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L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

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DOI :

10.3791/51307

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10 février 2014

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1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

Dans cet article

Résumé

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

Résumé

Les canaux ioniques contrôler les propriétés électriques des neurones et d'autres types de cellules pouvant être excitées sélectivement par des ions permettant de couler à travers la membrane plasmique 1. Pour réguler l'excitabilité neuronale, les propriétés biophysiques des canaux ioniques sont modifiées par les protéines et molécules de signalisation, qui se lient souvent les chaînes elles-mêmes pour former un complexe hétéromère de canal 2,3. Des dosages traditionnels examinant l'interaction entre les canaux et les protéines régulatrices exogènes exigent des étiquettes qui peuvent éventuellement modifier le comportement de la protéine et de diminuer l'importance physiologique de la cible, tout en fournissant peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. Des biocapteurs optiques, tels que le système X-CORPS Biosciences BIND Scanner, utilisent une technologie sans étiquette roman, résonance longueur d'onde de réseau (GTR) de biocapteurs optiques pour détecter les changements dans la lumière réfléchie de résonance près du biocapteur. Cet essai permet la détection de l'importance relativechanger dans la masse à l'intérieur de la partie inférieure des cellules vivantes adhérentes à la surface du biocapteur résultant de ligands changements induits dans l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération, et les changements dans les interactions protéine-protéine à proximité de la membrane plasmique. Biocapteurs optiques GTR ont été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), les tyrosine kinases de récepteur, et d'autres récepteurs de la surface cellulaire. Les changements induits dans les interactions ligand-protéine canal ionique peuvent également être étudiés dans cet essai. Dans cet article, nous allons décrire la procédure expérimentale utilisée pour détecter la modulation de la Slack-B potassium activée au sodium (Na) K canaux par les RCPG.

Introduction

D'examen des cellules vivantes dans leur contexte physiologiquement pertinent est essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des cibles cellulaires. Cependant, des dosages examinant l'interaction entre les canaux et les protéines cytoplasmiques de régulation, tels que des essais de co-immunoprécipitation, fournissent généralement peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. La majorité des essais à base de cellules en cours de mesurer un événement cellulaire spécifique, tel que la translocation d'une protéine d'intérêt marqué de manière fluorescente. Ces tests nécessitent des modifications des protéines d'intérêt, qui peuvent potentiellement altérer le comportement de la protéine et de diminuer la pertinence physiologique de la cible. Des dosages à base de cellules non invasive, qui ne nécessitent pas la manipulation du système, fournissent une mesure en continu de l'activité cellulaire et permettant l'étude des cellules dans leur état ​​le plus physiologiquement pertinent 4.

Des biocapteurs optiques sont conçues pour produireun changement mesurable dans une caractéristique de la lumière qui est couplée à la surface du capteur. Biocapteurs optiques qui utilisent des ondes évanescentes, qui comprennent la résonance de plasmon de surface (SPR) et de la longueur d'onde de résonance de réseau (GTR) techniques, ont été principalement utilisés pour détecter les affinités et la cinétique des molécules se liant à leurs récepteurs biologiques immobilisés sur la surface du capteur. Plus récemment, disponibles dans le commerce biocapteurs GTR ont été développés pour permettre la détection de la variation relative de masse à l'intérieur de la partie de fond de cellules adhérentes à la surface du capteur à haute résolution spatiale (jusqu'à 3,75 um / pixel) 5. Ces biocapteurs peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique de cellules vivantes qui résultent de la stimulation, telles que l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération et de voies de signalisation induites par une variété de récepteurs de surface cellulaire, y compris des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 6 . Biocapteurs GTR détecter le chan rapportge dans l'indice de réfraction en fonction de la variation relative de masse à l'intérieur de 150 nm du biocapteur 7. Lorsque les cellules sont étalées au biocapteur, cette variation de l'indice de réfraction reflète la variation de la masse à proximité de la membrane plasmique de la cellule résultant d'un changement dans l'adhésion cellulaire au biocapteur. Ce protocole va discuter de la détection des interactions protéine-canal à l'aide de biocapteurs GTR.

