Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

Résumé

Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.

Résumé

La voie ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines a émergé comme l'un des mécanismes les plus importants pour la régulation d'un large éventail de fonctions cellulaires dans pratiquement tous les organismes eucaryotes. Plus précisément, dans les plantes, le système de protéasome ubiquitin/26S (UPS) régule la dégradation des protéines et contribue de manière significative au développement d'une large gamme de procédés, y compris la réponse immune, de développement et de la mort cellulaire programmée. En outre, en plus de preuves suggère que de nombreux agents pathogènes des plantes, comme Agrobacterium, exploitent les UPS d'accueil pour une infection efficace, soulignant l'importance de l'UPS dans les interactions plante-pathogène.

La spécificité de substrat de l'onduleur est obtenue par l'ubiquitine-ligase E3 qui agit de concert avec le E1 et E2 ligases de reconnaître et de marquer les molécules de protéines spécifiques destinés à la dégradation par la fixation sur les chaînes de molécules d'ubiquitine. Une classe des ligases E3 est l'EFC (Skp1 / Cprotéine Ullin / F-box) complexe, qui reconnaît spécifiquement les substrats UPS et les objectifs pour l'ubiquitination via son composant de la protéine F-box. Pour étudier le rôle potentiel de l'UPS dans un processus biologique d'intérêt, il est important de mettre au point un test simple et fiable pour la dégradation des protéines UPS médiation. Ici, nous décrivons un tel dosage en utilisant un système sans cellule végétale. Ce test peut être adapté pour des études sur les rôles des réglementée dégradation des protéines dans divers processus cellulaires, avec un accent particulier sur les F-box interactions protéine-substrat.

Introduction

Le protéasome ubiquitin/26S est en train de devenir un mécanisme généralisé pour le contrôle de diverses réactions biologiques, y compris la régulation transcriptionnelle, la progression du cycle cellulaire et la transduction du signal, le récepteur régulation à la baisse ou l'endocytose, entre autres procédés ^1-4. Dans cette voie, la protéine cible est marquée par ubiquitine résidus qui sont d'abord fixés par l'intermédiaire d'une liaison thiolester d'enzyme ubiquitine-activation E1 et ensuite transporté vers un résidu d'acide aminé cystéine de l'ubiquitine-enzyme de conjugaison E2, enfin, E2 interagit avec l'ubiqu....

Protocole

Une. L'expression des protéines

1. Choix du système d'expression
   Sélectionnez le système, c'est à dire, des vecteurs et la méthode de délivrance de vecteur, le mieux adapté pour l'expression de la protéine d'intérêt dans l'organisme modèle / cellule spécifique. A noter que notre dosage nécessite l'expression des protéines testées dans des quantités facilement détectables, ce qui est mieux réalisée par transformation transitoire de grands nombres de cellules. Chez les plantes, par exemple, cela est le mieux réalisée en utilisant des plasmides binaires en tant que vecteurs d'expression et Agrobacterium com....

Résultats

Figure 1, adapté de Zaltsman et al. ^17, illustre expériences représentatives pour la détection de la dégradation par le protéasome dans un système acellulaire. Plus précisément, nous démontrons la déstabilisation d'une usine liées à la défense protéine VIP1 par VBF protéine F-box par la voie SCF ^VBF en N. benthamiana. Arabidopsis VBF et protéines HA-marqués VIP1 (HA-VIP1) ont été transitoirement co-exprimées, et HA-VIP1 la teneur en protéines dans les.......

Discussion

Ce test repose sur l'expression des protéines testées dans les tissus végétaux, ainsi, le processus potentiel de dégradation par le protéasome se produit évidemment déjà à l'intérieur des tissus vivants. Nous dosage protéine déstabilisation, cependant, que dans les extraits, avec le temps zéro échantillon servant de point de référence initial. Par conséquent, nous définissons comme un essai acellulaire.

Un aspect important pour la réussite de cet essai est le choix correct du vecteur.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de dosage des protéines	Bio-Rad	500-0001
Cocktail d’inhibiteurs de protéinase	Sigma-Aldrich	S8820
Système Mini-Protéiforme	Bio-Rad	165-8000
Transfert d’électrotransfert SD Western blot semi-sec	Bio-Rad	170-3940
Affinité Lapin Purifié Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Chèvre Anti-Lapin IgG Peroxydase Conjuguée	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT membrane de transfert de nitrocellulose	Pall Corporation	27377-000
Substrat HRP chimiluminescent western Immobilon	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055