Article de méthode

L'encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

17.7K vues

⸱

DOI :

10.3791/51304

⸱

21 octobre 2013

 ,  , 
1Centre for Integrative Biology, University of Trento

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons des méthodes simples pour la préparation de vésicules, l'encapsulation de la transcription et de la machinerie de traduction, et le suivi de la production de protéines. Les systèmes sans cellules résultantes peuvent être utilisées comme point de départ pour construire imite cellulaires de plus en plus complexes.

Résumé

En quarts de travail d'intérêt à partir de molécules individuelles à des systèmes de molécules, un nombre croissant de laboratoires ont cherché à construire de bas en haut imite cellulaires qui représentent mieux la complexité de la vie cellulaire. À ce jour, il ya un certain nombre de chemins qui pourraient être prises pour renforcer imite cellulaires compartimentées, y compris l'exploitation des émulsions eau dans huile, des dispositifs microfluidiques et des vésicules. Chacune des options disponibles a des avantages et des inconvénients spécifiques. Par exemple, les émulsions eau-dans-huile donne une grande efficacité d'encapsulation, mais ne reproduisent pas bien la barrière de perméabilité des cellules vivantes. Le principal avantage des méthodes décrites ici, c'est qu'ils sont tous facile et pas cher à mettre en œuvre. Machines transcription-traduction est encapsulé à l'intérieur de vésicules de phospholipides par un processus qui exploite l'instrumentation commune, comme un évaporateur centrifuge et une extrudeuse. Les réactions sont suivies par spectroscopie de fluorescence. Le protocoles peuvent être adaptés pour l'expression de protéines recombinantes, la construction de mimiques cellulaires, l'exploration des exigences minimales de la vie cellulaire, ou l'assemblage de circuits génétiques.

Introduction

Acellulaire in vitro réactions transcription-traduction et la production de vésicules de lipides synthétiques ne sont pas nouvelles. Cependant, la combinaison des deux dans un cellulaire imiter est nettement plus challenging1-6. E. des extraits de cellules de E. coli avec ou sans T7 ARN polymérase ne peuvent être utilisés en tant que source de la machinerie de transcription-traduction 7,8. Des extraits cellulaires avantage de la présence d'autres composants cellulaires qui peuvent faciliter l'expression de protéines et de pliage. Alternativement, un mélange d'ARN purifiés individuellement et les molécules de protéines, c'est à dire le système PURE 9, peut être utilisé comme intermédiaire pour la synthèse des protéines intravésiculaire 4,10-14. Le système PURE permet la construction de mimiques cellulaires entièrement définis et ne souffre pas de l'activité nucléase trouvé dans les extraits cellulaires. Pratiquement, cela signifie que beaucoup moins matrice d'ADN est nécessaire, ce qui facilite les processus avec une faible efficacité d'encapsulation 11 . Bien que moins fréquemment utilisés, imite cellulaires peuvent être construits avec des extraits cellulaires dérivées de eucaryote cells15. Jusqu'à présent, les cascades encapsulées codées génétiquement et imite cellulaires qui captent l'environnement ont été signalés 16-18.

Le plus simple pour surveiller les effets transcription-traduction est de mesurer la fluorescence ou luminescence d'éléments génétiquement codés. En règle générale, la luciférase de luciole 19 ou GFP sont utilisés, bien in vitro réactions sont souvent mesurés par marquage radioactif. La détection par fluorescence permet en outre pour le suivi des populations de vésicules 20,21 par des méthodes basées sur la cytométrie, offrant ainsi un aperçu de la nature stochastique des processus biologiques comparables. Ces méthodes de surveillance ont été utilisées pour définir un petit ensemble de règles de conception et d'une bibliothèque de pièces à partir de laquelle construire à partir, y compris une collection de protéines fluorescentes qui sont compatibles avec in vitro transcription-traduction 22, l'influence de l'organisation génétique sur l'expression 22, l'activité des facteurs sigma 16, et l'efficacité de terminaison de la transcription 23. Néanmoins, il reste beaucoup qui doit être fait pour augmenter la capacité de construire prévisible in vitro, des dispositifs codées génétiquement.

