Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Summary

La fixation de virions à une surface est une exigence pour l’imagerie à virion unique par imagerie par fluorescence à super-résolution ou microscopie à force atomique (AFM). Nous démontrons ici une méthode de préparation d’échantillons pour une adhérence contrôlée des virions aux surfaces vitrées adaptées à une utilisation dans l’AFM et l’imagerie par fluorescence à super-résolution.

Abstract

L’immobilisation des virions sur les surfaces vitrées est une étape critique dans l’imagerie à virion unique. Nous présentons ici une technique adoptée à partir d’essais d’imagerie à molécule unique qui permet l’adhésion de virions simples à des surfaces vitrées avec spécificité. Cette préparation est basée sur la greffe de la surface du verre avec un mélange de PLL-g-PEG et PLL-g-PEG-Biotine, l’ajout d’une couche d’avidine, et enfin la création d’ancres de virion par fixation d’anticorps spécifiques du virus biotinylé. Nous avons appliqué cette technique à travers une gamme d’expériences, y compris la microscopie à force atomique (AFM) et l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Cette méthode de préparation de l’échantillon se traduit par une adhérence de contrôle des virions à la surface.

Introduction

Les interactions non spécifiques basées sur la charge sont couramment utilisées pour l’adhésion des virions en microscopie à force atomique^1,2. Ces techniques fonctionnent particulièrement bien lorsqu’elles sont utilisées sur des virions non enveloppés avec des capsides très raides^3-6. Bien que ces techniques soient très efficaces pour immobiliser l’échantillon, elles n’empêchent pas la liaison non spécifique des protéines à la surface. La liaison non spécifique peut créer un problème lors de la tentative d’image des virions avec des techniques de fluorescence AFM et super-résolution qui nécessitent des incubations de l’échantillon avec divers anticorps. Nous décrivons ici une méthode de préparation d’échantillons pour l’immobilisation spécifique des virions.

Le poly(éthylène glycol) (PEG) greffé à la poly(L-lysine) (PLL) et adsorbé sur une surface vitrée fournit un bloc important pour les interactions électrostatiques des protéines avec le verre^7. Les dosages à molécule unique qui nécessitent l’immobilisation de molécules uniques sur des surfaces vitrées ont tiré parti de cette propriété et l’ont utilisée pour créer une technique d’immobilisation de molécule unique spécifique à base de PEG^8-10. Cette préparation a également été utilisée pour immobiliser des cages de clathrine sur la surface vitrée¹¹ ainsi que pour créer un revêtement homogène de fibronectine pour contrôler l’adhérence cellulaire ^12.

Nous avons adopté la méthode de préparation des échantillons basée sur l’adsorption PLL-g-PEG sur les surfaces vitrées à partir de méthodologies d’imagerie à molécule unique et l’avons appliquée à l’imagerie des virions uniques du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV). Ces virions simples ont été microscopés utilisant la microscopie de force atomique (AFM). Des expériences similaires ont également été réalisées sur des billes fonctionnalisées comme témoin. Les virions ont également été microscopiés par fluorescence à super-résolution où un anticorps VSV-G marqué avec Alexa 647 a été utilisé pour créer une image de l’enveloppe de virions simples. L’imagerie fluorescente haute résolution utilise la localisation de molécules uniques pour créer une image^13-15. L’imagerie bi-plane fPALM permet la localisation de molécules uniques avec une résolution de 20 nm dans le plan et de 50 nm le long de l’axe optique^15,16. Cette technique bi-plane a été utilisée pour imager des images fluorescentes à super-résolution présentes dans cette étude. Une technique alternative qui a des résultats similaires est STORM^13,17,18.

L’AFM et les images fluorescentes à super-résolution de VSV ancrées au verre par les procédures décrites dans ce document, ont montré une liaison spécifique des virions au verre avec un minimum d’interactions non spécifiques^19. Nous présentons ici les protocoles de préparation des échantillons pour l’AFM et les expériences d’imagerie fluorescente à super-résolution. En bref: Les lamphes de verre propres sont fonctionnalisées en adsorbant un mélange de PLL-g-PEG et de PLL-g-PEG-biotine. Il est typique que ce film mince soit conçu pour fournir entre 15 et 25% de biotine fonctionnalisée sur une surface enduite. Les lamelle sont en outre incubées avec de l’avidine tétramérique. Un anticorps viral biotinylé est ensuite utilisé pour créer un site de liaison unique pour les virions. La liaison de l’anticorps peut se faire de deux manières.

