Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Summary

Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Abstract

Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS) est un système de mesure d'impédance in vitro pour quantifier le comportement des cellules dans des couches de cellules adhérentes. À cette fin, les cellules sont cultivées dans des chambres de culture spéciales sur le dessus de opposées, des électrodes d'or circulaires. Un petit courant alternatif constant est appliqué entre les électrodes et le potentiel aux bornes est mesurée. Les propriétés isolantes de la membrane cellulaire créent une résistance à la circulation du courant électrique résultant en une augmentation de potentiel électrique entre les électrodes. Mesure de l'impédance cellulaire de cette manière permet l'étude automatisée de l'attachement cellulaire, la croissance, la morphologie, la fonction et la motilité. Bien que la mesure de l'ECIS lui-même est simple et facile à apprendre, la théorie sous-jacente est complexe et le choix des bons réglages et l'analyse et l'interprétation des données correcte n'est pas évident. Pourtant, un protocole clair décrivant les différentes étapes de l'expérimentationla conception de la préparation, la réalisation et l'analyse de l'expérience n'est pas disponible. Dans cet article, le principe de mesure de base ainsi que les applications possibles, des considérations expérimentales, les avantages et les limites du système de ECIS sont discutées. Un guide est prévu pour l'étude de la fixation des cellules, d'étalement et de la prolifération, la quantification du comportement des cellules dans une couche confluente, en ce qui concerne la fonction de barrière, la motilité cellulaire, de la qualité des adhérences cellule-cellule et cellule-substrat, et la quantification de la cicatrisation des plaies et réponses cellulaires à des stimuli vasoactifs. Les résultats représentatifs sont décrits sur la base de micro-vasculaire humain (MVEC) et ombilicaux cellules endothéliales humaines de veine (HUVEC), mais sont applicables à toutes les cellules en croissance adhérentes.

Introduction

ΩΩΩHere nous présentons Cell-substrat électrique Impedance Sensing, connu comme l'ECIS, une méthode spécifique pour mesurer et analyser le spectre de cellules adhérentes en culture ^une impédance. L'objectif de ce protocole est d'offrir un guide général applicable à l'utilisation de ce type particulier de l'impédance en fonction des dosages cellulaires et fournir des protocoles pour certaines des fonctions clés du nombre sans cesse croissant d'applications. L'accent sera mis sur l'étude de la prolifération cellulaire, la fonction de barrière, les jonctions cellulaires, et la motilité cellulaire.

Depuis ECIS et son modèle associé pour transformer les données de spectroscopie d'impédance dans les paramètres biologiques pertinents a été introduit sous sa forme actuelle à la communauté scientifique par Giaever et Keese en 1991 ^2, il a souvent été considéré comme un système de mesure de TEER (trans -épithéliale de résistance électrique), ce qui n'est pas exact. Les différences apparaissent marginales au premier abord, maissont importants pour l'interprétation des données. Pour les mesures de TEER classiques, les cellules sont cultivées sur des filtres perméables à caractériser les mécanismes de transport paracellulaires, qui sont dominés par des jonctions serrées épithéliales ou endothéliales adhérentes jonctions ^3. Communément, les deux électrodes placées au-dessus et en dessous du filtre sont utilisés pour appliquer un courant continu (DC) couler sur la couche de cellules et de deux autres électrodes afin de mesurer la chute de tension résultante ^4. La résistance électrique est calculée en utilisant la loi d'Ohm, ce qui permet une description numérique de la qualité de la barrière cellulaire.

ECIS suit ce principe de base et l'étend. Dans le système de l'ECIS, les cellules sont cultivées sur des électrodes opposées, de l'or circulaires qui sont incorporés dans le fond de boîtes spéciales de culture cellulaire. Le nombre d'électrodes par la culture est ainsi variable dépend de l'application et les électrodes ont un diamètre standard de 250 um, dans certains cas, un plus grand contre-électrodeest utilisé pour compléter le circuit. ECIS utilise un courant alternatif constant (AS) de 1 uA avec une fréquence donnée à la place d'un courant continu. L'impédance est calculée à partir des variations correspondantes de la tension (en mV) entre les électrodes. ECIS offre la possibilité de mesurer l'impédance sur une plage de fréquences pour étudier les propriétés cellulaires dépendant de la fréquence, ce qui a plusieurs avantages par rapport TEER et seront expliquées en détail dans cet article. Tout d'abord, la mesure de l'impédance complexe permet de séparer l'impédance globale dans la résistance de la barrière de cellules et la capacité de la cellule. En outre, en prenant des données à des fréquences multiples et l'application d'un modèle mathématique, on peut distinguer entre l'impédance de jonction (raideur des contacts cellule-cellule) et de l'impédance causée par des interactions cellule-substrat (la distance de la membrane des cellules basales de la matrice sous-jacente), ainsi que la contribution de la capacité de la membrane cellulaire. Deuxièmement, la prolifération cellulaire et la motilité peuvent être évaluées, puisque la cellules sont en contact direct avec les électrodes. Troisièmement, le substrat et les électrodes sont suffisamment minces pour permettre le champ lumineux et microscopie à contraste de phase.