GTR systèmes d'acquisition de données sont constituées de plusieurs composants. Parce que le X-CORPS Biosciences BIND scanner a été utilisé pour ces expériences, nous désignerons les composants de ce système particulier, qui se compose d'un lecteur de plaque, les biocapteurs associés, logiciel d'acquisition BIND de numérisation, et le logiciel BIND Voir d'analyse 8. Les biocapteurs à cristaux photoniques, appelées ci-après en tant que biocapteurs optiques, sont constitués d'un agencement périodique d'un matériau diélectrique et en deux ou trois dimensions qui empêchent la propagation de la lumière au spécifiquelongueurs d'onde et les directions. Des structures à cristaux photoniques sont basés sur un phénomène appelé anomalie de Wood. D'abord découvert par Wood en 1902, ces anomalies sont les effets observés dans le spectre de la lumière réfléchie par des réseaux de diffraction optiques où les variations rapides de l'intensité de certains ordres de diffraction se produisent dans certaines bandes de fréquences étroites. En 1962, Hessel et Oliner présenté une nouvelle théorie des anomalies de bois dans laquelle période finie réseau génère une longueur d'onde de résonance permanente 9. Dans les biocapteurs optiques décrits ici, les anomalies de bois sont utilisés pour produire un biocapteur GTR que lorsqu'elles sont stimulées par la lumière blanche ne reflète que très étroite bande de longueurs d'onde (typiquement entre 850 à 855 nm).

Biocapteurs individuels se composent d'une matière plastique à faible indice de réfraction avec une structure de surface périodique qui est revêtue d'une mince couche de matériau diélectrique de dioxyde de titane de réfraction élevé (TiO 2). Lorsque les Biosensou est éclairée par une large source de lumière de longueur d'onde, le réseau optique de cristaux photoniques reflète une gamme étroite de longueurs d'onde de la lumière qui est mesurée par un spectrophotomètre dans le scanner de BIND. L'intensité maximale des longueurs d'onde réfléchies (Longueur d'onde crête valeur, ou VOP) est alors calculée à partir du signal. Le VOP de déplacements lumineux lors d'un changement de l'indice de réfraction à la suite d'une augmentation ou une diminution de la masse à l'intérieur de la proximité (~ 150 nm) de la surface du biocapteur. Des biocapteurs optiques sont intégrés dans une société de la norme des sciences biomoléculaires (SBS) de 384 puits de microplaques pour les analyses utilisées dans ces expériences.

biocapteurs RWV sont utilisés pour détecter des changements lors de l'addition des signaux exogènes dans des cellules vivantes 10. Les cellules sont cultivées directement sur la surface d'un biocapteur GTR et la variation de l'indice de réfraction locale est surveillée lors du traitement avec des stimuli spécifiques. Le sens de variation de la masse au biocapteur peut êtredéterminé, car une augmentation de l'indice local de réfraction à partir de résultats d'une augmentation de la masse près du biocapteur et est mesurée par une augmentation de la VOP. Inversement, une diminution de la masse entraîne une diminution de la VOP. Le changement dans la VOP détecté peut résulter de nombreux événements cellulaires, y compris les changements dans l'adhésion cellulaire, la protéine de recrutement / release, endocytose et exocytose, le recyclage, l'apoptose, et du cytosquelette réarrangement. Par exemple, le dosage peut être détecter les changements dans les interactions protéine-canal entre les canaux potassiques et d'autres composants cytoplasmiques ou du cytosquelette. L'état de cause, cependant, doit avoir lieu dans la zone de détection ~ 150 nm proche du biocapteur, et dans le cas d'une cellule attachée, à proximité de la membrane plasmique. Acquisition de réponses cellulaires est effectuée avec le logiciel d'analyse BIND et une représentation d'image de chacun des 384 puits de la plaque SBS est généré. Ce système a une résolution de jusqu'à 3,75 um / pixel, ce qui permet la détection d'événements dans des cellules individuelles, etpeut être utilisé soit avec des lignées cellulaires (par exemple, des cellules HEK293 ou CHO) ou avec plus physiologiquement pertinente des cellules primaires. analyse d'image avec BIND Voir logiciel permet la détection des réponses cellulaires à la fois individuelle et des populations de cellules. Comme les biocapteurs sont incorporés dans la norme SBS 384 puits des microplaques, le système est facilement adaptable à un criblage à haut débit (HTS).

-Longueur d'onde de résonance des biocapteurs optiques de réseau ont déjà été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation du GPCR 11. Notre laboratoire a cloné deux canaux potassiques (K Na) activé sodium, Slack-B et Slick 12. L'activité des deux canaux B et Slack-luisant a été montré pour être très fortement influencé par une activation directe de la protéine kinase C (PKC) 13. L'activation de la protéine Ga de q récepteurs couplés, tels que le récepteur muscarinique M1 et la glutamate métabotropiques mGluR1 receptor, régule puissamment l'activité des canaux grâce à l'activation de la PKC. Ces canaux K Na contribuent à l'adaptation neuronale pendant la stimulation soutenue et régulent la précision de la synchronisation des potentiels d'action 14. Chaînes lâches sont connus pour interagir avec une variété de molécules de signalisation cytoplasmiques, y compris FMRP, la protéine Fragile X Mental Retardation 15,16. Des mutations dans le résultat Slack dans plusieurs crises partielles Migration de la petite enfance (MMPSI), une forme précoce de l'épilepsie qui se traduit par un retard de développement sévère 17.