La première méthode est optimisée pour l’AFM, mais elle reste adaptée à l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Dans cette méthode, la surface enduite d’avidine est traitée avec de l’anticorps biotinylé avant l’adhésion virale. Les virions immobilisés sont traités avec un anticorps marqué Alexa 647 pour couvrir l’enveloppe et permettre l’imagerie par fluorescence super-résolution des virions.

La deuxième méthode consiste à attaquer le virus en solution avec l’anticorps biotinylé et l’anticorps marqué Alexa 647 avant d’adhérer les virus à la surface traitée à l’avidine; cette méthode est optimisée pour les expériences d’imagerie par fluorescence à super-résolution dans lesquelles la récupération de l’enveloppe virale est importante. Cette méthode a l’avantage de permettre un revêtement d’anticorps uniforme sur la surface virale. L’anticorps biotinylé peut être mélangé avec des anticorps viraux marqués par Alexa 647 dans des rapports qui permettent une adsorption suffisante du virus sur la surface traitée à l’avidine tout en maintenant une concentration élevée d’étiquette fluorescente à l’extérieur de l’enveloppe virale. Ces anticorps viraux marqués alexa 647 ne sont pas biotinylés et leur excès peut être rincé afin de réduire le bruit de fond.

Protocol

1. Préparation chimique

1. Préparation et stockage de PLL-g-PEG-Biotine et d’avidine:
   1. Dissoudre le polymère PLL-g-PEG-biotine dans un tampon PBS conformément au mode d’emploi du fabricant à une concentration de 1,0 mg/ml.
   2. Aliquote selon la taille de la lamelle de couverture (voir tableau 1)et conserver à -80 °C jusqu’à un an.
2. Préparation et stockage de l’Avidin/NeutrAvidin
   1. Dissoudre l’Avidin/NeutrAvidin non étiqueté dans le tampon PBS conformément au mode d’emploi du fabricant à une concentration de 1,0 mg/ml.
   2. Aliquote selon la taille de la lamelle de couverture (voir tableau 1)et conserver à -20 °C jusqu’à 3 ans.
3. Préparation des échantillons de virus : Préparer les échantillons de virus en fonction des besoins expérimentaux et du protocole de laboratoire avant cet essai. Utiliser l’étape 1.3.1 pour la méthode 5A ou 1.3.2 pour la méthode 5B.
   1. Préparer des échantillons de virus pour la méthode 5A avant le stade 2. Utiliser des échantillons viraux préparés dans les 1 à 2 jours suivant la préparation, ou une partie aliquote selon la taille du feuillet de couverture (voir le tableau 1),puis geler instantanément dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à un an. Une fois décongelé, utiliser immédiatement.
   2. Préparer des échantillons de virus pour la méthode 5B semblable à 1.3.1. Décongeler les aliquotes du virus avant le 5B et conserver à 4 °C pas plus de 24 heures avant le mélange avec des anticorps.
4. Préparer les anticorps biotinylés appropriés pour l’expérience.

2. Nettoyage de la lamelle de couverture en préparation pour le traitement chimique

1. Placez les lamelle dans un support de lamelle en téflon de taille appropriée qui les maintient dans une orientation verticale et plongez-les dans un bécher rempli d’alcool éthylique filtré (0,2 μm) (preuve 190).
2. Soniquez les lamaux dans l’alcool éthylique filtré (preuve 190) pendant 30 min.
3. Retirez les lamelle de l’alcool et rincez abondamment les lamelle avec de l’eau ultrapure.
4. Placez les lamelle de couverture rincées dans un support en téflon propre et séparé rempli de NaOH 1 M.
5. Soniquez les lamaux dans le NaOH 1 M pendant 30 min.
6. Retirez les lamelle de couverture de NaOH et rincez-les abondamment à l’eau ultrapure.
7. Séchez les lamaux de couverture rincés avec un flux d’azote et placez-les dans un support en téflon propre et sec.
8. Inspectez les lamaux de couverture pour tout film visible ou les particules qui restent sur la lamelle de couverture. S’il reste un matériau visible, la lame de couverture n’a pas été correctement nettoyée et rincée. Si vous n’êtes pas correctement nettoyé, répétez les étapes 2.1-2.7.
9. Nettoyez les lamaux avec de l’oxygène-plasma pendant 2 min. Cette étape est facultative mais recommandée.