Base de mesures d'impédance: L'impédance complexe

La base de la mesure de l'impédance électrique d'objets biologiques (par exemple des cellules) est la loi d'Ohm, un principe de l'électro-technique de base, qui décrit la relation entre la résistance (R), le courant (I) et la tension (U) à un circuit électrique à un instant donné (t).
Applicable dans le circuit DC: R (t) = U (t) / I (t)

Lorsque l'on travaille dans le système de climatisation, le courant et la tension ne diffèrent pas dans leur amplitude, mais également dans leur phase (φ). Maintenant, la résistance n'est plus suffisant pour décrire ces relations. Au lieu de cela, l'impédance complexe (Z) ou, dans la plupart des cas, l'amplitude de l'impédance (| Z |) sont utilisés, contenant la résistance ohmique précédemment décrit, plus la réactance (X), qui resultats de courant alternatif s'écoule à travers les condensateurs et les inductances route du déphasage entre la tension et le courant ^5.
Applicable dans le circuit AC: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Pour effectuer des mesures d'impédance sur des cellules intactes, en raison des caractéristiques de leur membrane, les cellules agissent comme une connexion parallèle d'une résistance et d'un condensateur. Ici, la résistance représente l'opposition à la circulation du courant, tandis que la capacité (C), on décrit la séparation de porteuses électriques dans le bi-couche isolant de la membrane cellulaire qui provoque la polarisation de la cellule. Ainsi X est dominée par les propriétés capacitives de la membrane cellulaire.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _Cell) ^-1

Etant donné que X est dépendante de la fréquence, de la variation de la fréquence de mesure permet l'étude de différentes propriétés fonctionnelles et structurelles de la cellule. Les mesures de l'appareil de ECIS la fois R et X, qui permet de calculerde | Z |, C et φ.

Quantification des couches de cellules entières avec la spectroscopie d'impédance: Le circuit électrique équivalent.

Comme expliqué précédemment, quand une cellule est amenée en un champ électrique, elle montre les propriétés des composants électroniques passifs. Si maintenant, au lieu d'une seule cellule, une couche entière de cellules cultivées sur le dessus d'électrodes et complété par du milieu de culture cellulaire est étudié, le modèle simple de la résistance et du condensateur doit être étendue à l'ensemble d'un réseau électrique. Dans ce circuit que l'on appelle l'équivalent, la résistance du milieu de culture (R _M) ainsi que la capacité (C _Electr) et une résistance (R _Electr) caractérisant l'interaction électrode / électrolyte doivent être envisagés ^3,6.

Un, exemple général simplifié d'un tel circuit équivalent pour une couche de cellules adhérentes en croissance peuvent être trouvées dans la figure 1. L'avantage d'un tel mathématiquePPROCHE pour décrire un système biologique, c'est que ces circuits peuvent être affinés ad libitum et ajustés aux questions expérimentales spécifiques, par exemple en tenant compte de l'impédance causée par organelles intracellulaires ou de distinguer les influences de la cellule-cellule (R _jonction), et adhérences cellule-substrat (R _Sub) sur ^7,8 globale d'impédance. Néanmoins, le but de la modélisation devrait toujours être d'utiliser le plus petit nombre d'éléments décrivant toutes les caractéristiques du spectre d'impédance mesurée pour permettre des corrélations significatives.

Figure 1. Schéma du système de l'ECIS et circuit équivalent représentant une couche de cellules en croissance adhérentes. A) de la section de la Croix d'une culture de l'ECIS bien. Les cellules sont de plus en plus au-dessus de détection et contre-électrode et unere recouvert de milieu de culture. Les électrodes sont reliées à un amplificateur lock-in et un signal de courant alternatif est appliqué par l'intermédiaire d'une résistance de 1 MQ pour créer une source de courant constant. Stimuli peuvent être ajoutées directement au milieu de culture à tout moment dans le temps. B) des mesures d'ECIS la somme de toutes les contributions individuelles à l'impédance. Résistance du milieu de culture (R _M) ainsi que l'impédance causée par l'interface électrode / électrolyte, qui est pour plus de simplicité présentés comme une combinaison en parallèle d'une résistance (R _Electr) et un condensateur (C _Electr), ainsi que les propriétés électriques de la membrane cellulaire, décrite par un montage en parallèle d'une résistance (R _cellulaire) et la capacitance (C _Mem), doivent tous être pris en considération. R _cellulaire est variable, car elle dépend de la perméabilité des cellules en direction du courant. Le circuit équivalent peut être étendu et affiné ad libitum. A titre d'exemple de jonction (R _Junc) commeainsi que la résistance sous-endothélial (R _Sub) ont été ajoutés au circuit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

paramètres d'impédance et leur signification biologique

Les deux paramètres les plus directs dérivées de mesures d'impédance sont la résistance et la capacité des cellules. Résistance représente la qualité et la fonction de la barrière de la cellule et prend en considération la résistance à l'égard de para-et de la circulation du courant trans-cellulaire donc. Capacité fournit une mesure globale de la couverture de l'électrode. La particularité de l'ECIS est que, avec l'aide de circuits équivalents et la modélisation de ces paramètres globaux donnent un aperçu sur de nombreuses propriétés plus cellulaires, y compris les adhésions cellule-cellule et cellule-substrat, qui seront discutées plus tard dans cet article.

Avant de commencer: considé expérimentalevivres

configuration de la mesure - La configuration se compose de plusieurs éléments distincts: l'appareil ECIS avec l'électronique de mesure; PC pour l'acquisition de données, support de tableau pour le 8 - ou système à 96 puits; tableaux ECIS et de la culture cellulaire de choix. Le porte-matrice doit être placée dans un incubateur et relié au dispositif de ECIS l'extérieur de la couveuse. Le PC doit être équipé du logiciel de l'ECIS (1.2.123.0 du 14 Février 2013) et relié au dispositif de l'ECIS.

