Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un In vitro Modèle de l'AVC

Résumé

Nous avons développé un modèle de tranche de cerveau qui peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée. Cette technique génère tissu cerveau mature viable et réduit le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en gardant la circuiterie neuronale, interactions cellulaires, et des compartiments post-synaptiques en partie intact.

Résumé

Examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les conditions neuropathologiques, tels que l'AVC ischémique, il peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. Comme les systèmes de culture cellulaire »neuronale comme 'tel, primaire ou sont couramment utilisés. Bien que ces systèmes sont relativement faciles à travailler avec, et des systèmes de modèles utiles dans lequel divers résultats fonctionnels (tels que la mort cellulaire) peuvent être facilement quantifiés, les résultats examinés et les voies dans les neurones immatures cultivés (tels que voies de mort cellulaire excitotoxicité médiée) ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux observés dans le cerveau mature, ou dans un tissu intact. Par conséquent, il est nécessaire de développer des modèles dans lesquels les mécanismes cellulaires dans les tissus nerveux matures peuvent être examinés. Nous avons mis au point une technique in vitro qui peut être utilisé pour étudier une variété de voies moléculaires dans le tissu nerveux intact. La technique décrite ici utilise le tissu cortical de rat, mais cette technique peut être adapté pour utiliser un tissuà partir d'une variété d'espèces (par exemple, la souris, le lapin, le cochon Guinée, et le poulet) ou des régions du cerveau (par exemple, l'hippocampe, le striatum, etc.) En outre, une variété de stimulations / traitements peut être utilisée (par exemple, excitotoxique, l'administration d'inhibiteurs, etc.) En conclusion, le modèle de tranche de cerveau décrit ici peut être utilisé pour examiner une variété de mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée.

Introduction

La forme la plus courante d'AVC est un accident ischémique cérébral, qui se produit quand un vaisseau sanguin cérébral devient occlus. L'ischémie tissulaire qui résulte de l'arrêt de la circulation sanguine provoque une dépolarisation des membranes généralisée, la libération des neurotransmetteurs excitateurs, et une élévation soutenue de calcium intracellulaire, qui conduit à l'activation de la mort cellulaire cheminements de ^1. Ce processus a été appelé «excitotoxicité», et est une voie commune impliqué dans la mort neuronale produite par une variété de pathologies, y compris la course ^2. L'inhibition des voies de signalisation impliquées dans l'excitotoxicité et autres cascades de mort des cellules neuronales est une approche intéressante pour limiter les dégâts neuronale après un AVC.

Identifier les mécanismes moléculaires précis impliqués dans l'excitotoxicité et accident vasculaire cérébral ischémique peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. En tant que tel, embryonnaire primaire et «neuronale comme '(par exemple neuroblastoma et adénocarcinome lignées immortalisées) des systèmes de culture de cellules sont souvent utilisés. Les principaux avantages de ces modèles est qu'ils sont faciles à manipuler, relativement rentable, et la mort cellulaire peuvent être facilement mesurés et quantifiés. Cependant, les voies de signalisation peuvent être modifiées par les conditions de culture utilisées, ^3,4 et les neurones immatures et immortalisés lignes peuvent exprimer différents récepteurs et des molécules de signalisation par rapport à mûrir cerveau ^5-8. En outre, des cultures de neurones permettent seulement l'examen d'un type de cellule (ou deux, si un système de co-culture est utilisée), tandis que le tissu cérébral intact est hétérogène, contenant une variété de types de cellules qui interagissent les uns avec les autres. Les systèmes de culture de tranches organotypiques minces (explants de tissu cérébral) sont également utilisés, et ces modèles permettent l'étude de populations hétérogènes de cellules tels qu'ils sont trouvés in vivo. Cependant, seule une quantité limitée de tissu peut être obtenue à partir de chaque animal pour l'utilisation de cette technique, des tranches peutpas être cultivées pendant aussi longtemps que des lignées cellulaires immortalisées, et au milieu de culture à long terme peut conduire à des altérations dans les voies de signalisation des récepteurs et dans les tranches. Alors que le cerveau adulte peut être utilisé pour générer des tranches organotypiques, tranches de cerveau immature se prêtent mieux à la culture, et sont le plus souvent utilisés. Il est donc nécessaire de développer des modèles qui imitent ou représentent cerveau mature intacte, qui sont faciles à utiliser, dans laquelle les voies de signalisation neuronales peuvent être examinées.