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Protocole

Une. Culture cellulaire (Adapté de Fleming et Kaczmarek 18)

  1. cellules de la culture dans les médias appropriés pour plus de 2 mais moins de 10 passages avant de l'utiliser dans cet essai. Non transfectées cellules HEK-293 et ​​des cellules HEK-293 exprimant de manière stable rat protéine Slack-B sont cultivés dans du milieu d'une moitié de Dulbecco Modified Eagle et une moitié milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau foetal et des antibiotiques. 500 pg / ml de généticine (G418) est ajouté à des cellules HEK-293 exprimant de manière stable Slack-B pour sélectionner pour l'expression du canal Slack. cellules Passage à 70-90% de confluence par dissociation des plats avec une solution de trypsine-EDTA 0,25%.

2. La matrice extracellulaire (ECM) Revêtement du TiO 2 384 puits biocapteur optique Plaque avec la fibronectine et l'ovalbumine

  1. Préparation du mélange d'ECM et la fibronectine solution de blocage de l'ovalbumine
    1. Préparer une solution de travail de fibronectdans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 5 pg / ml de fibronectine dans 20,0 ml de PBS. De 1,0 mg / ml concentration de bouillon, ajouter 100 pi à 20,0 ml de PBS pour une dilution de 200 fois. La solution de travail de la fibronectine peut être aliquote et stocké à -20 ° C après la préparation.
    2. Préparer une solution mère de 5% d'ovalbumine inactivé par la chaleur de l'eau stérile. Diluer l'ovalbumine dans l'eau de qualité pour culture tissulaire stérile pour une solution à 5% et à la chaleur pour inactiver les 30 min à 60 ° C. Refroidir la solution à la température ambiante et filtre stérile de la solution. Aliquoter la solution d'ovalbumine à 5% et conserver à 4 ° C.
    3. Préparer une solution de travail de 2% d'ovalbumine par dilution de la solution mère de 5% dans du PBS. Par exemple, ajouter 12,0 ml de solution d'ovalbumine du stock de 5% à 18,0 ml de PBS pour un volume final de 30,0 ml.
  2. 384 puits couche de plaque de biocapteur optique
    1. Hydrater la plaque TiO 2 avec 20,0 ul / puitsde l'eau stérile de qualité pour culture de tissus pendant 15 min. Les étapes suivantes doivent être effectuées avec une pipette 16 canaux.
    2. Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits.
    3. Ajouter 20,0 ul de la solution de travail de la fibronectine à chaque puits et incuber pendant 2 heures à la température ambiante pour créer l'ECM.
    4. Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits.
    5. Ajouter 40,0 ul de la solution de travail de l'ovalbumine à chaque puits et incuber pendant une nuit à 4 ° C pour bloquer la plaque.
    6. Laver la plaque 3x avec 50,0 ul de PBS par puits. des plaques revêtues d'ECM peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures.

3. Ensemencement des cellules sur la 384 et la plaque de biocapteur optique

  1. Retirer les milieux de croissance des cellules et ajouter de la trypsine pour détacher les cellules de la plaque. Recueillir les cellules et centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Retirez le support de la trypsine et remettre les cellules dans un milieu de croissance.
  2. L'utilisation d'un hémocytomètre ou un système automatisécompteur de cellules, déterminer la concentration des cellules.
  3. Afin de minimiser les effets de l'évaporation au cours de l'incubation, 50,0 ul de milieu de croissance par puits sera utilisé. Les cellules doivent être dilués pour obtenir le nombre désiré de cellules par puits dans un volume de 50,0 pi de milieu de croissance. Pour ces expériences, 1000 cellules / puits ont été étalés sur le biocapteur.
  4. Laisser les cellules ensemencées à incuber pendant une nuit dans du milieu de croissance à 37 ° C sous air / 5% CO 2.

4. Préparation des biocapteurs et de composés Plaques pour le dosage GTR optique biocapteur

  1. Retirer la plaque de l'incubateur et éliminer le milieu de croissance des cellules. Laver les cellules 1x avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Ajouter 25,0 ul de HBSS à chaque puits.
  2. Placer la plaque de biocapteur du scanneur BIND et laisser les cellules s'équilibrer à la température ambiante pendant 1-2 heures.
  3. Préparer une plaque de composé séparé de ligands d'intérêt qui seront annonceded à la plaque de biocapteur pendant le dosage. Pour ces dosages, 25,0 ul de solution contenant le composé a été ajouté à chaque puits sur la plaque de biocapteur pour un volume total de 50,0 ul. En tant que tels, les composés en solution ont été préparés dans le 2x concentration finale souhaitée.