sélection Array - Il ya une variété sans cesse croissante de tableaux ECIS, conçus pour de multiples applications. Les réseaux classiques sont la 8W1E et les matrices de 8W10E, qui sont composées de 8 puits de culture (indiquées par W) comprenant une ou 10 électrodes de mesure (indiqués par E), respectivement. Un grand contre-électrode complète le circuit, mais son impédance est essentiellement négligeable dans la mesure proprement dite ^6. Le titulaire du tableau 8 puits standard peut accueillir deux unerrays, résultant en un nombre total de 16 puits de culture. Les électrodes en or sont de 50 nm d'épaisseur, délimitée par un film isolant et montées de part et d'un substrat de polycarbonate Lexan optiquement clair ou une carte de circuit imprimé (PCB). Les tableaux contenant des BPC sont plus robustes et rentables. Les lames transparentes permettent de microscopie optique et d'immunofluorescence. Ce qu'il faut considérer, c'est que le tableau 1E améliore les fluctuations du signal de résistance causé par les mouvements cellulaires et est nécessaire pour les études de cicatrisation des plaies. En outre, les électrodes individuelles permettent corrélation des signaux électriques et optiques. Dans les réseaux d'électrodes multiples, le signal est moyenné sur plusieurs électrodes, qui en raison de la surface augmentée de mesure comprend plus de cellules dans la mesure, limite le biais des données par inoculation inégale et la croissance des cellules et réduit le flou du signal due à la cellule motions. Par conséquent, les matrices d'électrodes multiples sont utiles pour étudier la prolifération cellulaire et la formation de la barrière. À côté detableaux standard, il ya des tableaux spéciaux pour l'application de la contrainte de cisaillement ^9, pour étudier la chimiotaxie ^10, la migration cellulaire et la prolifération ainsi que des plaques à 96 puits pour les projections à haut débit. Pour conclure, le tableau doit être utilisé dépend fortement question scientifique et le type de cellule et doit être sélectionné et testé avec soin.

fréquence de la mesure - La modélisation de Rb et alpha (voir l'analyse de données) nécessite des mesures de fréquences multiples (MFT). Sinon impédance peut être mesurée au cours du temps à une fréquence spécifique de type cellulaire (SFT), avec l'avantage que les données peuvent être recueillies avec une résolution temporelle plus élevée. La fréquence de mesure plus sensible pour un type de cellule spécifique peut être trouvée par des balayages de fréquence. Lors du traçage impédance respectivement résistance fonction de la fréquence dans un log-logarithmique de la fréquence où la différence entre le libre-cellule et cellule-électrode enrobée est la plus grande est la fréquence à laquelle bloquent les cellules Til courant le plus efficacement possible. Dans le cas des cellules endothéliales (CE) cette fréquence est d'environ 4 kHz.

Densité de semis - Comme à chaque densité régulière expérience ensemencement à base de cellules dépend du problème scientifique. Lorsque l'on étudie l'adhérence et d'étalement ou de la formation de la barrière, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une densité élevée de 40.000-60.000 cellules / cm ² pour garantir un confluentes, barrière stable après 48 heures. Si la mise au point de l'expérience est de prolifération, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une faible densité d'environ 2.000-10.000 cellules / cm ^2.

Protocol

Une. Préparation du système de mesure

1. Préchauffer le support de matrice dans un incubateur à 37 ° C avant de commencer l'expérience, afin d'éviter la condensation.
2. Remplir cercueil d'eau de l'incubateur avec de l'eau distillée pour éviter le séchage des puits.
3. Effectuer toutes les manipulations sur les cellules et les réseaux dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.

2. Préparation de tableaux et inoculation des cellules

REMARQUE: Les matrices de ECIS doivent être nettoyés et stabilisée avant une expérience visant à empêcher la dérive d'électrodes, afin d'améliorer la reproductibilité du puits à puits et un rapport signal-sur-bruit. Par conséquent, deux options sont disponibles: A) prétraitement des électrodes avec la fonction de stabilisation de l'ECIS L-cystéine et B).

Option A: L-cystéine est recommandé que le pré-traitement plus uniforme, mais peut, dans certains cas particuliers, d'interagir avec la protéine Revêtementsgs sur les électrodes. Les volumes présentés sont utilisés pour les tableaux 8 puits standard.

1. Ajouter 200 ul / puits de 10 mM de L-cystéine. Cystéine nettoie et modifie la surface d'électrode fournissant une capacité élevée et reproductible électrode.
2. Incuber 15 min à température ambiante (RT).
3. Laver deux fois 500 pl / puits avec de l'eau ultra-pure (type 1). Ne pas utiliser de tampons phosphates, qui peuvent interférer avec l'adsorption de certaines protéines. Evitez également les solutions contenant du sérum avant le revêtement, la surface de l'or va adsorber les premières macromolécules apportés en contact.
4. Manteau avec 200 pl / puits chaud 1% de gélatine.
5. Incuber 30 min à 37 ° C.
6. Retirer la gélatine, mais ne laissez pas sécher la surface. Cela peut endommager les électrodes.
7. Laver une fois avec de l'eau ultra-pure (type 1).
8. Ajouter 400 ul / puits de milieu complet de culture de cellules (contenant du sérum, les antibiotiques et les facteurs de croissance).
9. tableau de diapositives dans un tableau porte und s'assurer que le réseau est positionné de telle sorte que les neuf or pads carrés sont correctement contactés par les broches de pogo ressort et la vis de réglage de correction à la main. Soyez prudent avec les tableaux transparents, la couche d'or peut facilement être endommagé.
10. Ouvrez le programme d'installation du logiciel de mesure et presse suivie par chèque dans la section «Collecte des données» pour effectuer une mesure d'impédance rapide de chaque puits. Les valeurs obtenues sont la base de mesure et seront automatiquement stockés dans les "Commentaires".
11. Le contrôle de puits détermine automatiquement le type de tableaux ECIS utilisé. Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section "Bien Configuration".
12. Le schéma de tableau s'allume en vert pour les puits sont correctement raccordés et rouge pour les puits raccordés vides ou incorrectes. Pourtant, assurez-vous toujours que les tableaux ont été placés correctement dans le support.
    REMARQUE: Si le nettoyage et le revêtement ont réussi les tableaux 8W1E ECIS ont acapacitance d'environ 5 nF et les matrices de 8W10E de 50 nF, ce qui se traduit par une résistance de référence de l'ordre de 200 Ω et 2000, respectivement.
13. Retirer tableau de titulaire.
14. des cellules de semences sous forme de suspension de cellules individuelles dans 400 ul / puits de milieu complet de culture cellulaire.

Option B: La fonction de stabilisation de l'ECIS peut être utilisé comme une alternative ou en combinaison avec le traitement de la L-cystéine et si les problèmes de dérive de la chaîne ou de grandes différences dans la résistance et la capacité du puits à puits se produisent.

