les paramètres selon le protocole indiqué dans l'étape 6.2.2 ci-dessus. Démarrez la course. Il devrait prendre environ 70-80 min.
    4. Après la réaction de RT, diluer l'échantillon d'ADNc dans un rapport de 1:5, et stocker tous les ADNc dans l'obscurité à -20 ° C.
    5. Obtenir une plaque de réaction de 96 puits.
    6. Pour chaque réaction miRNA qPCR bien, ajouter ce qui suit: 10 pi de sondes double labellisés 2x Universal PCR Master Mix (même réactif que l'étape 5.2.5), 7,67 ul d'eau sans RNase, 1 pl de 20 × temps réel test amorce (spécifique pour chaque miARN), et 1,33 pi de l'ADNc de l'étape 6.2.4 ci-dessus. Ce doit être un volume réactionnel final de 20 ul. Mélanger le contenu en douceur, et brièvement de la centrifugeuse.
    7. Veiller à ce que eavant sont des puits en triple pour chaque échantillon pour chaque miARN (pour les répétitions techniques). Aussi, assurez-vous qu'un gène de référence (généralement U6 snRNA) est inclus.
    8. Sur le logiciel de système qRT-PCR, assigner le journaliste (FAM) et l'extincteur (NFQ-MGB) pour chaque miARN (cible) d'intérêt, entrez volume de réaction, sélectionnez le cycle de seuil comparative (ΔΔCt) de la méthode, et de définir des puits d'échantillon.
    9. Suivez les instructions pour configurer les paramètres de la qPCR courir à partir du protocole de dosage sondes microARN double étiqueté. Ensuite, démarrez la course. Enregistrer les résultats après l'exécution, et d'exporter des données (en particulier les valeurs CT vers MS Excel).

Résultats

Une vue d'ensemble de cette approche est présentée dans la figure 1 et une comparaison entre les différents exemples de préparations et de modifications d'acides nucléiques nécessaires pour chaque technique est visualisé sur la figure 2.

La condition et l'environnement des cellules avant traitement avec une hormone est important pour déterminer les effets réels de l'hormone 16. Certains milieu et sérum contiennent des facteurs de croissance qui peuvent affecter les résultats, de sorte que les cellules sont privées de sérum afin de s'assurer que tous les effets hormonaux ont été réduits à un minimum. Par conséquent, lorsque le traitement avec E2, il ya plus de certitude que les effets observés sont E2-associés. Un facteur important est la confluence des cellules, ce qui influe sur le contact et des comportements tels que la signalisation cellule-cellule et cellule-prolifération cellulaire. Les cellules ont été autorisées à être confluentes à 80% (Figure 3A) et bien fixés pour permettre la croissance et d'éviter une perte de cellules pendant le lavage et le support subséquent change.

Les conditions pendant l'extraction et le stockage de l'ARN sont importantes pour la qualité de l'ARN et l'analyse ultérieure. Il est également connu que le nombre de cellules, la méthode d'extraction, et la teneur en GC de l'miARN peuvent affecter le rendement et la qualité des deux ARNm et 17 miARN. Ainsi, il est nécessaire de procéder à l'extraction de l'ARN dans des conditions RNase-libres et de vérifier la qualité de l'ARN avant de procéder à des expériences. Après extraction, la quantification de l'ARN donne des informations sur la concentration de l'ARN total (contenant à la fois des ARNm et miARN), qui permet l'observation de rendement. Il fournit également une représentation graphique des résultats comme on le voit sur ​​la figure 3B, ce qui permet l'observation de la pureté de l'échantillon (généralement indiquée par une crête, panneau supérieur). Mauvais rendement de l'ARN produirait pas d'absorption spécifique à 260 nm (figure 3B, panneau inférieur). Pour déterminer si l'ARN est de haute qualité, de l'ARNintégrité a été mesurée. Un certain nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) comprise entre 9-10 en sorte que l'ARN n'est pas dégradé et est d'une qualité optimale. En outre, la représentation graphique de l'ARN doit être observée, et l'ARNr 28S et 18S devrait avoir des pics comme le montre la figure 4 (panneau du milieu). La comparaison avec l'échelle (figure 4, panneau supérieur) identifie la taille des pics. Un ARN dégradé aurait pics moins claires et une quantité relative réduite de la 18S et 28S ARNr (figure 4, panneau inférieur). La fraction de petits ARN peut en outre être assurée à l'aide du petit ARN Kit Agilent. Il est recommandé de valider la réponse de l'oestrogène après traitement, dans les conditions expérimentales spécifiées, avant de procéder au dépistage des miARN. Une PCR quantitative peut être effectuée sur un gène cible ER connu tel que pS2 ou SPINK4 18, utilisant une matrice d'ADNc. De tels gènes sont régulés à la hausse à l'intérieur généralement de 1 à 24 h après traitement E2. Une fois que la qualité de l'ARN et de la réponse aux oestrogènesa été évalué, autre expérience peut être réalisée.