5. Effectuez le test GTR optique biocapteur

  1. Prendre une mesure de référence avec le système de scanner pour les puits A1-P12 (la moitié de la plaque 384 puits SBS) avec une résolution maximale de 3,75 um / pixel pour la centrale de 1,5 mm de chaque puits en utilisant le logiciel BIND Scan. Cette analyse de base dure environ 30 min.
  2. Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits pour les puits A1-P12.
  3. Prendre une mesure de base de puits A13-P24.
  4. Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits dans les puits A13-P24.
  5. Prenez une mesure de l'addition post composé de puits A1-P12, et répéter pour les puits A13-P24.

6. Analyse des données de dosage avec BIND Voir

  1. Ouvrez les données d'analyse de BIND pour la mesure de référence dans Windows, et cliquez sur le bouton "Grid Editor" pour permettre la sélection de cellules. Le logiciel calcule les paramètres d'intérêt définis par l'utilisateur.
  2. Ouvrez les "plug-ins", qui comprennent le "Finder portable" et la fonction "Baseliner". Définissez les paramètres dans "Finder portable" pour que les cellules se distinguent de l'arrière-plan du biocapteur.
  3. Exportez le fichier de la carte de la cellule qui contient les données "portable Finder" pour la mesure de référence.
  4. Répétez les étapes 6.1 à 6.2 pour les données poste d'addition de composé.
  5. Ouvrez le "Baseliner" plug-in et importer la carte de la cellule à partir de la mesure de référence. Le logiciel calcule le décalage dans la VOP entre les données de base et post composés.
  6. Sélectionnez "Δ cellulaire moyen" pour la sortie du décalage moyen dans la VOP pour les cellules. Les données peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse ultérieure.

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Résultats

Slack-B transfectées de façon stable cellules HEK-293 et ​​le contrôle non transfectées cellules HEK-293 ont été ensemencées à 1000 cellules / puits sur 384 et, ECM revêtu GTR plaques de biocapteurs. Images de la centrale de 1,5 mm 2 du biocapteur ont été enregistrées à une résolution de 3,75 um / pixel (Figure 1). gradient de densité de masse des cartes ont été générées avant et 30 minutes après l'addition de composé avec le logiciel BIND Scan. La BIND Voir logiciel a été utilisé pour dé...

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Discussion

Le premier de Z (Z ') de facteur est une méthode statistique commun pour quantifier la qualité d'un dépistage dosage à haut débit 20, et parce que le dépistage des agonistes de RCPG dans cet essai a eu lieu dans un essai de 384 puits compatible SBS, fournit une excellente mesure de la robustesse et de la validité de ce test 21. AZ "valeur 1 indique une analyse théoriquement idéale avec un nombre infini de points de données avec des écarts types inexistants. AZ "valeur comprise ent...

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Déclarations de divulgation

Steven M. Shamah est un employé de X-CORPS Biosciences.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Yangyang Yan dans le laboratoire du Dr Fred Sigworth à l'Université de Yale pour le généreux don de cellules HEK293 exprimant de façon stable la protéine rat Slack-B. En outre, les auteurs tiennent à remercier le Dr Sigworth pour cryo-microscopie électronique modèle d'homologie de Slack affiché dans la vidéo d'introduction. Cette recherche a été financée par le NIH subventions DH067517 et NS073943 à LKK

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM, High GlucoseLife Technologies11965-092
Leibovitz’s L-15 MediumLife Technologies11415-064
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)Life Technologies15140-122
Geneticin G-418 SulfateBioanalytique américainAB05057
HBSSLife Technologies14025-092
Fibronectine du plasma humainSigma-AldrichF0895
Albumine du blanc d’œuf de pouleSigma-AldrichA5378
DPBSLife Technologies14190-144
Hausser Bright-Line Phase HemocytometerFisher Scientific02-671-6
Chlorure de carbamoylcholineSigma-AldrichC4382
SFLLR-NH2 sel de trifluoroacétateSigma-AldrichS8701
Finnpipette (5-50 µ ; l)Thermo Scientific4662090
BIND Scanner SystemX-BODY BiosciencesN/A
384-well TiO2 plaques revêtuesX-BODY BiosciencesTiO-96-CM

Références

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Mots-clés

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