3. Formation de la couche de film mince PLL-g-PEG

1. Immédiatement après séchage dans le flux d’azote (ou le plasma d’oxygène en option), placez une lamelle horizontalement dans une boîte de Pétri stérile. Pipet au centre de la lamelle une quantité appropriée de PBS décongelé tamponné PLL-g-PEG-biotine (voir tableau 1).
2. Placez une autre lamelle nettoyée sur le fluide dans une méthode sandwich. A noter que cette méthode consiste à faire incuber leurs films chimiques par deux lamisses chimiques en orientant leurs « faces actives » traitées chimiquement l’une vers l’autre, séparées uniquement par la couche chimique actuelle. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de liquide pour que le volume entre les deux lamelle soit complètement rempli de liquide, mais qu’aucun fluide ne s’échappe entre les lamelle (voir le tableau 1). La « face active » désigne désormais les faces à lamelle qui ont été en contact avec le fluide dans la configuration sandwich.
3. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 45-60 min.
4. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et ramassez le sandwich avec une pince à épiler. Veillez à ne pas pincer l’excès de liquide. Utilisez le pouce et l’index pour pincer légèrement le sandwich et faites glisser les lamures dans des directions opposées horizontalement l’une par rapport à l’autre, puis séparez les deux lamelle l’une de l’autre sans toucher les faces actives.
5. Rincer les deux faces actives avec de l’eau ultrapure en piper 25 ml d’eau ultrapure sur la face active 2-4x, puis sécher les lamaux avec un flux d’azote. Assurez-vous de noter quelles faces de lamelle sont actives.
6. Utilisez les lamaux de couverture immédiatement, ou stockez O / N avec le visage actif dans une boîte de Petri stérile placée dans un environnement sans poussière et peu humide.

4. Amélioration de la liaison Avidin

1. Placez une lamelle de couverture traitée PLL-g-PEG avec une face vers le haut active dans une boîte de Petri stérile.
2. Pipetter une quantité appropriée d’avidine décongelée dans un tampon (préparé à l’étape 1.2) sur le milieu de la taille active.
3. Placez une autre lamelle (visage actif vers le bas) au-dessus du fluide dans la méthode sandwich. Notez la face active des lamelle. Il est important que les faces actives soient en contact avec le fluide pendant l’incubation (voir étape 3.2).
4. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 25-30 min.
5. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et séparez les deux lamelle comme décrit à l’étape 3.4, en vous assurant de garder une trace des visages actifs et de ne pas les toucher.
6. Rincer les deux faces actives avec de l’eau ultrapure en piper 25 ml d’eau ultrapure sur la face active 2-4x, puis sécher les lamaux avec un flux d’azote. Notez la face active des lamelle. Utilisez immédiatement pour l’étape suivante.

REMARQUE IMPORTANTE : Il existe deux méthodes distinctes pour terminer la préparation de l’échantillon en fonction du type d’essai que l’expérience implique. L’expérimentateur doit passer à l’étape 5A au cours de laquelle le virus est ancré au verre avant d’ajouter tout traitement d’anticorps supplémentaire requis pour l’imagerie à super-résolution. Le point 5B décrit une autre méthode d’étiquetage du virus en solution avant de l’ancrer au verre. Les données représentatives de ce manuscrit sont préparées à l’aide de la section 5A. Une méthode appropriée devrait être choisie en fonction du type d’essai expérimental.

5A. Attache active d’anticorps de visage

1. Immédiatement après séchage avec un flux d’azote au stade 4.6, placez une lamelle active traitée à l’avidine face vers le haut dans une boîte de Petri stérile.
2. Pipeter une quantité appropriée d’anticorps biotinylés décongelés en tampon sur le milieu de la face active (voir tableau 1).
3. Placez une autre lamelle (visage actif vers le bas) au-dessus du fluide dans une méthode sandwich. Notez la face active des lamelle, il est important que les faces actives soient en contact avec le fluide pour l’incubation (voir étape 3.2.).
4. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 45-60 min.
5. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et séparez les deux lamelle comme décrit à l’étape 3.4, en vous assurant de garder une trace des visages actifs et de ne pas les toucher.
6. Rincer les deux faces actives avec du PBS en piper 25 ml de PBS sur la face active 2-4x, ne pas sécher et utiliser immédiatement. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
7. Placer une lamelle active traitée par anticorps face vers le haut dans une boîte de Petri stérile et pipeter une quantité appropriée de virus décongelé en tampon sur le milieu de la face active.
8. Placez une autre lamelle (visage actif vers le bas) au-dessus du fluide dans une méthode sandwich. Notez la face active, car il est important que les faces actives soient en contact avec le fluide pour l’incubation (voir étape 3.2.).
9. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 45-60 min.
10. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et séparez les deux lamelle comme décrit à l’étape 3.4, en vous assurant de garder une trace des visages actifs et de ne pas les toucher.
11. Rincer les deux faces actives avec du PBS en piper 25 ml de PBS sur la face active 2-4x. Ne séchez pas les lamaux de couverture, placez-les plutôt dans un rack en téflon et un bécher rempli de PBS immédiatement. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
12. Utiliser immédiatement les échantillons préparés ou les conserver dans un tampon approprié à 4 °C pendant trois jours au plus sans perte importante d’intégrité.
    
