Article de méthode

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d'encre Technologie d'impression

DOI :

10.3791/51294

⸱

10 juin 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les méthodes décrites dans le présent document montrent comment convertir une imprimante à jet d'encre commerciale dans un bioprinter la polymérisation UV simultanée. L'imprimante est capable de construire une structure de tissu 3D avec des cellules et des biomatériaux. L'étude a démontré ici construit une néocartilage 3D.

Résumé

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Bioprinting, qui est basé sur l'impression jet d'encre thermique, est l'une des technologies permettant les plus attrayantes dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. Avec les cellules de contrôle numérique, des échafaudages et des facteurs de croissance peuvent être déposées avec précision à deux dimensions (2D) et désirée (3D) des emplacements tridimensionnels rapidement. Par conséquent, cette technologie est une approche idéale pour fabriquer des tissus imitant leurs structures anatomiques indigènes. Afin de concevoir cartilage à l'organisation indigène zonal, la composition de la matrice extracellulaire (ECM), et les propriétés mécaniques, nous avons développé une plate-forme de bioprinting aide d'une imprimante à jet d'encre commerciale avec photopolymérisation simultanée capable pour la 3D cartilage ingénierie tissulaire. Chondrocytes humains en suspension dans le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA) ont été imprimés pour la construction néocartilage 3D via assemblage couche par couche. Les cellules imprimées ont été fixés à leurs positions originales déposées, soutenu par le surroUnding échafaud photopolymérisation simultanée. Les propriétés mécaniques du tissu imprimé, se rapprochent du cartilage natif. Par rapport à la fabrication des tissus classique, qui nécessite plus l'exposition aux UV, la viabilité des cellules imprimées avec photopolymérisation simultanée était significativement plus élevée. Néocartilage imprimé démontré une excellente glycosaminoglycanes (GAG) et de la production de collagène de type II, ce qui était en accord avec l'expression du gène. Par conséquent, cette plate-forme est idéale pour la distribution précise de la cellule et l'agencement pour l'ingénierie tissulaire anatomique.

Introduction

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Bioprinting basé sur l'impression jet d'encre thermique est l'une des technologies permettant plus prometteurs dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. Avec des têtes d'impression de contrôle numérique et haut débit facteurs cellules, échafaudages, et de croissance peuvent être déposés précisément à deux dimensions (2D) souhaitée et positions (3D) en trois dimensions rapidement. De nombreuses applications réussies ont été obtenus en utilisant cette technologie en ingénierie tissulaire et la médecine régénérative 1-9. Dans ce papier, une plate-forme de bioprinting a été établi avec un Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 imprimante à jet d'encre thermique modifié et un système de photopolymérisation simultanée. Hydrogels synthétiques formulés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) ont montré la capacité de maintenir la viabilité des chondrocytes et promouvoir chondrogène production ECM 10,11. En outre, photoréticulable PEG est très soluble dans l'eau avec une faible viscosité, ce qui le rend idéal pour polyme simultanéerisation pendant bioprinting 3D. Dans cet article, les chondrocytes humains en suspension dans le poly (éthylène) de diacrylate (PEGDA; MW 3400) ont été imprimés précisément de construire néocartilage couche-par-couche avec 1400 dpi en résolution 3D. Répartition homogène des cellules déposées dans un échafaudage 3D a été observée, ce qui a généré le tissu cartilagineux avec d'excellentes propriétés mécaniques et une production accrue de l'ECM. En revanche, dans les cellules de fabrication manuelle accumulés au fond du gel à la place de leurs positions initialement déposées en raison de la polymérisation d'échafaudage plus lente, ce qui conduit à la formation de cartilage non homogène après culture 2,3.

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Protocole

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1. Bioprinting plate-forme mise en place

La modification de l'imprimante a été basé sur une imprimante à jet d'encre thermique HP Deskjet 500 et HP 51626A cartouche d'encre noire.

  1. Retirez le couvercle en plastique haut de l'imprimante et soigneusement détacher le panneau de contrôle de la couverture.
  2. Détachez les 3 câbles de connexion entre la partie supérieur de l'imprimante et de la base. Retirer la partie supérieur de l'imprimante à partir de la base.
  3. Sur la partie supérieure de l'imprimante, retirez le petit plastique et accessoires en caoutchouc (système de nettoyage de tête d'impression) sur le côté de la main droite sous la cartouche d'encre.
  4. Retirez la base du bac à papier avec des ressorts.
  5. Retirer la plaque métallique recouvrant la barre d'alimentation de papier plastique.
  6. Coupez la barre d'alimentation de papier plastique à la position de la roue d'alimentation milieu à l'aide d'une scie à main ou un autre outil de coupe.
  7. Déposer les roues 2 d'alimentation papier exposées après l'étape précédente. Le plastique de la roue est très difficile et une électroniquescie sera utile.
  8. Nettoyez la poussière et les débris en utilisant des lingettes d'air et de l'éthanol en conserve.
  9. Fixez la partie supérieur de l'imprimante à la base.
  10. UV stériliser l'imprimante modifiée pour au moins 2 heures dans une hotte à flux laminaire avant de l'utiliser.
  11. Coupez le capuchon de la cartouche d'encre HP 51626A aide d'une scie à main ou un autre outil de coupe.
  12. Vider l'encre et retirez le filtre qui recouvre le réservoir de fond de puits du cartilage.
  13. Rincez la cartouche à fond en utilisant l'eau du robinet.
  14. Ultrasonicate la cartouche dans désionisée (DI) de l'eau pendant 10 minutes pour enlever l'encre résiduelle.
  15. Examinez la cartouche pour vous assurer que toute l'encre a été éliminée. Rincer la cartouche ou de pulvérisation à fond avec de l'éthanol à 70% pour la stérilisation, puis de l'eau déminéralisée stérilisée.
  16. Mettre en place une lampe à ultraviolets longueur d'onde sur la plate-forme d'impression pour fournir une capacité de photopolymérisation simultanée.
  17. Mesurer l'intensité des UV à la plate-forme d'impression en utilisant une lumière UVmètre. Régler la distance entre la lampe UV et la plate-forme d'impression pour l'intensité de l'objet d'impression est comprise entre 8.4 mW / cm 2 (environ 25 cm de la lampe à la plate-forme de l'imprimante).