1. Effectuer un traitement de cysteine ​​(en option) et des électrodes de pré-couche avec de la protéine (en option).
2. Ajouter 200 ul / puits de milieu complet à chaque puits et placer la matrice dans le porte-matrice.
3. Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur Configuration suivie Cocher pour vérifier le réseau est correctement connecté et à mesure initiale Z, R et C.
4. Stabiliser les électrodes en appuyant sur Stabiliser dans la section «Collecte des données». L'ECIS appliquera un courant élevé (ca. 3 mA), haute fréquence (64 kHz) impulsion de nettoyer les électrodes.
5. Vérifiez à nouveau les électrodes. Capacité devrait être augmentée et les valeurs de résistance doivent être dans une gamme comparable.
6. Si les valeurs de capacité et de résistance sont toujours pas satisfaisants, répétez la stabilisation.
7. Retirer tableau du support et inoculer des cellules.

3. Mise en place le logiciel de mesure et d'acquisition de données

1. Placer la matrice dans le porte-matrice comme décrit précédemment.
2. Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur le bouton Configuration dans la section «Collecte des données» pour connecter le logiciel de l'ECIS à l'instrument ECIS et exécuter un autre bien Vérifier.
3. Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section "Bien Configuration".
4. Sélectionnez les puits à mesurer dans la "Eh bien Configuratsection ion ".
5. Sélectionnez le mode de mesure parmi les options "recueillir des données":
   1. Pour une série de temps à une fréquence fixe, sélectionnez la fréquence unique. / Heure (SFT) et choisir la fréquence de mesure de la menu déroulant.
   2. Pour la mesure de la couverture de l'électrode et de la modélisation de Rb et Alpha, sélectionnez la fréquence multiple. / Heure (MFT). Le dispositif ECIS mesure automatiquement à toutes les fréquences disponibles.
   3. Pour micromouvements (voir l'analyse de données), sélectionnez Heure rapide Collect (RTC) et d'ajuster la fréquence de mesure et la fréquence d'échantillonnage. Voici la résolution temporelle standard est un échantillon par seconde (1 Hz), mais la fréquence d'échantillonnage peut également être augmentée pour suivre les changements rapides de l'impédance jusqu'à 25 Hz (pour le Z-Theta). Note importante: en mode RTC un seul puits est mesurée.
      REMARQUE: Si micromouvements doivent être mesurés dans plusieurs puits par la suite, cliquez sur Aide> Afficher la barre articles d'experts / menu Outils> Acquire> Multi-Eh bien RTC. Spécifiez le Délai (h) dans la section de Collecter les données; la ECIS va maintenant mesurer les puits sélectionnés dans l'ordre numérique. Après le démarrage de la mesure, le logiciel vous demandera de spécifier le nombre de cycles. Entrez la valeur de la fréquence de la mesure doit être répétée.
6. Pour SFT et MFT, sélectionnez l'intervalle de temps (sec) entre les mesures ou si les données doivent être acquis aussi vite que possible laisser cette option désactivée.
   REMARQUE: Pour obtenir des données du dispositif d'ECIS utilise un multiplexeur de passer d'un puits à l'autre avec un taux minimum d'acquisition SFT de 0,25 s et 7,5 s pour MFT. Signification de l'intervalle est fonction du nombre de puits sélectionnés et les fréquences. Pour les mesures sur les cellules en prolifération lente ou un simple enregistrement de la résistance en fonction du temps, en utilisant des intervalles de 600 s ou plus.
7. Appuyez sur Démarrer, nommez le fichier et sélectionnez l'emplacement de stockage des données.
   REMARQUE: La taille du fichier ne doit pas être un problème, puisque les données ECIS sont enregistrées dans un type de format de texte brut appelé *. abp, qui ne dépasse jamais quelques centaines de Mo, même avec toutes les fréquences de mesure et le nombre de puits sélectionnés.
8. Arrêtez exécuter en appuyant sur ​​Terminer.

4. Changement moyen et Manipulation de cellules

1. Appuyez sur Pause, cela arrêtera l'acquisition de données, mais continuer à fonctionner l'horloge expérimentale.
2. Enlever la matrice du support et de manipuler le cadre d'un banc à flux laminaire (ie moyen de changement).
3. Placez tableau dans son support et cliquez sur Vérifier la connexion soit ou CV Expérience de poursuivre l'acquisition de données. Le logiciel de mesure va placer un repère temporel dans le jeu de données.

5. Stimulation aiguë lors de l'acquisition de données

REMARQUE: Une deuxième option consiste à manipuler les cellules lors de l'acquisition de données pour le suivi des changements immédiats. Ceci n'est possible que; Lorsque les échantillons ne doit pas être stérile dans la suite de l'expérience.

1. Ajouter le stimulus directement au bien et assurez-vous de mélanger prudent avec une pipette ul 200.
2. Point Time Mark manuellement en appuyant sur ​​Mark et ajouter un commentaire.

6. Blessant électrique

REMARQUE: Trouver les bons réglages pour le type de cellule utilisée est la clé pour blessures électrique. Si blessant est trop courte, cela peut entraîner la suppression insuffisante des cellules, alors que si la blessure est trop long et / ou rugueux, cela peut endommager les électrodes (en particulier sur les réseaux transparents). Par conséquent, plusieurs impulsions de courte blessantes sont recommandés. Pour les cultures HUVEC deux longue blessantes impulsions 10-20 sec de 5 V à 60 kHz chacun ont été trouvés optimale en utilisant la ECIS 1600R. En général, il est recommandé d'utiliser des fréquences élevées> 20 kHz à maintenir des hauts champs uniformes dans les cellules et d'éviter d'endommager les électrodes.