Il existe de nombreuses méthodes disponibles pour faire des vésicules. Les méthodes les plus courantes dépendent de la génération d'un film lipidique mince sur une surface de verre, suivie par remise en suspension dans une solution aqueuse Solution24. Si la solution aqueuse contient machines transcription-traduction, par exemple, une fraction des vésicules formées contiendrait les éléments nécessaires pour la production de protéines. Cependant, le rendement d'encapsulation de tels procédés est faible, ce qui signifie que seulement une faible proportion des vésicules sont actifs. Beaucoup de méthodes alternatives caractérisées par beaucoup plus eff d'encapsulationiciency exploiter la conversion des gouttelettes de l'émulsion eau-dans-huile à des vésicules. Bien qu'il soit probable que ces méthodes seront monnaie courante dans l'avenir, pour le moment ces méthodes souffrent de la nécessité d'un équipement spécialisé et donnent des vésicules avec la membrane compositions modifiées 25. Un avantage particulier de l'eau-dans-huile à des procédés de la vésicule est le potentiel de contrôle de lamellarité de la membrane. Le procédé décrit ici est basé sur le protocole de couche mince de lipide décrit par le laboratoire Yomo 11 avec de légères modifications, notamment une étape d'homogénéisation complémentaire. Cette méthode est facile, pas cher, et donne des vésicules robustes et adaptés pour l'encapsulation des machines transcription-traduction.

Protocole

1. Préparation de la matrice d'ADN

  1. Purifier plasmide à partir d'une souche de laboratoire standard de E. coli, tels que E. coli DH5a ou en Nouvelle-bleu avec un kit commercial. Alternativement, un produit PCR linéaire peut être purifié même avec un kit commercial. On élue l'ADN avec H 2 O seulement.
  2. Phénol-chloroforme extraire la solution d'ADN 26.
  3. Déterminer la concentration de l'ADN et de la pureté, par exemple par absorbance UV ou d'autres méthodes appropriées. Il est important d'utiliser l'ADN de haute pureté pour l'efficacité de transcription-traduction.

2. Préparation de la Lipid Thin Film

  1. Peser la poudre lipidique sec et dissoudre dans un solvant. Pour 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), les solutions mères sont préparées dans du chloroforme à une concentration de 40 mg / ml.
    Note: solvants organiques doivent être manipulés avec des pipettes en verre et de bouteilles. En d'autres termes, le plastique ne doit jamais être utilisé. S Storesolutions tock dans serrés, solvants bouteilles en verre de couleur ambre résistant à l'air à -20 ° C, de préférence sous argon.
  2. Aliquote 12 pmol POPC (220 ul de 40 mg / ml de solution mère) dans un ballon à fond rond de 5 ml.
  3. On évapore le solvant à l'évaporateur rotatif (figure 1) pour générer le film lipidique mince.
    1. Fixer fermement le ballon à fond rond pour le tube de distillation avec une pince circulaire et démarrer la rotation du ballon.
    2. Initier la circulation de l'eau à travers le serpentin de condenseur. L'utilisation d'un bain de chaleur n'est pas nécessaire, parce que le chloroforme a un faible point d'ébullition de 61,2 ° C à la pression atmosphérique normale.
    3. Assurez-vous que le système est ouvert à l'atmosphère par vérifier que le robinet est ouvert. Tournez sur la pompe à vide et fermer lentement le robinet d'appliquer le vide pour le système.
    4. Un film mince de lipides se dépose sur les parois du ballon à fond rond pendant l'évaporation rotative formant un film opaquece qui est visible à l'œil nu. Soit l'évaporation rotative continuer à 0,5-2 h. Pour arrêter le processus, relâchez lentement la pression de vide, arrêter la rotation, et enlever le ballon à fond rond.

3. La remise en suspension des lipides et l'homogénéisation des vésicules

  1. Ajouter 1 ml 18,2 MQ H 2 O pour le film lipidique mince directement dans le ballon à fond rond. Vigoureusement vortex de la solution à la vitesse maximale, soit environ 3200 tours par minute, jusqu'à ce que le film lipidique se détache du verre, qui est observable à l'oeil nu.
  2. Transférer la dispersion lipidique dans un tube de 2 ml.
  3. Mise en place d'un anneau support pour tenir une homogénéisation avec une pointe de 5 mm. Placer une cale de centrifugation ci-dessous l'homogénéisateur pour tenir solidement la dispersion des lipides. Rincez l'élément de dispersion de l'homogénéisation en plongeant la pointe dans 18,2 MQ H 2 O et courir pendant quelques secondes.
  4. Placer l'élément de dispersion directement dans la dispersion lipidique assurant èmeà la pointe ne touche pas le fond du tube de centrifugation. Homogénéiser pendant 1 min à puissance 4 ou 14.000 tours par minute.