Microréseau est encore une technique largement utilisée pour le dépistage à grande échelle pour l'expression des miARN dans les cellules. Par exemple, une fois que la puce à ADN miRNA utilisé contenait 894 miARN matures et 50 contrôles des sondes uniques dans une quadruplés. Les hybridations ont été effectuées en double avec colorant procédure d'échange. Les résultats de puces à ADN miRNA sont habituellement représentés graphiquement par des cartes de chaleur. Figure 5A montre une carte de la chaleur, ce qui représente des données d'une comparaison des biopuces miARN entre le véhicule et les échantillons traités E2. Le rouge indique que le miARN est régulée positivement dans l'échantillon E2-traitée (expression élevée), tandis que le vert indique une régulation négative de la miRNA (Expression faible). La sélection miRNA dépend généralement de leur importance dans l'expression, et généralement d'une valeur de p inférieure à 0,05 est considérée comme significative. Les miARN qui sont indiqués pour être exprimé de manière différentielle devraient être encore validés wvec qPCR, pour les distinguer des faux positifs.

Le tableau DLP-LDA, d'autre part, utilise une méthode basée sur la PCR quantitative pour le dépistage de miARN réglementés dans un format de 384 puits. Habituellement deux plaques à 384 puits (cartes) sont fournis, piscines A et B. Groupe A contient généralement mieux caractérisé et plus fortement exprimés miARN de la piscine B. Le niveau relatif de chaque miARN sont déterminés par qPCR, où un miRNA est analysé par bien (figure 5B). Une valeur Ct élevé indique moindre expression de miARN. Tout comme la puce miARN, les résultats obtenus à partir de la DLP-LDA doivent encore être validé pour assurer l'exactitude.

Validations peuvent être effectuées en utilisant qPCR. Ici, deux méthodes de détection qPCR sont données pour éviter biais de la méthode et à permettre de confirmation approfondie et de l'enquête de la réglementation miARN. La chimie de détection à base de colorant Cyanine fonctionne différente de DLP que le profilage DLP-LDA est basé sur, et est adapté pour confirmerfins ation. Il peut être moins précis car il détecte tout l'ADN double brin amplifié, mais l'homogénéité de l'échantillon peut être évaluée en effectuant une analyse de courbe de fusion. Figure 6A (panneau de gauche) montre l'analyse de courbe de fusion d'un miRNA, et un pic uniforme clairement défini peut être vu. Des pics multiples seraient observés si l'amorce est montants non spécifiques ou significatifs de l'amorce-dimère est formé (figure 6A, panneau de droite). Dosages DLP miARN, d'autre part, est plus précis que seule l'amplification de la cible de miARN est détectée. graphes d'amplification de chacune des cibles de miARN peuvent être observées, comme le montre la figure 6B. La possibilité de contrôler l'apparition de multiples produits d'amplification en utilisant l'analyse de la courbe de fusion est, cependant, pas disponible avec cette chimie et colorant cyanine qPCR est moins coûteux. colorant cyanine et DLP qPCR essais peuvent parfois généré des résultats légèrement différents. Pour les deux essais de qPCR, par rapport à un réfégène de rence est nécessaire pour déterminer l'expression relative de gènes entre deux échantillons. Le gène de référence, également dénommé gène de ménage, devrait être un gène dont l'expression n'est pas modifié et qui est exprimée à des niveaux similaires à celles du gène d'intérêt. Un exemple d'un gène de référence appropriée dans ces lignées cellulaires de cancer du sein est ARHGDIA, une dissociation Rho GDP-inhibiteur qui fonctionne réactions des protéines Rho d'échange GDP / GTP. Comme observé sur la figure 6C (en haut), le niveau d'ARNm de ARHGDIA n'est pas modifiée entre le véhicule et les échantillons de ligands traités. Le 18S peut également être utilisé, mais son expression élevée nécessite une dilution de 1:500 séparée de l'ADNc stock et qu'il est donc moins approprié. Pour l'analyse des miRNA, il ya encore un débat sur un gène de référence bien définis. Jusqu'à présent, le U6 snRNA est un gène de référence qui est largement acceptée pour l'analyse des miRNA. U6 snRNA est le ~ 110 nucléotides de long, non codantes petit ARN nucléaire qui fonctionne dans le nucléaire spl pré-ARNmgivrage 19. Comme observé sur la figure 6C (en bas), les niveaux d'expression de U6 sont sur ​​la même dans tous les échantillons présentés, permettant ainsi des calculs des niveaux variables de miARN. Une représentation graphique d'un résultat miRNA qPCR pour une comparaison entre le véhicule et les cellules E2-traités qui ont été normalisée à l'U6 de référence peut être observé sur la figure 6D. Ceci illustre un miRNA qui ont été détecté comme non réglementés après le traitement 24 heures de E2, mais qui recèle ER sites de chromatine liaison à proximité de son emplacement génomique, et l'analyse des séries chronologiques identifié réglementation importante 72 heures après le traitement.