1. Effectuer blessant pendantment une mesure ECIS active.
2. Activer Blessure / Setup électroporation, puis cliquez sur la plaie et remplir le temps (sec), la tension de la plaie (V pour 1600 R) ou en cours (uA pour Z et Z-Theta) et la fréquence (Hz). Les valeurs par défaut affichés sont basés sur le type de tableau et le dispositif de l'ECIS.
3. Sélectionnez les puits de blesser dans la section "Bien Configuration". Seuls les puits cochés seront blessés.
4. Activer Retarder jusqu'à Heure et remplir le temps de retard pour activer la fonction retard de la plaie. Cette fonction peut être arrêtée à tout moment en appuyant sur ​​Stop ou l'application d'une blessure à la main. Seule une commande de retard peut être actif à la fois.
5. Appuyez sur Activer, puis cliquez sur OK dans la fenêtre pop-up pour commencer blessant.
6. Assurez-vous que le signal de la résistance tombe à l'impédance décalée après blessure, sinon répéter la blessure.

7. Analyse des données

1. Représentation des données et l'exportation.
   1. mesure de finition ou charger des données défini via Fichier -> Ouvrir.
   2. Sélectionnez puits à afficher dans la fenêtre "configuration bien". Groupe de puits individuels à présenter à la moyenne.
   3. A choisi paramètre à afficher à partir de la barre d'outils supérieure (Z, R ou C).
   4. Sélectionnez le type de la barre d'outils supérieure (T = temps, F = fréquence, 3D = cascade blot) graphique.
   5. Définir décalage graphique et la gamme avec les curseurs ci-dessous la fenêtre graphique ou de remplir les valeurs exactes dans les contrôles adjacents.
   6. Choisissez parmi les «Options de la série chronologique" de base dans la section «Analyse» pour effectuer l'écart type, moyenne mobile ou la normalisation des données.
   7. Activer la barre d'outils Expert dans le menu Aide pour les opérations plus avancées comme Nyuist terrain et de la transformation de Fourier.
   8. Utilisez "Options d'affichage" dans la section "Analyser" pour définir range de x et y des axes et l'exportation graphique.
   9. Exporter les données sélectionnées vers un fichier Excel via Fichier -> Exporter des données -> Pour Excel (sélectionnée) et utiliser un logiciel tiers de choix pour une analyse approfondie, les statistiques et la représentation que nécessaire.
2. Modélisation de Rb et Alpha.
   NOTE: Pour la modélisation, il est recommandé d'utiliser un milieu acellulaire bien rempli comme référence.
   1. Mesure Finition MFT ou charge des données MFT ensemble.
   2. Si un puits de référence acellulaire est disponible, appuyez soit sur ​​Rechercher pour sélectionner automatiquement la valeur de référence ou Set pour sélectionner le point de temps libre cellulaire manuellement "Freq. Modélisation Scan" dans la section "Analyse".
   3. S'il n'y a pas de référence acellulaire, importer une valeur de référence d'un autre ensemble de données. Ouvrez l'ensemble de données de référence (assurez-vous que le même tableau et moyennes ont été utilisées) et utiliser Trouver ou Set pour sélectionner la valeur de référence.Puis accédez à des données mesurées et appuyez sur Get.
   4. S'il n'y a pas fixés utilisation disponible par défaut d'usine des données de référence sans cellules.
   5. Appuyez sur Modèle de commencer les calculs. Modélisation peut prendre plusieurs minutes dépendant de la taille de l'ensemble de données.
3. Calcul des micromouvements.
   Note: Ce calcul ne fait pas partie du logiciel de mesure, mais peut être réalisée avec n'importe quel logiciel de traitement de signal.
   1. Terminez mesure RTC ou charger l'ensemble de données RTC.
   2. Normaliser fixées par la résistance moyenne de l'ensemble de la période données.
   3. Cassez fixés en segments d'une longueur de points de 256 données données et nettoyer chaque segment par une fenêtre de Hanning.
   4. Exécuter une transformation de Fourier 256 points et la moyenne résultant spectres de fréquences à un spectre de puissance 129 points unilatéral de réduire au minimum le bruit aléatoire et amélioré le signal biologique.
   5. fréquence de Complot contre amplitude dans un graphique log-log et d'appliquerajustement linéaire des moindres carrés.
   6. La pente de la régression linéaire est une mesure du bruit dans le signal global, et de ce fait les cellules de micro-mouvements.

Results

Mise en place d'une expérience est assez simple et la mesure elle-même est entièrement automatique, mais comme c'est souvent le cas, l'analyse et l'interprétation des données correctes sont cruciales. Dans la section de données représentant un guide est prévu pour l'interprétation des paramètres les plus importants offerts par spectroscopie d'impédance avec ECIS. Ce sera utile pour décider quel type de problème scientifique une mesure ECIS peut être utile et dont les paramètres doivent être enregistrés.

Une expérimental lecture rupture typique peut généralement être divisée en une phase de croissance après l'inoculation des cellules et un plateau de phase quand les cellules atteignent la confluence. Chacune de ces phases apporte des informations sur les différentes propriétés cellulaires. A mesure représentative est montrée sur la figure 2 et divisé en quatre sous-phases pour analyser A) l'adhérence cellulaire, la prolifération et la diffusion, B) la formation d'une barrière maturation CE, C) la migration des cellules après la génération d'un champ électriqueal enroulé, et D) la réponse cellulaire à une stimulation par la thrombine de l'agent vasoactif. En contraste de phase et immunofluorescence images ont été acquises directement à partir de l'électrode de mesure au cours des différentes sous-phases pour illustrer le lien entre la couverture de l'électrode, l'état de la cellule, et le signal d'impédance enregistrée.