4. Extrusion des vésicules et lyophilisation

  1. Assembler les parties de la mini-extrudeuse (figure 2), qui se compose d'une enveloppe extérieure et d'un écrou de retenue qui loge deux membrane Téflon interne prend en charge, les deux joints toriques, et un palier en téflon.
    1. Placer les deux joints toriques dans les rainures des supports de membrane interne. Pré-imbibé deux filtres et une membrane de 400 nm. Les filtres seront placés contre le Teflon à l'intérieur des joints toriques avec la membrane entre eux.
    2. Placer la membrane prend en charge dans la gaine à l'extrudeuse avec la membrane entourée de deux filtres en entre les joints toriques. Placer le roulement Teflon l'intérieur du boîtier et fixez l'écrou de retenue et serrer à la main.
  2. Rincer deux seringues et de remplir un avec 18,2 MQ eau. Insérer les aiguilles de seringues dans le petit holes du téflon sur chaque extrémité de l'ensemble d'extrusion. Les aiguilles doivent glisser facilement, ne forcez pas les aiguilles. Fixez l'extrudeuse avec les seringues dans le boîtier extrudeuse et coudre.
  3. Faire passer l'eau à travers l'extrudeuse en poussant doucement l'eau sur une seringue et dans l'autre. Cela représente un passage. Répétez l'opération pour un total de trois passages assurant qu'il n'y a pas de fuites actuelles. Retirez la seringue de l'eau et de disposer de l'eau.
  4. Remplir une seringue avec l'échantillon, attacher à l'extrudeuse, et passer lentement la solution de vésicules à travers la membrane tel que décrit ci-dessus à l'étape 4.3. Répétez 10 fois pour un total de 11 passages. Comme le procédé d'extrusion produit, l'échantillon sera moins trouble et plus facile à pousser à travers la membrane. Une baisse soudaine de la résistance, cependant, indique généralement une rupture de la membrane.
  5. Transférer la solution de la vésicule extrudé et faire 40 aliquotes des vésicules dans des microtubes.Un gel chaque aliquote soit dans de la neige carbonique ou l'azote liquide.
  6. Lyophiliser chaque aliquote avec un évaporateur centrifuge pendant la nuit à 30 ° C. Stocker les vésicules vides lyophilisés à -20 ° C.

5. Encapsulation transcription-traduction Machinery

  1. Mélanger les composants de la réaction de transcription-traduction et ajouter 20 unités d'inhibiteur de RNase. Incuber sur de la glace.
  2. Ajouter la matrice d'ADN. Pour obtenir une réaction de contrôle, 250 ng de plasmide mVenus de codage ou une protéine fluorescente similaire derrière un promoteur de transcription T7 et une forte E. coli site de liaison de ribosome est recommandé.
  3. Porter le volume final de 25 pi avec de l'eau sans RNase.
  4. Hydratez une aliquote de vésicules lyophilisés (de l'étape 4.6) avec 10 pl de la réaction assemblé à l'étape 5.3. vortex brièvement le mélange jusqu'à ce que les vésicules sont remises en suspension. Cela devrait prendre moins de 30 secondes.
  5. Incuber la réaction sur la glace pendant 30 min pour permettre aux vésicules à gonfler.
  6. Diluer le mélange de la vésicule 20 fois pour un volume final de 30 pi en ajoutant 1,5 ul de vésicules dans 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,4 et 1,5 ul de 20,2 mg / ml protéinase K. DNase et RNase peuvent également être ajoutés à ce stade comme une alternative à la protéinase K à dégrader matière extravésiculaire.
  7. Incuber pendant au moins 2,5 h à 37 ° C.

6. Microscopie

  1. Examiner les vésicules et les progrès de la production de la protéine fluorescente à différents points dans le temps. Les vésicules auront un diamètre plus grand que les pores de 400 nm de taille de la membrane utilisée pour l'extrusion de la vésicule.
    1. Préparer une chambre d'échantillon en plaçant un x 5 mm entretoise 20 de silicium sur une lame de microscope standard. Pipette 10 pl de vésicules dans la chambre de l'échantillon. Placez une siliconé lamelle de verre sur la chambre.
    2. Respecter les vésicules avec un 63X huile dispersion or objectif similaire par champ lumineux et la microscopie de fluorescence en utilisant l'ensemble de filtre correspondant pour la protéine fluorescente exploité.