figure-results-1
Figure 1. Un aperçu de l'approche utilisée pour la détection de la régulation hormonale de miARN dans les cellules cancéreuses du sein. processus commence avec la culture et le traitement cellulaire, suivie à grande échelle miRNA profilage pour identifier les miARN éventuellement exprimés de manière différentielle, et se termine par des validations qRT-PCR des résultats de tableau.

figure-results-2
Figure 2. La comparaison des diverses préparations de l'échantillon et les manipulations d'acide nucléique pour chaque technique de détection de miARN. (A) microréseau miARN en utilisant la méthode de la technologie μParaflo comprend enrichissement, le poly-A de queue et l'étiquetage de ligature (B). Technologie DLP préparation de l'échantillon et de la méthode de détection comprend une synthèse de l'ADNc amorce en boucle qui s'étend après l'étape de dénaturation et fournit un fragment plus long portant l' préparation de l'échantillon amorce inverse et la séquence de la sonde. (C) la technologie de teinture de cyanineet la méthode de détection comprend poly A-tailing, et la synthèse de l'ADNc avec des amorces oligo-dT, y compris une séquence universelle 5.

figure-results-3
Figure 3. La culture cellulaire et l'extraction d'ARN. (A) Les cellules cultivées pour illustrer 80% de confluence nécessaire avant le traitement avec le ligand. (B) Représentation graphique de la concentration en ARN et la pureté après extraction. Chaque pic représente un échantillon et un processus d'extraction réussie donne ARN pur (en haut). Un ARN mal extrait ne montre aucun pic d'absorption nette à 260 nm (panneau du bas).

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Figure 4. & #160; ARN contrôle de la qualité des résultats de l'analyse de l'intégrité de l'ARN montrant représentation graphique de l'échelle (en haut), un ARN de bonne qualité (au milieu) et un échantillon d'ARN dégradé (en bas)..

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Figure 5. Une illustration des résultats de profilage miARN. (A) Une représentation de la carte de chaleur des résultats de puces miRNA pour miARN exprimés de manière différentielle. miR-A, B, C sont régulés à la hausse dans le traitement d'échantillons E2 comme indiqué en rouge, tandis que miR-D, E, F, G sont régulés à la baisse dans l'échantillon E2 traité comme indiqué dans le vert. (B) graphes d'amplification pour chaque miRNA des résultats DLP-LDA. miRNA détectés sont amplifiés comme indiqué par augmentation de la valeur Rn.

figure-results-6
Figure 6. analyse qPCR de la réglementation miARN. (A) de l'analyse de fusion-courbe pour un miRNA analysé en utilisant la détection de colorant de cyanine, montrant l'homogénéité de tous les échantillons testés (à gauche) et l'amplification de fragments multiples (à droite). (B) parcelles d'amplification pour chaque échantillon pour un miARN. Il peut s'agir de cyanine ou DLP de méthodes de détection. (C) la représentation graphique à barres de gènes de référence appropriés pour l'ARNm analyse ARHGDIA (en haut) et pour miRNA analyse snRNA U6 (en bas), ne montrant aucune expression différentielle importante entre les échantillons. (D) résultats miRNA qPCR pour illustrer la comparaison des niveaux relatifs d'expression de miR-135a sur un parcours de temps. Figure 6D est tiré à part de Katchy et al. 1 avec la permission d'Elsevier. Les valeurs sont généralement la moyenne des exper séparéeriences (doublons biologiques) ± SD. Test t de Student est utilisé pour démontrer la signification: * p <0,05.