    REMARQUE IMPORTANTE : Si des échantillons doivent être utilisés dans un essai AFM, la préparation est terminée et ils peuvent être utilisés immédiatement ou stockés comme décrit aux étapes 5A.20 à 5A.21. Si les échantillons doivent être utilisés dans un essai d’imagerie par fluorescence à super-résolution, passez au marquage des anticorps décrit aux étapes 5A.12 à 5A.19.
13. Placez les deux lamèdes de couverture traitées par le virus actives face vers le haut dans une boîte de Petri stérile et pipetz suffisamment de tampon de blocage des protéines sur les lamelle de couverture pour perlé suffisamment de volume de fluide pour couvrir les 95% centraux de la lamelle sans couler de tampon de blocage de la lamelle (généralement 100 - 200 μl.) Incuber à RT pendant 60-90 min.
14. Retirez soigneusement le tampon de blocage en enlevant les lamelle une à la fois de la boîte de Pétri et en versant le fluide de la lamelle dans un bécher à déchets. Veillez à ne pas laisser tomber la lamelle de couverture.
15. Rincer les deux faces actives avec du PBS en piper 25 ml de PBS sur la face active 2-4x, ne pas sécher et utiliser immédiatement. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
16. Placer une seule lamelle active traitée par tampon de blocage face vers le haut dans une boîte de Petri stérile et pipeter une quantité appropriée d’anticorps viraux marqués par fluorescence dans un tampon sur le milieu de la face active.
17. Placez une autre lamelle de couverture (visage actif vers le bas) sur le dessus du fluide dans une méthode sandwich. Notez quelle face est active, il est important que les faces actives soient en contact avec le fluide pour l’incubation (voir étape 3.2).
18. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 30 min.
19. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et séparez les deux lamelle comme décrit à l’étape 3.4, en vous assurant de garder une trace des visages actifs et de ne pas les toucher.
20. Rincer les deux faces actives avec du PBS en piper 25 ml de PBS sur la face active 2-4x, ne pas sécher et utiliser immédiatement. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
21. Ne séchez pas les lamaux de couverture, placez-les plutôt dans un rack en téflon dans un bécher rempli de PBS. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
22. Utiliser immédiatement les échantillons préparés ou les conserver dans un tampon approprié à 4 °C pendant trois jours au plus sans perte importante d’intégrité.

5B. Attaque d’anticorps en solution

Cette méthode est une amélioration facultative de la stratégie d’étiquetage pour l’imagerie fluorescente à super-résolution. En appliquant l’attaque en solution, un meilleur revêtement d’anticorps sur la surface virale peut être obtenu.

1. Mélanger les solutions d’anticorps dans des rapports selon les besoins des expériences. Exemple 1:4 de rapport de 0,01 mg/ml d’anticorps biotinylés à 0,01 mg/ml d’anticorps marqués par fluorescence donnera une bonne affinité de liaison et permettra une bonne récupération d’enveloppe dans un test d’imagerie à super-résolution.
2. Mélanger des portions égales des solutions d’anticorps et de virus respectivement préparées en (5B.1) et (1.3). Mélanger doucement en pipetant de haut en bas quelques fois dans la partie aliquote. Cette solution résultante peut être conservée jusqu’à ce que nécessaire jusqu’à 24 heures à 4 °C.
3. À la fin de l’étape 4.6, placez une lamelle de couverture traitée à l’avidine avec une face vers le haut active dans une boîte de Petri stérile.
4. Pipetter une quantité appropriée de virus avec une solution d’anticorps (préparée à l’étape 5B.2) sur le milieu de la face active.
5. Placez une autre lamelle (visage actif vers le bas) au-dessus du fluide dans une méthode sandwich. Notez la face active, car il est important que les faces actives soient en contact avec le fluide pour l’incubation (voir étape 3.2).
6. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur le sandwich à la lamelle et incuber à RT pendant 45-60 min.
7. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et séparez les deux lamelle comme décrit à l’étape 3.4, en vous assurant de garder une trace des visages actifs et de ne pas les toucher.
8. Rincer les deux faces actives avec du PBS en piper 25 ml de PBS sur la face active 2-4x. Ne séchez pas les lamaux de couverture, placez-les plutôt dans un rack en téflon et un bécher rempli de PBS immédiatement. Assurez-vous de garder une trace des faces de lamelle qui sont actives.
9. Utilisez immédiatement les échantillons préparés ou conservez-les à 4 °C jusqu’à trois jours sans perte importante d’intégrité.