L'adhérence, la prolifération et la diffusion

Chaque type de cellule a son adhérence et la croissance de la courbe caractéristique qui peut être manipulée en faisant varier la densité de l'ensemencement, le revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire ou d'autres stimuli. L'une des principales difficultés pour l'étude de ces procédés est de faire la différence entre l'adhérence, la prolifération et la diffusion. Wegener et al. Ont donné ¹¹ une description détaillée de l'utilisation d'une combinaison de la résistance et la capacité de faire la distinction entre ces paramètres et à la figure 3, il devient évident de savoir comment la résistance et la capacitance peuvent se compléter les uns les autres. Il est important quel'étude de l'adhésion et l'étalement de comprendre l'influence de la fréquence de mesure, car ici le champ électrique provoque une polarisation de la membrane cellulaire des cellules en suspension ^8, ce qui force le courant à circuler exclusivement autour des cellules. Lorsque les cellules se fixent elles commencent à restreindre le flux de courant par étalement sur les électrodes et la capacitance diminue de façon linéaire avec le pourcentage de surface ouverte sur l'électrode (surface fractionnaire). Par conséquent, l'adhérence, la prolifération et la diffusion peuvent être quantifiés plus, lors de l'enregistrement de capacité à une fréquence supérieure à 40 kHz (figure 3B), où la diminution de la capacité est directement proportionnelle à la couverture de l'électrode. En variante résistance à sa fréquence de mesure la plus sensible est une mesure directe pour la différenciation et la maturation des cellules dans une barrière de confluence (Figure 3A). En plus de la zone fractionnée, Wegener et al. Introduit deux autresparamètres pour quantifier l'adhérence et de la couverture de l'électrode: t _1/2 (la capacité de la moitié au maximum), ce qui est le temps jusqu'à ce que 50% de l'électrode est recouverte de cellules (Figure 3B, insertion), et la pente de la courbe de capacitance (s, non représenté) que le taux d'étalement cellulaire et la prolifération.

Résistance en tant que mesure de la qualité de la barrière

La résistance est la partie de l'impédance qui décrit la qualité et de la fonction meilleure barrière, parce qu'elle néglige composants capacitifs de la membrane, électrode et moyennes. Ici, la qualité d'étanchéité à l'expression et la perméabilité pas est utilisée, étant donné que la perméabilité est par définition ne dépend que de contacts cellule-cellule. Cependant la résistance est déterminée par l'aptitude des cellules et de leurs interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour bloquer le flux de courant. Types de cellules différents conséquent (clones et passages) ont leurs valeurs de résistance spécifiques (figure 4A). Bien que la résistance donne une bien CLEArer idée de la barrière de la cellule, le signal d'impédance doit toujours être pris en considération.

Modélisation de Rb et Alpha

Le logiciel ECIS abrite une caractéristique particulière, la possibilité de modéliser deux paramètres qui distinguent entre la cellule-cellule et cellule-matrice adhérences (figures 4B et 4 C). Rb (en cm ² ohm x), est la résistivité de contacts cellule-cellule pour le flux de courant et de ce fait une mesure inverse de la perméabilité classique. Haut Rb implique une faible perméabilité à la circulation du courant. Alpha (en cm x ^0,5 ohm), est une mesure de l'apport d'impédance résultant de jonctions cellule-électrode. Le modèle pour quantifier les contacts cellule-cellule et cellule-matrice a été introduit 1991 par Giaever et Keese et est basée sur l'hypothèse que les cellules sont de forme circulaire, des objets en forme de disque qui ont une membrane isolante, vol stationnaire au-dessus de l'électrode et sont remplis d'électrolyte conducteur ² . Lapropriété de la membrane cellulaire isolant ne laisse que trois voies de courant: a) entre la surface ventrale des cellules et des électrodes, b) entre les contacts cellule-cellule, et c) à travers les cellules (seulement probable quand une haute fréquence de mesure est utilisée ). Une dérivation plus détaillée et une explication peut être trouvée dans les papiers de Lo et al ^3,12.

Micromotion

Il a été montré que de petites variations dans le signal de résistance (figure 4A) sont dues à des mouvements subtils cellulaires aléatoires dans les couches de cellules confluentes ainsi que des cellules qui se déplacent sous et hors tension de l'électrode dans des cultures éparses ^2. Cet aspect de ECIS données temps-cours décrits par Lo et Opp et al. ^13,14 est souvent négligée et mieux vu lors de la mesure avec les tableaux 1E et à la fréquence la plus sensible pour tenir compte de para-et-chemins actuels subcellulaires. Le calcul de cette cellule a causé le bruit (micromouvements) ne fait pas partie de ee logiciel de mesure standard, bien que dans la version la plus récente transformation de Fourier rapide (FFT) est intégré. Enregistrement des données RTC avec une fréquence d'échantillonnage de 1 Hz pendant 1 h à 4 kHz offre une résolution suffisante pour le calcul de micromouvements CE. Ce calcul fournit une valeur unique et peut être directement utilisé pour l'analyse statistique. Une longue discussion sur l'utilisation de l'analyse de fréquence pour les micromouvements peut être trouvée ailleurs ^15. Alternativement à la FFT d'autres stratégies d'analyse peuvent être utilisés, comme la variance des incréments. L'écart est plus sensible à de petits changements dans les micromouvements, mais à cause de cette sensibilité de la comparaison des expériences individuelles devient difficile. Les pentes du spectre de puissance sont une mesure plus robuste de micromouvements (figure 4D). Voici l'aire sous la courbe peut être considérée comme la quantité de micro-mouvements ou bruits les cellules créent. Par conséquent, plus la pente du spectre de puissance le plus faible de la surface sous la courbeet plus la micromouvements.