Discussion

Déterminer le mécanisme de la régulation hormonale de miARN dans les cellules de cancer du sein peut fournir une plate-forme pour la compréhension de cette maladie et peut fournir un traitement potentiel pour le cancer du sein. Culture de ces cellules pour fournir la condition optimale pour l'action de l'hormone est très important. Ici, un protocole qui permet de s'assurer que l'hormone d'intérêt (œstrogène) a été exclue avant le traitement et que la dose optimale de l'E2 a été utilisé pour un moment approprié au cours du traitement a été décrite. D'autres effets hormonaux et des facteurs de croissance ont été maintenus à un minimum en diminuant progressivement les niveaux de sérum et en utilisant DCC-FBS, ce qui est FBS qui ont été dépouillé de la plupart de ses hormones, cytokines et facteurs de croissance. Phénol support exempt de rouge a été en outre utilisé pour minimiser d'autres effets non hormonaux, étant donné que le rouge de phénol a été rapporté pour avoir une activité oestrogénique et affecter certaines fonctions dans des lignées cellulaires 20,21. Le temps d'exposition des cellules à l'hormone est d'une grande importance. Pour la régulation de l'oestrogène associé à des gènes, il a été précédemment montré que 24 hrexposure produire une réponse significative de gènes cibles directs dans des cellules de cancer du sein 1,18. Depuis miARN sont transcrits par l'ARN polymérase II, comme ARNm, il est concevable que c'est un point de temps convenable pour détecter la réglementation directe également des miARN. Il est encore à déterminer si et comment ces miRNAs affectent l'expression de ces cibles connues ER dans les cellules cancéreuses du sein.

miRNA profilage de l'expression peut être difficile en raison de la taille relativement petite de la miRNA, le fait que la séquence miRNA mature peut être trouvé aussi dans le pri-miARN et la pré-miARN, et en raison de l'hétérogénéité de leur teneur en GC 22. Plusieurs techniques de profilage et de compositions chimiques ont été utilisées pour remédier à cette difficulté. Parmi ceux-ci sont des approches différentes de puces à ADN et l'analyse qPCR (Figure 2). Bien microréseau est largement accepté pour anal du génome entierlyse, il peut fournir des faux négatifs et il existe des différences entre les plates-formes disponibles, allant de la chimie de la technologie d'impression 23. De plus, le processus de normalisation constitue un défi lors de l'analyse relativement peu de gènes de miARN, qui sont comptés en milliers par rapport aux dizaines de milliers de transcrits d'ARNm. qPCR, d'autre part, est plus sensible, et est mieux appliqué lorsque moins de gènes doivent être considérés. Cependant, lorsqu'elle est effectuée dans de grandes plaques de 384 puits, avec seulement une technique répliquée par plaque, plusieurs plaques doivent être analysés pour chaque échantillon, ce qui rend l'analyse coûteux. Aussi, dans nos mains, de nombreux résultats plus faux négatifs ont été obtenus en utilisant l'analyse DLP-LDA par rapport à la puce. Étant donné que la séquence de miARN mature est présente dans le pri-miARN et les séquences de pré-miARN, il est intéressant de faire la différence entre ces transcrits à l'aide de techniques de PCR 24. sondes de DLP sont également disponibles pour pré-miARN, et spamorces ecific peuvent également être conçus pour exclure différente mature ou précurseur variantes utilisant cyanine technologie qPCR.

qPCR est une norme d'or pour la validation de l'expression différentielle de résultats du profilage. L'efficacité de la PCR quantitative, cependant, dépend de plusieurs paramètres, y compris l'extraction de l'ARN, de l'intégrité de l'ARN (de la qualité), la synthèse d'ADNc, la conception d'amorce, le procédé de détection (de la chimie), et le gène de référence pour la normalisation des données 1,22,25. Les options pour la conception d'amorce pour l'analyse des miARN est très limitée, car la courte durée de la séquence miRNA ne donne pas de place pour beaucoup la conception d'amorce de remplacement, et seulement une amorce peuvent être hébergeaient dans cette courte séquence. Par conséquent, la nécessité de manipulations de substitution comme illustré sur la figure 2. Réplicats techniques sont importantes pour valider la robustesse de la méthode d'amplification et le procédé mis en oeuvre. Répétitions biologiques sont nécessaires pour une représentation de la variatio biologique généralen, y compris la réponse variable à ligand traitement, et de montrer que les effets constatés dans une cellule sont reproductibles. Basé sur notre expérience, les variations dans l'expression des miRNA entre les cultures cellulaires peuvent se produire. Habituellement, ces différences sont moins de 1,3 fois, et la moyenne des valeurs et SD correspondant identifie la variation naturelle et technologique. Cette variation peut résulter de divers facteurs, notamment, la densité cellulaire et le fait que les fonctions cellulaires peuvent changer de passage de passage. Pour identifier statistiquement significatives expressions résultant du traitement de ligand, une signification largement admise est lorsque la valeur de p inférieure à 0,05. Ici, le test t de l'élève sur les répétitions biologiques et techniques à l'aide de la distribution bilatérale et deux échantillons paramètres de variance inégales ont été utilisés. D'autres paramètres du test t existent, et le choix dépend de la configuration expérimentale 26.

