Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage

Résumé

Les déchets industriels peuvent être collectés et modifiés pour analyser la croissance microbienne. Les techniques d’extraction de la lignocellulose fournissent des composants permettant d’analyser la capacité spécifique de biodégradation. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse permet d’identifier les produits de fermentation des microorganismes cultivés sur les déchets de mise en pâte. Ces méthodes déterminent la capacité métabolique des micro-organismes à dégrader les déchets de fabrication de pâte.

Résumé

Le procédé kraft est appliqué aux copeaux de bois pour séparer la lignine des polysaccharides dans la lignocellulose pour la pâte à papier qui produira un papier de haute qualité. La liqueur noire est un déchet de mise en pâte généré par le procédé kraft qui présente un potentiel de bioconversion en aval. Cependant, la nature récalcitrante des ressources en lignocellulose, ses dérivés chimiques qui constituent la majorité du carbone organique disponible dans la liqueur noire et son pH de base présentent des défis pour la biodégradation microbienne de ces déchets. Les méthodes de collecte et de modification de la liqueur noire pour la croissance microbienne visent à utiliser ces déchets de pâte pour convertir la lignine, les acides organiques et les sous-produits de dégradation des polysaccharides en produits chimiques précieux. Les techniques d’extraction de lignocellulose présentées fournissent une méthode reproductible pour la préparation de substrats de croissance de lignocellulose afin de comprendre les capacités métaboliques des micro-organismes cultivés. L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse permet d’identifier et de quantifier les produits de fermentation résultant de la croissance de micro-organismes sur les déchets de mise en pâte. Lorsqu’elles sont utilisées ensemble, ces méthodes peuvent faciliter la détermination de l’activité métabolique des microorganismes ayant le potentiel de produire des produits de fermentation qui apporteraient une plus grande valeur au système de mise en pâte et réduiraient les déchets d’effluents, augmentant ainsi les bénéfices potentiels de l’usine de papier et offrant des utilisations supplémentaires pour la liqueur noire.

Introduction

La mise en pâte du bois est un processus chimiquement intensif qui a été optimisé au fil de nombreuses années pour créer un système avec un minimum de déchets. Cependant, certains extrants de ce processus pourraient être utilisés pour produire des produits de plus grande valeur. La liqueur noire en est un exemple. Il est généré à partir du procédé kraft, qui est la méthode de mise en pâte chimique dominante, représentant 85 % de la production mondiale de lignine¹. Le procédé kraft (figure 1) utilise la température (160-200 °C), la pression (120 psig) et les produits chimiques contenus dans la liqueur blanche (hydroxyde de sodium et sulfure de sodium) pour dissoudre la lignine des fibres de bois^2,3. La liqueur noire contient de la lignine, des acides organiques et des sous-produits de dégradation des polysaccharides⁴. Il est incinéré pour produire de la vapeur et récupérer des produits chimiques dans la chaudière de récupération qui fournit de l’énergie thermique pour les processus de fabrication du papier et de mise en pâte en aval. Le volume de liqueur noire généré par la mise en pâte peut dépasser la quantité que la chaudière de récupération peut traiter efficacement. L’élimination de la liqueur noire en tant qu’effluent affecte négativement la flore et la faune aquatiques et n’est donc pas une option. L’application d’organismes microbiens qui pourraient utiliser la liqueur noire pour la croissance serait bénéfique en termes d’augmentation de la récupération chimique et de production de produits à valeur ajoutée qui amélioreraient l’analyse globale du cycle de vie du système de mise en pâte. La conversion chimique et biologique des monomères dérivés de la lignine a permis de produire de la vanilline et de l’acide cinnamique utilisés comme édulcorants alimentaires et additifs parfumés, du phénol utilisé pour le plastique et les résines, et du cyclohexane, qui pourrait être utilisé comme carburant⁵.

Les travaux précédents sur la biodégradation de ces déchets de pâte se sont concentrés sur la dépolymérisation de la lignine. L’Institut international de la lignine (ILI) rapporte qu’entre 40 et 50 millions de tonnes de lignine sont produites chaque année (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Seulement 1,5 % de cette lignine est utilisée pour les processus industriels commerciaux⁶. La dépolymérisation de la lignine par les enzymes laccase et peroxydase produites par les champignons de la pourriture blanche des genres Phanerochaete et Trametes a été étudiée en longueur⁷. Il a également été démontré que les bactéries du sol connues pour dégrader les composés aromatiques tels que Nocardia et Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ et Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ sont capables de dégrader la lignine. La dégradation bactérienne des déchets de fabrication de pâte est prometteuse, car certaines bactéries peuvent prospérer dans les conditions salines et alcalines (pH 10-14) qui caractérisent les effluents des déchets de pâte¹¹. Bien que la lignine soit le principal composant de la liqueur noire, les micro-organismes peuvent également dégrader les autres composants qui composent la liqueur noire. Ces techniques n’identifient pas exclusivement les micro-organismes dégradant la lignine, mais servent à identifier les micro-organismes qui peuvent être appliqués directement sur la liqueur noire des déchets de pâte au lieu de ses constituants ultérieurs.

La liqueur noire a été collectée et modifiée pour la croissance microbienne par neutralisation et stérilisation par filtre. Les exigences en matière de croissance microbienne d’un isolat microbien environnemental ont été déterminées par des expériences de croissance minimale en milieu sur des composants lignocellulosiques produits par un nouveau protocole d’extraction de lignocellulose. Les milieux de croissance ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse (GC-MS) afin de déterminer les produits métaboliques de l’isolat microbien environnemental lorsqu’il est cultivé sur de la liqueur noire comme seule source de carbone. La combinaison de ces techniques fournit un outil d’évaluation pour déterminer la capacité métabolique d’un micro-organisme lorsqu’il est cultivé sur des déchets d’usines de pâtes et papiers tels que la liqueur noire. L’utilisation de ces techniques permet également de mieux comprendre la valeur de l’application de microorganismes spécifiques aux déchets des usines de pâtes et papiers pour la production de sous-produits.