Ici, une technique in vitro portant sur ​​des tissus nerveux intact qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire suite à une insulte excitotoxique ou ischémique est décrite. Cette technique permet de réduire le nombre d'animaux requis pour effectuer une expérience, est reproductible, et génère des tissus viables qui se comporte d'une manière similaire à métaboliquement plus grandes tranches organotypiques. En outre, le circuit neuronal, les interactions cellulaires, et co postsynaptiquempartment reste partiellement intact. Le tampon physiologique utilisé permet les membranes cellulaires pour «refermeture», et permet aux cellules de retrouver leur résistance de la membrane d'origine ^9. Ce modèle de tranche de cerveau est capable d'imiter fidèlement réponses observées suivant excitotoxicité médiée par des lésions cérébrales ^10, et peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans la course.

Protocole

Toutes les procédures sont exécutées avec l'approbation de l'Université de Newcastle protection des animaux et de l'éthique, ainsi que conformément aux directives et règlements pertinents, y compris la Loi NSW recherche sur les animaux, le règlement Animal Research NSW, et le Code australien de pratique pour la Entretien et utilisation des animaux à des fins scientifiques.

Une. Dissection du tissu cérébral

1. Sacrifiez vieux douze semaines chez les rats mâles par décapitation. Les rats peuvent soit être sacrifiés par décapitation et magnifique, ou peuvent être d'abord anesthésiés avec de l'isoflurane (5% induction, entretien 1,5-2%) dans 70% de N ₂ et 30% O _2, puis décapités.
2. Retirez le cerveau du crâne aussi rapidement que possible (idéalement, ce devrait être réalisée en moins de 2 minutes).
3. Retirez le cortex par dissection main-libre. La dissection doit être effectuée dans le minimum de temps possible, avec le moins de dommages au cerveau que possible afin de Maintain l'intégrité des tranches.
4. Pour enlever toute la peau résiduelle, la fourrure, le sang, etc, plonger le cerveau dans une petite quantité (3-5 ml) de 37 ° tampon C Krebs (chlorure 118 mM de sodium, 4,7 mM de chlorure de potassium, 1,3 mM de chlorure de calcium, 1,2 mM de dihydrogénophosphate de potassium, sulfate de magnésium 1,2 mM, du bicarbonate de sodium 25 mM, 11,7 mM de glucose, l'acide éthylènediaminetétraacétique disodique mM 0,03 (EDTA), équilibrée avec 95% d'oxygène / 5% de dioxyde de carbone (carbogène), pH 7,4).

2. Préparation de Microslices

1. Placez le cerveau sur la scène d'un hacheur McIlwain sur lequel deux tranches de papier filtre ont été placés et humidifié avec un tampon Krebs chaud. Gardez le cerveau et le papier filtre imbibé de tampon Krebs chaud, mais pas si humide qu'il ya du liquide libre sur la surface du papier qui peut causer le cerveau à glisser autour.
2. Trancher le cerveau en 250 um coupes coronales. Comme les nutriments, l'oxygène et les déchets eà normalement échangées avec l'alimentation en sang sont échangés avec un fluide qui entoure le tissu dans le tissu neural d'isolement, la taille des tranches ne doit pas être supérieure à 400 pm d'épaisseur pour permettre l'oxygénation et l'échange des nutriments suffisants pour se produire.
3. Tourner la scène McIlwain 90 °.
4. Trancher cerveaux dans 250 um coupes sagittales. Ici, ces coupes de cerveau (250 um x 250 um tranches de longueur variable en fonction de l'épaisseur du tissu) sont appelés microslices.
5. Placez les microslices dans un tube à fond rond avec 10-15 ml 37 ° C tampon Krebs (la quantité de tampon Krebs utilisée dépendra de la quantité de tissu).