Un protocole détaillé dans l'évaluation des régulations hormonales de maturité miRNA dans des cellules de cancer du sein a été fournie. Technologies importantes et de la chimie dans le profilage et la validation de ces miARN expressions ont été clairement expliqué. La technologie choisie pour les études de miARN dans les cellules de cancer du sein dépend finalement de ce qui est exactement à l'étude.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants au Dr Xiaolian Gao, de l'Université de Houston, de fournir des conseils à la plate-forme de puces à ADN LC Sciences miARN, le Dr Karin Edvardsson, Institut Karolinska, en Suède, et le Dr Eylem Aydogdu, Université de Houston, pour partager leur expertise miARN . Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre R01CA172437. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Ce travail a également été soutenu par des subventions du Texas Emerging Technology Fund, sous accord pas. 300-9-1958.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMLife Technologies11885092
F12Life Technologies11765054
FBSSigma-AldrichF0926-500ML
Pénicilline Streptomycine LifeTechnologies15140122
Sans rouge de phénol DMEM  ;Life Technologies11054020
Eau ultrapureEMD MilliporeÉquipement
DCC-FBSSigma-AldrichF6765-500ML
100x L-glutamineLife Technologies25030081
PBS compriméMedicago, Accurate ChemicalsAccurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17&beta ;- œstradiolSigma-AldrichE2758
ICI 182,780  ;Sigma-AldrichI4409
ÉthanolSigma-AldrichE7023-600ML
Lignées cellulaires T47D ou MCF7American Type Culture Collection (ATCC)T47D (ATCC HTB-133) et MCF7 (ATCC HTB-22)
Fiole T-75  ;VWR International LLCBD353136 (bouchon ventilé)
Trypsine-EDTALife Technologies25300062
Pipette sérologiqueVWR International LLC53300. Pour 5mL (53300-421)
Chambre de comptage de cellules CountessLife TechnologiesC10228
Compteur de cellules automatisé CountessLifeC10227
Plaques de 100 mm  ;VWR International LLC25382-166
Solution de thiocyanate-phénol de guanidinium (TRizol)Life Technologies15596026
Racleur de cellules en caoutchouc  ;VWR International LLC82050-470
Méthode du thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium (miRNeasy Mini Kit/Trizol)Qiagen217004
Kit de DNase sans RNase (dégradation de l’ADN)Qiagen79254
Eau sans RNase (eau sans nucléase)ThermoscientificSH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  ;ThermoscientifiqueND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kitAgilent5067-1512
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2938C et pour logiciel (G2946)
Toutes les amorces (sauf les amorces TaqMan)Technologies ADNintégrées Spécifique par ordre pour chaque gène/miARN
Tampon premier brin, DTT, dNTP, exposant III (kit de synthèse d’ADNc en exposant III)  ;Life Technologies18080085
MicroAmp Fast à 96 puits, plaque réactionnelleL’adhésif
couvreLife Technologies4311971
2x SYBR green PCR master mix (colorant cyanine)Life Technologies4385612
7500 Système et logiciel de PCR rapide en temps réelLife Technologies4351106
&mu ; Technologie de biopuce microfluidique Paraflo  ;LCSciencesMRA-1001 et AS-2001(pour l’analyse des résultats)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (amorces Rt/ensemble de piscines humaines)Life Technologies4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  ;Life Technologies4366596
GeneAmp PCR System 9700 ThermocycleurLife Technologies4310899
sondes à double marquage (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNGLife Technologies4324018
7900HT Système de PCR rapide en temps réelLife Technologies4329001
Logiciels de gestion de SDS et RQTechnologies
NCode miRNA First-Strand Synthèse d’ADNc et qRT-PCR KitLife TechnologiesMIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT amorcesTechnologiesSpécifique pour chaque miARN
20x DPL (TaqMan) amorce de test en temps réel  ;Technologies de la viespécifiques à chaque miARN
spécifique Technologies optique rapide Life Technologies 4346906 Life 4444202 Life

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