Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

Résumé

Les essais multiplex peuvent fournir des informations utiles pour les mécanismes cellulaires de base et d'éliminer les déchets de réactifs et d'expériences répétitives inutiles. Nous décrivons ici une caspase-3/7 dosage de l'activité de multiplexage, en utilisant des procédés fluorescents, luminescents et située, pour déterminer la viabilité cellulaire dans un modèle in vitro de l'hypothalamus après provocation par oxydation avec de l'acide palmitique.

Résumé

La capacité de multiplexer des dosages dans des études sur les mécanismes cellulaires complexes élimine la nécessité d'expériences répétitives, fournit des contrôles internes, et diminue les coûts des déchets et des réactifs. Nous décrivons ici l'optimisation d'un dosage multiplex à évaluer l'apoptose suivant un acide palmitique (PA) de défi dans un modèle hypothalamique in vitro, en utilisant à la fois fluorescent et luminescent à base de dosages pour mesurer le nombre de cellules viables et de la caspase-3/7 activité dans un 96 puits format de plaque de microtitration. Après l'épreuve PA, les cellules viables ont été déterminés par un essai fluorescent à base resazurine. Caspase-3/7, puis l'activité a été déterminée en utilisant un substrat luminescent, DEVD, et normalisée au nombre de cellules. Ce test de multiplexage est une technique utile pour déterminer les changements dans l'activité de la caspase la suite d'un stimulus apoptotique, tel que défi d'acide gras saturé. L'acide gras saturé PA peut augmenter le stress oxydatif et l'apoptose hypothalamique, indiquant l'importation potentielnce de tests tels que celui décrit ici à l'étude de la relation entre les acides gras saturés et de la fonction neuronale.

Introduction

Les régimes riches en acides gras saturés comme l'acide palmitique (PA) ont été associés à l'obésité et d'autres comorbidités, notamment les maladies cardiovasculaires et le diabète ^{1, 2.} On a également montré les régimes alimentaires riches en matières grasses d'augmenter le stress oxydatif, l'apoptose, et la dégénérescence des neurones de l'hypothalamus, un important régulateur de l'appétit et les dépenses énergétiques ^3-7. Comprendre le mécanisme par lequel l'exposition de régime riche en graisses induit dérèglement hypothalamique est donc important pour le développement de traitements pharmacologiques de l'....

Protocole

1. Placage et entretien de culture cellulaire

1. Modified Eagle Medium chaud Dulbecco (DMEM) des milieux de culture (DMEM + 10% FBS + 1% pénicilline / streptomycine / néomycine) à 37 ° C.
2. Obtenir stock de cellules congelées A12 à partir de -80 ° C.
3. Décongeler rapidement dans les cellules à 37 ° C bain d'eau; une fois décongelé, en douceur les cellules de pipette pour transférer à un évent flacon de culture de 75 cm ² et ajouter 10 ml de milieu de culture.
4. Incuber ballon pendant une nuit sous 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C. Aspirer le milieu après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Continuer jusqu&....

Résultats

Le protocole ci-dessus présente les résultats de multiplexage deux essais distincts pour déterminer les mécanismes de la mort cellulaire. Figure 1 montre une vue d'ensemble du protocole pour déterminer la viabilité cellulaire et de la caspase-3/7 activité. l'activité de la caspase était significativement augmentée dans les cellules provoqués avec PA après 2 heures d'incubation (figure 2A et le tableau 1). La perte d'intégrité de la membrane cellulaire es.......

Discussion

Le test multiplex est une technique bien acceptée qui a été utilisé par les scientifiques dans de nombreuses applications telles que les puces à ADN de PCR, immunodétection, et d'autres méthodes de détection à base de protéines ^{de 13, 14.} Récemment, des tests de multiplexage sont devenus de plus en plus utilisés dans des expériences in vitro sur la base de plaque et ont été validées comme une méthode précise pour évaluer la cytotoxicité et de la viabilité ^12. Dans le protocole.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire de l’hypothalamus de souris adulte mHypoA-1/2  ;	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium	Invitrogen	10313-039
Sérum de veau fœtal  ;	PAA Labs	A15-751
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15070-063
Acide palmitique	Sigma-Aldrich	P0500
Dimethy Sulfoxide  ;	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue Réactif de viabilité cellulaire	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems	Promega	G8091
96 W Plaque inférieure optique, polystyrène noir, traité par culture cellulaire, avec couvercle, stérile	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5	Dispositifs moléculaires multimodes sur microplaques