Résultats

La microscopie à fluorescence révèle que la fluorescence est observée uniquement à l'intérieur des vésicules, parce que le matériel extravésiculaire est dégradé par voie enzymatique (figure 3). Pour l'expression de mVenus, intravésiculaire fluorescence commence à être observée au bout de 1,5 heures à 37 ° C et atteint l'intensité de fluorescence maximale dans 6 h. La température optimale et le temps d'incubation peut varier en fonction des constructions spécifiques utilisés. Par exemple, différentes protéines fluorescentes mûrissent très différemment d'une manière dépendante de la température. En d'autres termes, l'observation de la production de protéines n'est pas uniquement dépendant de la synthèse des protéines et le pliage mais aussi sur la formation du chromophore. Synthèse globale des protéines peut être augmentée en incorporant les pores de la protéine de membrane pour permettre l'afflux des composants épuisés nécessaires à la transcription et à la traduction 27.

Il est recommandé d'effectuer un analogue transcription traduction réaction en l'absence de vésicules à ce que la construction génétique est exploité fonctionnelle. Cette réaction de contrôle est plus facilement contrôlée par spectroscopie de fluorescence plutôt que la microscopie. Figure 4 montre une réaction de transcription-traduction in vitro d'une construction mVenus d'encodage. Réactions non encapsulées donner beaucoup plus intensités de fluorescence totaux que intravésiculaires réactions similaires. Cela est dû à l'efficacité d'encapsulation et parce que le volume total de intravésiculaire est beaucoup moins que le volume extravésiculaire (soit un effet de dilution).

figure-results-1
Figure 1. L'évaporateur rotatif et pompe à vide. Cliquez ici pour agrandir l'image .

figure-results-2
Figure 2. L'logement et des parties de l'extrudeuse sont présentés séparément. De gauche à droite, une seringue, écrou de retenue, roulement en téflon, membrane interne prend en charge avec des joints toriques noirs face de l'autre, extrudeuse enveloppe extérieure et la deuxième seringue. Cliquez ici pour agrandir l'image .

figure-results-3
. Figure 3 images de fluorescence de la production de protéines mVenus dans des liposomes A et C:.. Des images de fond clair de vésicules multilamellaires après 1,5 h et 2,5 h et B &# 160; D: La production de mVenus est visualisé par fluorescence (couleur verte) après 1,5 et 2,5 heures, respectivement. Barre d'échelle est de 20 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

figure-results-4
Figure 4. Dans la réaction de contrôle in vitro de non encapsulé transcription in vitro et la traduction de mVenus. L'intensité de fluorescence a été mesurée toutes les 5 min pendant 4 heures. Les données ont été acquises avec un instrument PCR en temps réel. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Bien que la biologie synthétique acellulaire est encore à ses balbutiements, des progrès ont jeté une base à partir de laquelle les systèmes cellulaires comme de plus en plus complexes peuvent être faites. La reconstitution de la machinerie de transcription-traduction à partir de composants entièrement défini 9 à l'intérieur de vésicules 28 a été particulièrement important en facilitant les efforts ultérieurs dans la construction artificielle soucieux de l'environnement cells17, 18. De même, les études sur les cellules artificielles ont été utilisés pour sonder les processus évolutifs 4,29,30, les détails mécanistiques de la synthèse d'ARN et de protéines 22,31, les influences de métabolique load32, 33 ans, et l'assemblage des particules virales 34. Surtout, suffisamment de connaissances existe maintenant que la fonction cellulaire de base peut être reconstitué à l'intérieur de vésicules dans le laboratoire suite à ces précédents rapports et les protocoles décrits ici.

En plus d'être facile, l'encapsulation décrite procedure a plusieurs avantages. Par exemple, de nombreux vides, portions de vésicules lyophilisés peuvent être faites à l'avance et stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Le protocole n'est pas soumis molécules biologiques aux solvants organiques, les changements brusques de température, ou de longues périodes de dialyse. Nous nous attendons à ce que la douceur de la procédure facilitera l'intégration de composants supplémentaires au besoin. Nous avons également pas été observé d'effets défavorables pour modifier la composition lipidique de la membrane sur l'encapsulation ou l'efficacité de transcription-traduction. Par conséquent, les lipides plus favorable à l'incorporation de protéines membranaires, des morphologies spécifiques, ou la visualisation pourraient éventuellement être exploitées.