2. Préparation Bioink

  1. L'expansion monocouche de chondrocytes
    1. Plate 5000000 chondrocytes humains dans chaque flacon de culture de tissu T175 pour l'expansion des cellules dans Dulbecco Modifié Eagles Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau et 1 x pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG). des cellules de culture à 37 ° C avec de l'air humidifié contenant 5% de CO 2. Changer le milieu de culture tous les 3 jours jusqu'à ce que le ballon est de 85% de confluence. Utiliser des cellules à partir du même passage.
  2. Dissoudre PEGDA dans du PBS à une concentration finale de 10% p / v Ajouter photo-initiateur I-2959 à une concentration finale de 0,05% p / v Filtre stériliser la solution.
  3. Suspendre chondrocytes humains cultivés dans la solution PEGDA préparé à 5 x 10 6 cellules /ml.

3. Impression de tissu cartilagineux

  1. Mettez l'imprimante et l'ordinateur portable.
  2. Créer un motif d'impression d'un cercle plein avec 4 mm de diamètre à l'aide de Microsoft Word ou Adobe Photoshop.
    1. Ajustez la position du motif et assurez-vous qu'il sera imprimé exactement dans le moule en plastique.
    2. Calculer le nombre de copies nécessaires pour atteindre l'épaisseur désirée de l'échafaudage. Pour 4 mm de hauteur, 220 gravures sont nécessaires pour créer l'échafaud souhaitée.
  3. Charger le bioink dans la cartouche d'encre. Couvrir la cartouche avec du papier d'aluminium pour le protéger de l'exposition directe aux rayons UV pendant l'impression.
  4. Envoyer commande d'impression à l'imprimante. Tirez le capteur de papier lorsque l'imprimante commence à imprimer. L'ensemble du processus d'impression devrait prendre moins de 4 min pour un échafaudage de 4 mm de diamètre et 4 mm de hauteur.
  5. Transfert imprimé néocartilage à une plaque de 24 puits et ajouter 1,5 ml de milieu de culture dans chaque puits.

4. Cellule d'évaluation de la viabilité en 3D Échafaudages

  1. Incuber la néocartilage imprimé en solution, LIVE / DEAD viabilité / cytotoxicité travailler à température ambiante pendant 15 minutes dans l'obscurité.
  2. Couper l'hydrogel de cellule en demi-charge et prendre des images de fluorescence de la zone de coupe.
  3. Comptez en direct (vert) et les cellules mortes (rouges) par un observateur impartial à cinq images prises au hasard. Calculer la viabilité cellulaire en divisant le nombre de cellules vivantes par le nombre total de cellules vivantes et mortes.

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Résultats

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L'imprimante à jet d'encre thermique modifiée est capable de cellule et le dépôt d'échafaudage à un débit élevé et une excellente viabilité cellulaire. Combinant avec photopolymérisation simultanée et biomatériaux photosensibles, cette technologie est en mesure de fixer les cellules et d'autres substances imprimés aux emplacements initialement déposés. Selon les propriétés de l'imprimante à jet d'encre thermique modifiée, la résolution d'impression est de 300 dpi 2D avec un volume de goutte d'encre unique de 130 pl. Il ...

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Discussion

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Ce système de bioprinting 3D avec une capacité de photopolymérisation simultanée fournit une résolution d'impression de manière significative plus grande que la meilleure méthode d'impression précédemment rapporté in situ des défauts ostéochondraux extrudée à l'aide de la seringue un hydrogel d'alginate cellulaire dans 16. Résolution d'impression plus élevée est particulièrement critique pour l'ingénierie des tissus cartilagineux pour rétablir l'organisation anato...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucun intérêt financier dans cette étude.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la New York Région Capital Alliance subvention de recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Imprimante à jet d’encre thermique HP Deskjet 500Hewlett-PackardC2106aDiscontinué. Acheté remis à neuf auprès d’un vendeur sur Internet.
Cartouche d’encre noire HPHewlett-Packard51626a
Lampe ultravioletteUVPB-100AP
PosemètreUV General ToolsUV513AB
Microscope à balayage laser Zeiss LSM 510Carl ZeissLSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Mediatech10-013
Pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG)Invitrogen10378-016
Réactif de dissociation cellulaire de l’accutaseInvitrogenA11105-01
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Invitrogen10010-023
Kit de viabilité/cytotoxicité vivante/morteInvitrogenL-3224
Diacrylate de poly(éthylène glycol) (PEGDA)Glycosan BiosystemsGS700
Irgacure 2959Ciba Specialty ChemicalsI-2959
Chondrocytes articulaires humainsLonzaCC-2550

Références

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  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
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  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
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  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
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Mots-clés

Bioimpression 3D de tissusImprimante jet d encre thermiquePhotopolym risation simultan eChondrocytes humainschafaudage de PEGDAAssemblage couche par coucheMicroscopie confocaleColoration histologiqueEssai de viabilit cellulaireProduction de glycosaminoglycanes

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