Dosage de la cicatrisation des plaies électrique

Pour étudier la migration des cellules, les blessures mécaniques en général sont appliquées par le grattage des cellules de la plaque de culture avec des embouts de pipette, grattoirs de cellules ou des timbres spécifiques et de suivre leur remigration microscope ^16. Ce procédé présente l'inconvénient évident que la taille de la rayure est variable et est généralement trop grand pour négliger l'influence de la prolifération cellulaire sur le processus de cicatrisation des plaies. La fonction blessant de l'ECIS utilise une haute tension, impulsion à haute fréquence pour obtenir une électrode acellulaire et suit ensuite remigration de cellules voisines pour remplacer les cellules de la mort (figure 5A). Un avantage de cette méthode automatisée standard, au cours du travail de grattage intensif dosages est que l'ECIS produit une blessure très reproductible avec un diamètre précis de 250 pm, qui ferme l'espace de quelques heures, pour étudier la migration pure. En outre, l'impulsion électrique fairees pas retirer le revêtement de protéines et de matrice extracellulaire sécrétée. Sous l'hypothèse que les cellules migrer à nouveau sur l'électrode de tous les côtés, le taux de migration peut facilement être calculé en divisant le rayon de la plaie par le temps requis pour la fermeture des plaies ^17. Comme alternative à la blessure électrique, récemment, la méthode dite de la clôture électrique a été introduite (non représenté). Impulsions de courant ici élevés empêchent l'attachement et la migration des cellules sur les électrodes après l'inoculation. Les cellules vont se développer autour de l'électrode de mesure et de commencer à migrer vers l'intérieur dès que les impulsions électriques sont éteints. L'avantage de la clôture électrique sur la blessure électrique est que la surface de l'électrode n'a pas été modifié par la croissance des cellules ou la suppression de la cellule, ce qui est important de mesurer l'influence de différents revêtements sur la migration cellulaire.

stimulation cellulaire

En plus de l'étude de la migration cellulaire, la spectroscopie d'impédance est parfaitement adapté pourmesurer les effets des médicaments et des toxines sur les cellules. figure 5B présente une expérience de stimulation / inhibition classique, où la thrombine a été utilisé pour induire une hyper-perméabilité à la confluence CE barrière par la contraction et l'écart formation de cellules, qui se manifeste par une baisse transitoire de la résistance . Par une pré-incubation avec l'inhibiteur de Rho kinase Y-27632 majeure partie de la réponse à la thrombine est diminuée en diminuant la tension de la cellule de base ¹⁸ et le blocage de la formation de fibres de stress ^19. Ensuite, la Rho kinase bloqueur a été utilisé à différents points de temps après l'addition de la thrombine, conduisant à une récupération immédiate et totale de la barrière CE. Ici, l'avantage d'un système de mesure d'impédance en continu pour étudier les réponses cellulaires aiguës devient évidente. Dans les dosages de point final réguliers (par exemple, de coloration ou d'immunofluorescence passage de macromolécule), cette réponse aiguë à la bloquant utilisé serait très difficile, sinon impossible, de détecter et de quantifier. Important à noter est que, avec iLes mesures de la perméabilité vers mpedance ions est décrit et non pas vers les macromolécules. S'il vous plaît se référer à Aman et al. ^20, où une excellente comparaison entre les mesures de ECIS et expériences de passage de macromolécule est fourni.

Figure 2. Mesure représentative. MVEC ont été cultivées sur un enduit de gélatine 8W1E tableaux avec une densité de semis bas de 5000 cellules / cm ² et l'enregistrement MFT a été effectuée plus de 10 jours. La mesure illustre les différentes lectures aboutissants d'une expérience ECIS: A) adhésion, d'étalement et de prolifération, B) la formation et la maturation de la barrière de cellules confluentes, C) la cicatrisation de plaies après l'application d'une plaie électrique, d) stimulation avec le vasoactif agent de la thrombine. Les deux flèches indiquent moyen rafraîchissements, qui ont été effectuées à des intervalles de 4 jours et donnent une idée de la sensibilité des mesures vers des stimuli mécaniques et les changements de température et de pH. Les images dans le panneau de dessus correspondent à la mesure et ont été acquis directement de l'électrode de mesure. L'image en contraste de phase sur la gauche montre les cellules endothéliales 24 heures après l'inoculation, en commençant à recouvrir l'électrode. Les images d'immunofluorescence dans le centre et sur le présent coloration F-actine droit de la couche endothéliale confluent avant et après stimulation par la thrombine (1 U / ml). La thrombine provoque la contraction des cellules endothéliales par la formation de ce qu'on appelle les fibres de stress et l'ouverture transitoire des écarts inter-endothéliales (flèches et des inserts d'image), reconnaissables dans le signal ECIS par une baisse de la résistance à la base. Ici, la sensibilité de la mesure devient évident et comment les changements dans la couche de cellules en corrélation avec le signal d'impédance.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. attachement cellulaire et la croissance. MVEC du même donneur a été ensemencée avec trois différentes densités sur gélatine revêtu tableaux de 8W10E et la croissance des cellules a été enregistré à fréquences multiples pour 60 h. A) Les valeurs de résistance pour les trois conditions à leur fréquence optimale de 4 kHz pour mesurer formation de la barrière. Tous les trois densités de semis établis une barrière de confluence de ca. 1200 Ω à la fin de la mesure;. Des taux de prolifération cependant (pentes des courbes) diffèrent nettement B) Mesure de la capacité à 64 kHz donne un aperçu sur l'adhérence et la diffusion. L'adhérence est l'enitial phase de plateau de la courbe de capacité (entre 2-8 heures). D'étalement, qui est en relation linéaire avec la couverture de l'électrode, est représentée par la pente de la courbe et est achevée après 10 à 30 heures en fonction de la densité d'ensemencement. Le point de temps t _1/2 (moitié de couverture maximale) peut être utilisé pour l'analyse statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Caractérisation de la barrière de la confluence. Deux donneurs MVEC avec différents nombres de passages (passage 3 et 6) ont été ensemencées sur des réseaux de gélatine enduite 8W1E et une mesure de la MFT a été effectuée pendant 30 heures pour caractériser la barrière CE. A) de la résistance mesures révèlent que la jeune donneur 1 a une plus grande résistance de ca. 11000 Ω par rapport à la ca. 7500 Ω du donneur plus 2. Colombie-Britannique) Les capacités de modélisation de l'ECIS ont été utilisés pour trouver la cause de la moindre résistance. La modélisation a révélé une interaction cellule-cellule Rb comparable et a indiqué un affaiblissement de la cellule-matrice interaction Alpha comme cause possible. D) RTC a été réalisée pour quantifier micromouvements à l'intérieur de la couche cellulaire confluente par transformation de Fourier, où l'aire sous la courbe est proportionnelle au micromouvements . Les analyses des spectres montre moins micromouvements du donneur plus 2 et de soutenir ainsi ce que l'on peut déjà supposer, d'après le signal de la résistance (moins de variance). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. La migration des cellules après la blessure et les effets de la stimulation de la thrombine électrique. enregistrements d'impédance ont été effectuées à 4 kHz avec une résolution temporelle maximale. A) MVEC donneur 1 a été utilisé dans le passage 3 et donneur 2 dans le passage 6 sur gélatine revêtu tableaux de 8W1E et cultivé jusqu'à confluence. Ensuite, une plaie électrique a été réalisé par application de deux impulsions de 5 V à 60 kHz, avec une durée de 20 secondes chacun. La plus jeune donneur 1 a montré une meilleure cicatrisation des plaies capacités en fonction d'une fermeture plus rapide de la plaie (migration, les pentes des courbes) et une résistance plus élevée après la lésion par rapport au donneur âgé 2. B) Des cellules HUVEC ont été cultivées sur gélatine enduite matrices de 8W10E. Après confluence les cellules ont été privées de sérum pendant 1,5 h en remplaçant le milieu de culture complet avec le milieu de base + 1% d'albumine de sérum humain (HSA). Nousâge moyen de plaine avec HSA est une étape critique, car les composants sériques bloquent la réponse à la thrombine. Dès qu'un plateau de résistance stable a été détectée, la thrombine a été ajouté directement dans les puits et on mélange soigneusement avec une pipette de 200 ul. L'effet maximal de la thrombine est visible après 30 minutes, caractérisée par une baisse transitoire de la résistance à la ligne de base et d'un ca. Résistance inférieurs de 30-50% après la récupération. Les cellules ont été soit pré-incubées avec la Rho kinase bloquant Y-27632 pour 30 min ou le bloqueur a été ajouté 20, 30, ou 40 minutes après l'addition de thrombine, qui a diminué l'effet de la thrombine immédiatement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Discussion