6. Mesure de la propriété du matériau de microscopie à force atomique

1. Allumez les lasers AFM et ouvrez le logiciel AFM. Sélectionnez le mode de balayage approprié pour le test souhaité dans la boîte de dialogue d’ouverture. Toutes les fenêtres nécessaires doivent s’ouvrir par défaut; sinon consultez votre manuel d’utilisation afin d’ouvrir les fenêtres souhaitées.
2. Sélectionnez un porte-à-faux approprié à la mesure souhaitée et insérez-le dans le boîtier en porte-à-faux conformément aux directives du fabricant. Il existe un large éventail de conditions et de types d’expériences pour lesquels il existe une variété de cantilevers. L’expérimentateur doit rechercher des cantilevers en fonction de leurs besoins.
3. Insérez le boîtier en porte-à-faux dans la tête de l’AFM conformément aux directives du fabricant.
4. Si l’échantillon doit être utilisé dans des conditions humides, retirer l’échantillon de la zone tampon de stockage et passer à l’étape 6.7.
5. Si l’échantillon doit être utilisé dans des conditions ambiantes (sèches), retirez-le de sa zone tampon d’entreposage et rincez-le brièvement en plongeant dans un bécher d’eau ultrapure. Remarque: Cela laissera une fine couche d’hydratation sur l’échantillon qui peut induire une attraction capillaire avec des cantilevers ayant une faible constante de printemps.
6. Si l’échantillon doit être utilisé dans des conditions ambiantes (sèches), sécher doucement l’échantillon avec un flux d’azote.
7. Séchez doucement la face arrière de la lamelle de couverture avec un papier filtre sans poussière, en vous assurant de ne pas toucher la face active de l’échantillon.
8. Placez l’échantillon dans le porte-échantillon AFM approprié, puis placez-le sur l’étape AFM.
9. Si l’échantillon doit être étiqueté dans des conditions humides, pipeter une petite quantité de tampon sur le centre de l’échantillon (~ 10 μl).
10. Placez la tête de l’AFM sur l’échantillon.
11. Si l’échantillon est humide, assurez-vous que le porte-à-faux et la pointe de l’AFM pénètrent dans la couche superficielle et qu’il n’y a pas de bulles entre le porte-à-faux et le boîtier en porte-à-faux.
12. Aligner le laser AFM avec le porte-à-faux conformément aux recommandations du fabricant afin d’obtenir le signal optimal.
13. Mesurez la fréquence de résonance en porte-à-faux et définissez la fréquence de balayage en fonction du type d’expérience.
14. Abaissez la pointe AFM à la surface et optimisez les paramètres du signal.
15. Effectuez un scan AFM carré de 20 μm dans le mode de votre choix. Le mode tapotement (AC) a été utilisé pour générer des données représentatives. Identifiez les virus candidats par hauteur approximative, qui peut généralement être considérée comme des pointes pointues sur la surface du verre.
16. Sélectionnez un virus candidat et centrez la tête d’analyse au-dessus de celui-ci.
17. Effectuez un balayage carré de 250 nm (ou un balayage de super-résolution approprié) sur le virus sélectionné afin d’obtenir sa topologie et son orientation.
18. Sélectionnez un point sur le virus pour la mesure des propriétés du matériau(par exemple, le centre d’un virus sphérique pour une mesure du module de Young) et effectuez la mesure conformément aux instructions du fabricant.