3. L'équilibrage de Microslices

1. Agiter doucement jusqu'à ce que microslices individuelles sont suspendues, et alors leur permettre de régler par gravité.
2. Retirez délicatement le surnageant, qui sera trouble en raison de débris de cellules en suspension, et ajouter 10 ml frais 37 ° CTampon de Krebs au tube.
3. Répéter cette opération de lavage quatre fois, ce qui se traduira par la suppression de la majorité des débris.
4. Suite à cela, équilibrer les microslices à 37 ° C avec agitation douce / inversion, et changer le tampon Krebs toutes les 15 min pendant 1 heure au total.
5. A ce moment, ajouter 2 ml de tampon 37 ° C Krebs frais, et transférer 15-20 microslices (150 pi de MicroSlice suspension) au polystyrène fond plat tubes de 5 ml en utilisant un large pourboire supplémentaire de la pipette d'alésage avec angles arrondis (qui peuvent être créées par coupe ~ 2 mm de l'extrémité d'une pointe de P1000). Etaler les microslices uniforme sur le fond du tube en une seule couche, de sorte que chaque MicroSlice n'est pas à plus de quelques millimètres de l'atmosphère oxygénée.

4. Stimulation excitotoxiques

1. Incuber les microslices à 37 ° C, et de passer sans cesse CARBOGEN sur la surface de la suspension de 150 pi de MicroSlice, en utilisant une conduite de gaz qui est la positioned juste au-dessus de la surface de la suspension de MicroSlice (pour éviter une rupture mécanique).
2. Traiter microslices soit avec mM glutamate 150 pi 5 + 100 uM de glycine dans du tampon Krebs (stimulus excitotoxic: concentration finale de 2,5 mM glutamate + 50 uM glycine) ou 150 pi de tampon Krebs seul (contrôle non stimulé). Une variété de stimuli peut être utilisé à cette étape (y compris, mais sans s'y limiter, l'AMPA, NMDA + glycine, KCl dépolarisation, et de l'oxygène / privation de glucose).
3. Retirer la solution d'incubation à différents moments post-stimulation (0, 30, 60, 90, 120 et 300 sec), et la remplacer par 300 ul d'homogénéisation du tampon refroidi à la glace (Tris 30 mM, pH 7,4, 1 mM d'éthylène glycol l'acide tétra-acétique, 4 mM d'EDTA, 100 pM de molybdate d'ammonium, le pyrophosphate de sodium 5 mM, fluorure de sodium 25 mM, orthovanadate de sodium à 1 mM, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, cocktail complet d'inhibiteur de protease).
4. Homogénéiser microslices sur la glace, en utilisant un verre Téflon Dounce Homogenizer(20 coups; 700 rpm).
5. homogénats de conserver à -80 ° C, et diverses molécules de signalisation, des molécules de la mort, etc peuvent être mesurés par western blot.

Résultats

Microslices générés en utilisant cette procédure sont viables, et une variété d'espèces (par exemple, le rat, la souris et le poulet) peuvent être utilisés pour produire microslices. Trois mesures indépendantes de viabilité ont été utilisés: le taux de respiration (Figure 1), les ratios de nucléotides adénine (figure 2), et la teneur en potassium des tissus (Figure 3). Grâce à ces mesures, il a été démontré que microslices restent viables pendant au moins 2 heures après...

Discussion

Ici, une technique in vitro pour la génération de microslices qui peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l'excitotoxicité et de mort cellulaire médiée par l'ischémie dans un tissu de cerveau mature intact est décrite. Cette technique produit un tissu viable (figures 1-3), qui est métaboliquement semblable à de plus grandes tranches organotypiques ^15. En outre, ce modèle de MicroSlice correspond étroitement à la réponse observée après ex...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Guillotine			Utilisé pour décapiter des animaux
Matériel			Pinces, ciseaux, pinces à épiler, etc., pour l’ablation et la dissection du cerveau
Hélicoptère McIlwain	Les hélicoptères McIlwain sont fabriqués/distribués par une gamme d’entreprises, dont Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments et Ted Pella.		Utilisé pour générer 100-400 µ ; m sections cérébrales.
Tubes en plastique à fond rond	Greiner
Bain-marie			Pour maintenir le tissu à 37 ° ; C
Humidificateur/appareil			d’aération Utilisé pour conserver les microtranches dans un environnement humidifié et oxygéné
Tubes en polystyrène à fond plat	Nunc
Dounce Homogénéisateur