ECIS est un excellent outil pour le dépistage des propriétés et le comportement cellulaire ainsi que pour la quantification des effets des substances connues et inconnues. Ainsi les cellules sont maintenues dans des conditions de culture standard, impédance peut être contrôlée en permanence avec une haute résolution temporelle et corrélées à des signaux optiques. De cette façon, le point de temps optimal pour les manipulations de cellules peut être choisie sur la base de l'état morphologique et fonctionnelle cellulaire. Malheureusement, cette résolution de mesure élevée est livré avec le prix que les petites variations de température, le pH ou la stimulation mécanique des cellules (changement de milieu) auront une influence sur le signal d'impédance immédiatement.

L'application de la faible courant de mesure pour les cellules rend la mesure non invasive de l'ECIS, non destructive et sans étiquette, mais à la suite seulement les propriétés bioélectriques passive peut être mesurée (pas de potentiels d'action). Un élément clé est que un certain nombre de paramètres peut être der Ived partir d'une seule mesure, en combinant les informations provenant de plusieurs essais classiques, comme la perméabilité ou des analyses de la cicatrisation des plaies. Voici l'aspect particulier intéressant est que les données mathématiquement modélisés peuvent être utilisés pour explorer les changements de la résistance et de la capacité et les orienter vers les structures cellulaires distinctes (par exemple cellulaires contacts ou la membrane cellulaire). Est important de noter que la spectroscopie d'impédance fournit toujours un signal moyenne de toutes les cellules sur l'électrode de détection, ce qui ne permet pas d'études sur les cellules simples et aussi le modèle mathématique est valable uniquement dans les couches de cellules confluentes. Par conséquent les cellules endothéliales doivent avoir lieu dans l'état de confluence pour au moins un jour avant utilisé pour la modélisation d'assurer cellulaires adhérences matures et les cellules au repos. De même, les blessures électriques ne doivent être appliquées à confluentes couches cellulaires en utilisant des impulsions multiples blessantes courtes avec des fréquences élevées, pour atteindre l'efficacité optimale blessures et éviter d'endommager les électrodes.

jove_content "> Pour obtenir la quantité maximale de l'information à partir d'une mesure de l'ECIS, comme dans chaque essai, plusieurs paramètres tels que la combinaison d'un substrat de matrice, le revêtement et la densité d'ensemencement pour le type de cellule individuelle doivent être testées et optimisées avant d'une expérience.

Une limitation importante de l'ECIS est que la mesure ne fournit pas d'information directe sur le niveau moléculaire. Ainsi mesures ECIS sont généralement plus informative au début d'une série d'expériences pour aider à associer un problème scientifique avec des structures ou des propriétés cellulaires et de fournir des données importantes pour la génération d'une hypothèse testable. Par conséquent, la conception modulaire de l'ECIS fournit un large éventail d'applications avec la possibilité pour Tailor Made tableaux. Les derniers développements de tableau indiquent un avenir accent sur ​​haut débit projections d'impédance pour la prolifération cellulaire et la blessure électrique et l'avance des tableaux de flux spéciaux pour la simulation in vivo cisaillement avec des profils de flux différents.

Documentation supplémentaire
S'il vous plaît se référer également à la page Web de la biophysique appliquées (www.biophysics.com) pour les notes d'application, des webinaires et une liste détaillée des publications couvrant l'ensemble du spectre ECIS.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Z&theta ;	Applied Biophysics Inc., Troie, NY, États-Unis	ibidi GmbH, Munich, Allemagne
8W1E PCB Electrode	Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis	ibidi GmbH, Munich, Allemagne
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis	ibidi GmbH, Munich, Allemagne
8W10E PCB Electrode	Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis	ibidi GmbH, Munich, Allemagne
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gélatine	Merck Millipore	104070
Thrombine bovine	Merck Millipore	604980
Albumane (albumine sérique humaine)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit  ;	Lonza	CC-3162
Stylo/Strep	Lonza	17-602E