Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Résumé

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Résumé

Bien que de courte durée, la mitose est un processus multi-étapes complexe et dynamique fondamentale pour le développement des organes, y compris le cerveau. Dans le cortex cérébral en développement, la mitose anormale de cellules progénitrices neurales peut causer des malformations à la taille et la fonction du cerveau. Par conséquent, il existe un besoin critique des outils pour comprendre les mécanismes de neurones progéniteurs mitose. Développement cortical chez les rongeurs est un modèle exceptionnel pour l'étude de ce processus. Progénitrices neurales mitose est souvent examiné dans les sections du cerveau fixes. Ce protocole décrit en détail une approche de l'imagerie en direct de la mitose en ex vivo des tranches de cerveau embryonnaires. Nous allons décrire les étapes essentielles de cette procédure, qui comprennent: l'extraction du cerveau, intégration, vibratome découpe des tranches de cerveau, la coloration et la culture de tranches, et imagerie time-lapse. Nous allons ensuite montrer et décrire en détail comment effectuer une analyse post-acquisition de la mitose. Nous incluons résultats représentatifs from ce dosage en utilisant le colorant vital Syto11, des souris transgéniques (histone H2B-EGFP et centrine-EGFP), et l'électroporation in utero (mCherry-α-tubuline). Nous allons discuter de la façon dont cette procédure peut être mieux optimisé et comment il peut être modifié pour l'étude de la régulation génétique de la mitose. Imagerie en temps réel de la mitose dans des tranches de cerveau est une approche souple pour évaluer l'impact de l'âge, de l'anatomie, et la perturbation génétique dans un environnement contrôlé, et de générer une grande quantité de données avec une résolution spatiale et temporelle. Ainsi ce protocole vient compléter les outils existants pour l'analyse des neurones progéniteurs mitose.

Introduction

L'objectif global de ce protocole est de décrire comment effectuer l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans des tranches de cerveau embryonnaires. En utilisant l'imagerie en direct de tranches de cerveau de la culture, ce protocole fournit une méthode simple pour analyser les multiples aspects de la mitose dans les progéniteurs neuronaux dans un environnement très similaire à un cadre in vivo. Il peut être appliqué sur le cerveau des animaux et / ou les cerveaux mutantes qui ont été manipulés par électroporation in utero) ^5.1. Cette technique est également idéal pour tester l'effet d'agents pharmacolog....

Protocole

1. Préparation des milieux (figure 1, étape 1)

1. Tranche milieu de culture
   1. 25 ml de milieu de culture de la tranche est suffisante pour préparer des plats de fond 5 de verre avec deux tranches par puits.
   2. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 250 ul d'une solution de N2 100x et 500 ul d'une solution 50x B27 sans vitamine A. Ajouter DMEM/F12 à un volume de 22,5 ml.
   3. Stériliser par filtration, puis ajouter une solution de 1,25 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur et de 1,25 ml de sérum de veau fœtal.
   4. Incuber la solution dans un bain d'eau à 37 ° C pendant la durée de la préparation des tranches.

Résultats

Le succès de cet essai et l'observation de plusieurs cellules en mitose au cours d'une session live d'imagerie dépendent en grande partie à la fois l'intégrité et le niveau anatomique de la tranche où les acquisitions sont réalisées. Comme discuté ci-dessous, le niveau anatomique d'une tranche est un facteur important. Figure 3A montre rostro-caudale et médio-latérale des endroits où nous avons le mieux réussi. Pour une discussion supplémentaire sur ce sujet s'il vous plaît voir .......

Discussion

L'avantage majeur du protocole que nous avons décrit est qu'il fournit une résolution temporelle dynamique de la mitose de cellules progénitrices neurales. Typiquement, les dosages de visualiser la mitose dans le cerveau en développement sont effectuées par immunofluorescence de coupes de tissus fixés. Mais cette approche ne donne qu'un aperçu de la mitose à un point de temps.

Il existe plusieurs étapes qui sont les plus critiques pour l'imagerie de la mitose dans des tranche.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100X N2	Life technologies	17502048	pour milieu de culture
50X B27 sans vitamine A	Life technologies	12587010	pour milieu de culture
DMEM/F12	Life technologies	11320033	pour milieu de culture
Sérum de cheval inactivé à la chaleur	Sigma Aldrich	H1138-500ml	pour milieu de culture
Sérum de veau inactivé à la chaleur	Sigma Aldrich	F4135-500ML	pour milieu de culture
FGF	R& D Sytems	3139-FB-025	pour milieu de culture
EGF			pour milieu de culture
10X HBSS	Life technologies	14065-056	pour la dissection des embryons
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	diluer à 1 M (pH 7,4)
2,5 M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	pour la dissection des embryons
0,9 M NaHCO3	Life technologies	25080-094	pour la dissection des embryons
Agarose à bas point de fusion	Fisher	BP165-25	pour la génération de coupes
Syto11	Life technologies	S7573	Make 5µ ; l aliquotes
3 mg/ml de collagène de type I	Technologies de la vie	A1048301	pour la culture des tranches Plat
à fond en verre	MatTek	P35G-1.5-14-C	pour la culture des tranches Boîtes
		Pétri	pour la dissection des embryons
Thermomètre			pour mesurer la température de l’agarose
Spatule			pour cerveau de transfert Alternative
pinceau			pour les cerveaux de transfert
Vibratome	Leica	VT1000s	pour générer des coupes Microscope
		de dissection	d’embryons
Microscope			Un microscope confocal est nécessaire, il doit être équipé d’une chambre d’incubation

de numérique au d’imagerie