La principale limite de la méthode décrite est que les vésicules résultantes ne sont pas homogènes en taille ou lamellarité. Pour de nombreuses applications, ces difficultés ne nuisent pas à l'interprétation des données. Toutefois, si nécessaire, des mesures supplémentaires peuvent être incorporés à th étroitdistribution de la taille de l'e et de diminuer les couches de membranes, telles que des cycles supplémentaires de l'extrusion après l'encapsulation, de gel-dégel, ou de dialyse 35. Sans doute de meilleures méthodes permettant de contourner ces problèmes et d'autres seront développés. Jusque-là, nous trouvons le protocole décrit ici à être bien adapté pour la construction de mimiques cellulaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient la Fondation Armenise-Harvard, la Marie-Curie Trentin COFUND (ACS), la province autonome de Trento (Ecomm), et CIBIO de financement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Quick Spin Mini-prep kitQiagen27104
SpectromètreNanoDrop 1000NDB767ND
POPCAvanti Polar Lipids770557MW 760 g/mol
Transition Temp -2 ° ; C
CAS# 26853-31-6
ÉthanolSigma Aldrich459836anhydre, >99,5
Phénol-choloroforme-alcool isoamylique 25:24:1, pour la biologie moléculaireSigma AldrichP3803-100mLSaturé de 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA
ChloroformeBiotech Grade Fluka496189-1LContient de l’éthanol à 0,5-1,0 % v/v comme stabilisant
Bouteillesen verre brun ambréVWR89043-51855X 48 mm
Évaporateur rotatifBuchi Rotovapor R-210/SigmaZ563846EU-1EAAvec vérin et bain-marie, joint 29/32 240 V
Mélangeur vortex analogiqueVWR945300Vitesse 1 000-3 200 tr/min
HomogénéisateurIKA T10 Basic Ultra-Turbax3420000
Mini-extrudeuseAvanti Polar Lipids610020
Filtres d’extrudeurWhatman610014disque de vidange 10 mm  ;
Extrudeuse membrane polycarbonate 400 nmWhatman61007polycarbonate nuclépore  ;
Concentrateurd’ADN 7970011Centritrap
PURExpress NewEngland BiolabsNRM #E6800S
inhibiteur de l’ARNASE (40 000 U/ml)New England Biolabs#M0307S
Protéinase K (20,2 mg/ml)Microscope Fermentas#EO0491
Zeiss Observer Z1avec une caméra
RealTimeCFX96 Système de détection PCR en temps réel (Biorad)
Presse à silicium pour sceller  ; -Sonde moléculaireLife TechnologiesP18174Résistante de  ; -25-30 ° ; C
Glissières de couvercle circulaire en verre siliconéHampton ResearchHR3-231  ;   ; Diamètre= 22 mm
ImageJNIH
 %AxioCam MRm

Références

  1. Forster, A. C., Church, G. M. Towards synthesis of a minimal cell. Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).
  2. Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).
  3. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).
  4. Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes. J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).
  5. Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. Cellular imitations. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).
  6. Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. Approaches to chemical synthetic biology. FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).
  7. Noireaux, V., Shin, J. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).
  8. Fujiwara, K., Nomura, S. -iM. Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells. PLoS ONE. 8, e54155(2013).
  9. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
  10. Hosoda, K., et al. Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction. Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).
  11. Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes. Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).
  12. Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).
  13. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  14. Caschera, F., et al. Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression. Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).
  15. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles. Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).
  16. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).
  17. Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop. Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).
  18. Martini, L., Mansy, S. S. Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression. Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Sunami, T., et al. Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter. Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).
  21. Saito, H., et al. Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes. ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).
  22. Lentini, R., et al. Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. , (2013).
  23. Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase. Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).
  24. Trochilin, V. P., Weissig, V. Liposomes: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (2003).
  25. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  27. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).
  28. Yu, W., et al. Synthesis of Functional Protein in Liposome. J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).
  29. Caschera, F., et al. Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles. Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).
  30. Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism. ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).
  31. Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes. ACS Synth. Biol. 10, (2012).
  32. Stögbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., Rädler, J. Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system. Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).
  33. Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system. BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).
  34. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).
  35. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of Large Monodisperse Vesicles. PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Encapsulation vésiculaireTranscription-traductionPréparation de films lipidiquesMéthode d'extrusionMicroscopie à fluorescenceÉvaporateur centrifugeExpression protéiqueVésicules synthétiquesAssemblage ascendu (bottom-up)
L'encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.