7. Méthode d’imagerie à super-résolution

1. Ouvrez le logiciel d’imagerie à super-résolution et calibrez le logiciel conformément aux directives du fabricant.
2. Étalonner l’équipement d’imagerie à super-résolution conformément aux instructions du fabricant à l’aide de billes fluorescentes.
3. Assembler le tampon d’imagerie de l’échantillon à partir de stocks juste avant l’imagerie en combinant 50 μl de 1 M MEA et 100 μl de Gloxy 10x à 850 μl de tampon de stock. Conserver la mémoire tampon d’imagerie sur la glace pendant toute la durée de l’expérience.
4. Retirez une lamelle préparée avec échantillon de son tampon de stockage et rincez-la 5x en la trempant dans un bécher d’eau ultrapure.
5. Séchez la face de la lamelle non active à l’aide d’un papier filtre sans poussière. Assurez-vous de ne pas toucher le visage actif.
6. Insérez dans un porte-échantillon du système d’imagerie et ajoutez 250 μl de tampon d’imagerie au porte-échantillon. Il est raisonnable d’échanger le tampon d’imagerie sur l’échantillon toutes les 2 heures pour maintenir des résultats cohérents.
7. Couvrir le porte-échantillon avec du parafilm pour diminuer l’interaction atmosphérique avec l’environnement de la pièce.
8. Placez le porte-échantillon dans l’équipement d’imagerie pour l’imagerie.
9. Cherchez l’échantillon à mettre en évidence en utilisant les instructions du fabricant.
10. Imagez l’échantillon selon la technique de super-résolution utilisée. Assurez-vous d’ajuster les conditions d’imagerie pour optimiser le signal tout en diminuant les activations simultanées de fluorophores photo-commutables.
    
    REMARQUE IMPORTANTE : Les conditions d’imagerie dépendent de l’échantillon et varient en fonction des besoins expérimentaux. Une expérience typique utilisant Alexa 647 efficacement initialisée à son état sombre dans le tampon d’imagerie peut ensuite être photo-activée par l’application d’une lumière UV de 405 nm. Les images sont obtenues en excitant un sous-ensemble épars de molécules Alexa 647 dans un échantillon densément marqué et en localisant chaque fluorophore avec une précision limitée principalement par le nombre de photons collectés. Cette procédure est itérée à plusieurs reprises par le logiciel jusqu’à ce qu’un nombre souhaité de cycles d’acquisition se soient produits. L’expérimentateur doit avoir ce réglage en corrélation avec chaque fluorophore de l’échantillon ayant été photo-blanchi.
11. Une fois l’imagerie terminée, arrêtez l’équipement d’imagerie conformément aux instructions du fabricant. Le logiciel peut être laissé ouvert pour l’analyse des données.
12. L’analyse des données dépend fortement de l’expérience; cependant, dans tous les cas, identifier les virus par leur pleine largeur à la moitié maximale, ce qui est comparé aux dimensions connues du virus, en s’assurant de prendre en considération la taille supplémentaire des étiquettes fluorescentes.
13. Pour une meilleure visualisation, affichez les échantillons en utilisant l’option de rendu Isosurface ou l’option de rendu volumétrique, qui se trouvent généralement dans les logiciels d’imagerie à super résolution.

Results

Imagerie à virion unique à l’aide de l’AFM :

Le protocole de préparation des échantillons décrit ci-dessus a été utilisé pour ancrer des virions de type sauvage à la surface du verre. Les virions VSV sont en forme de balle de 180 nm de longueur et de 80 nm de diamètre. Comme il existe une variété de virions pour lesquels cette technique peut être appliquée, le concept est également démontré ici sur des perles biotinylées de 36 nm. Les expériences AFM qui en résultent sont illustrées à la figure 1. Il est important de noter que les virions vsv ont un module de Young inférieur (100 MPa) comparé aux virus non enveloppés (GPa). Les images particulières de VSV à virion unique ont été obtenues en mode tapotement dans des conditions ambiantes avec un porte-à-faux rigide. L’objectif a été de déformer le virus au point que la densité protéique supplémentaire dans le virus devienne visible sous forme de bosse dans l’image AFM. Cette méthode est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire dans la cavité virale¹⁹.

Imagerie à super résolution virion unique :

Les anticorps VSV-G marqués Alexa 647 ont été utilisés pour recouvrir l’enveloppe de virions VSV individuels pour des expériences de super-résolution utilisant la méthode 5A. Pour démontrer la densité d’attache et la faible liaison non spécifique, un grand balayage de l’échantillon est représenté à la figure 2A. La récupération de l’enveloppe virale sur un virion représentatif est représentée à la figure 2B (isosurface bleue).

Figure 1. Imagerie AFM des billes et du VSV sur la surface pegg fonctionnalisée. AFM scan de billes biotinylées de 36 nm(A, B)et d’un virion VSV(C)ancré à la surface avec un anticorps VSVG biotinylé. L’AFM a été effectué en mode de balayage de la topographie de l’air c.a. Le rayon de pointe est de <25 nm et les mesures ont été effectuées sous modulation de force et taraudage de la lumière. La pointe avait une constante de force de 3 N/m et une fréquence de résonance de 75 kHz avec une incertitude de 15 kHz. Alors que les perles ont conservé leur hauteur pendant le balayage de l’AFM, le virion VSV a un module de young significativement plus petit et est significativement déformé en hauteur. Dans cette image, le virion a été spécifiquement cérumisé avec un porte-à-faux rigide en mode tapotement qui a produit une petite convolution xy (utilisée pour déterminer la pointe vs l’extrémité émoussée du virus) et la différence de hauteur entre la pointe et l’extrémité émoussée du virus est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire à l’extrémité émoussée du virus^19.

Figure 2. Imagerie basée sur la fluorescence des virions VSV sur la surface fonctionnalisée PEGG. A)virions VSV recombinants immobilisés sur la surface PEGG à l’aide d’un anticorps anti VSVG biotinylé ionisé en fluorescence à champ large. B)Reconstruction par fluorescence haute résolution de l’enveloppe de VSV fixée à la surface pegg par un anticorps anti-VSVG biotinylé et décoré d’anticorps anti-VSVG marqués Alexa 647 (la méthode 5A a été utilisée pour créer ces images). La surface bleue est une projection isosurface 2D. À gauche montre un modèle du virus en forme de balle. 

Taille de la lamelle de couverture	fluide
40 mm	65 μl
35 mm	50 μl
30 mm	36 μl
25 mm	25 μl
20 mm	16 μl

Tableau 1. Aliquotes fluides selon la taille de la lamelle de couverture.

Discussion

L’imagerie à virion unique avec AFM et imagerie par fluorescence à haute résolution peut être utilisée comme méthodologie alternative à la tomographie CryoEM. Chacune de ces méthodologies a ses points forts spécifiques. Par exemple, l’AFM peut être effectuée sur des virions WT sans aucune exigence sur le marquage de l’échantillon ou des protéines virales internes. L’emplacement des structures virales est déconvolvé de leurs contributions aux propriétés élastiques du virion.

L’imagerie à super-résolution à virion unique en combinaison avec les approches génétiques inverses virales nouvellement développées devient une technique puissante pour localiser les protéines virales à faible nombre de copies²⁰. Les virus recombinants avec le remplacement de leurs protéines par des protéines fusionnées à des protéines fluorescentes peuvent être fabriqués et purifiés en utilisant ces approches génétiques inverses. Bien que l’imagerie à super-résolution ait une spécificité en partie due au marquage génétique, elle nécessite l’utilisation des virus mutants.

L’AFM et l’imagerie à super-résolution sont des méthodes complémentaires qui utilisent des préparations d’échantillons très similaires. Les méthodes décrites dans cet article, qui sont adoptées sous forme de tests d’imagerie à molécule unique antérieurs, permettent l’ancrage de virions uniques avec peu d’effets sur la topologie des virions.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lamelles en verre (fPALM)	Services de microscopie électronique	72225-01	Lamles de recouvrement de 25 mm
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotine (20 %)  ;	SuSoS-Stock		: 0,5 mg/ml dans la protéine de
biotine PBS NeutrAvidin	Invitrogen	A2666	Stock : 0,25 mg/ml dans PBS
Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)  ;	Invitrogen	A21245	1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10 % Glycol, pH 7,2 tampon
&alpha ;-VSV-G  ;	Invitrogen	ab34774	1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10 % Glycol, pH 7,2
tampon Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glucose oxydase type sept de Aspergillius  ;
Catalase	Sigma	C40-100mg	Catalase de foie bovin
MEA	Sigma	30070-10G	Cysteamine (MEA
Stock Buffer			50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10 % de glucose
NTE			10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM
EDTA Slide-A-Lyzer, mini unité de dialyse	Thermo Scientific		10 000 MW
Microscope Cover Glass : 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1