Protocole

1. Collecte de la liqueur noire et préparation de la liqueur noire pour les cultures en croissance

1. Prélevez un échantillon de liqueur noire à partir de la vanne de sortie fixée au digesteur kraft dans une bouteille en verre stérile et laissez-le refroidir à température ambiante avant de procéder aux étapes suivantes.
   neutralisation
2. Ajouter 100 ml d’échantillon de liqueur noire dans un bécher de 500 ml équipé d’un agitateur.
3. Placez le bécher sur une plaque d’agitation et réglez la vitesse à moyenne.
4. Ajoutez lentement des gouttes d’acide phosphorique jusqu’à ce que la liqueur noire devienne visqueuse (viscosité similaire à celle du glycérol).
5. Aliquote toute la solution de liqueur noire en versant lentement dans des tubes coniques de 50 ml et en centrifugeant à 9 300 x g pendant 30 min.
6. Placez le surnageant dans le bécher et mesurez le pH à l’aide de rubans de test de pH. La pastille de lignine précipitée peut être jetée et traitée comme un déchet solide non dangereux.
7. Continuez à ajouter de l’acide phosphorique et centrifugez la solution jusqu’à ce que les bandelettes de pH indiquent un pH neutre du surnageant.
   stérilisation
8. Passez la solution à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toutes les bactéries contaminantes et placez la solution filtrée dans un récipient stérile pour le stockage. Conserver à température ambiante.

2. Extraction de lignocellulose

Séparation des glucides

1. Placez 5 g de panic raide, de pin ou de bermuda (broyé à 1 mm ou en particules moins) dans un erlenmeyer de 500 ml. Ajoutez ensuite 200 ml d’eau distillée ou désionisée, 7,5 g de NaClO₂, 2,5 ml d’acide acétique glacial et une barre d’agitation dans la fiole.
2. Placez le ballon dans un bain d’huile placé sur une plaque d’agitation à 80 °C pendant 1 h. Réglez la vitesse de la plaque d’agitation sur moyenne.
3. Ajouter 7,5 g supplémentaires de NaClO₂ et 2,5 ml d’acide acétique glacial dans la fiole. Continuer à remuer à 80 °C dans le bain d’huile pendant 30 min.
4. Répétez l’étape précédente 2 fois (Remarque : un total de 30 g de NaClO₂ et 10 ml d’acide acétique glacial sont ajoutés dans le ballon contenant la biomasse lignocellulosique). Refroidissez la solution à température ambiante.
5. Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner. Placez l’entonnoir sur une fiole latérale et fixez-le à un aspirateur.
6. Versez lentement la solution dans l’entonnoir.
7. Lavez la matière solide 3x avec 100 ml d’eau distillée ou déminéralisée. Jetez le filtrat après avoir lavé le matériau solide.
8. Réservez 1 g de matériau solide et placez-le sur une feuille propre de papier filtre.
9. Faites sécher cette matière solide pendant la nuit dans un four à 50 °C. Après avoir sorti l’échantillon du four, placez-le dans un flacon de stockage étiqueté « holocellulose ».
10. Ajouter le reste de la matière solide à 250 ml de NaOH à 10 % (v/v) dans un erlenmeyer de 500 ml. Boucher la fiole à l’aide d’un bouchon.
11. Placez la solution dans un incubateur à 70 °C pendant 1 heure en agitant à 250 tr/min.
12. Refroidir la solution pendant 30 min à température ambiante.
13. Retirez le matériau solide à l’aide de papier filtre et d’un entonnoir Büchner fixé à une fiole latérale.
14. Transférez le matériau solide sur une feuille de papier filtre propre dans un four à 50 °C et laissez-le sécher pendant la nuit.
15. Une fois que le résidu a séché, placez-le dans un flacon de stockage et étiquetez-le « cellulose ».
16. Transvaser le filtrat de l’étape 2.13 dans un erlenmeyer de 500 ml et ajouter 30 ml d’acide acétique et 250 ml d’alcool isopropylique. Boucher le ballon et placer la solution sur la paillasse pendant au moins 8 heures à température ambiante.
17. Transférez toute la solution dans des tubes coniques de 50 ml et centrifugez la solution à 9 300 x g pendant 30 min. Pipetez soigneusement la solution hors du tube conique et jetez-la.
18. Remettre la pastille en suspension dans 30 ml d’eau distillée ou désionisée par vortex.
19. Répétez les étapes 2.17-2.18 15 fois pour bien laver la pastille.
20. Retirez le surnageant et conservez la pastille pour la lyophilisation. Une fois lyophilisé, prélevez l’échantillon et placez-le dans un flacon étiqueté « hémicellulose ».
    Séparation de la lignine
    Protocole de séparation de la lignine basé sur Karaaslan et al. ¹²
21. Ajouter 5 g de panic raide, de pin ou de bermuda (broyé à une granulométrie de 1 mm ou moins) à 500 ml d’une solution de NaOH 0,25 M et d’éthanol à 30 %. Placez la suspension dans un incubateur à 75 °C en l’agitant à 250 tr/min pendant 2 heures.
22. Refroidissez la solution à température ambiante.
23. Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner sur une fiole de bras latéral. Fixez-le à un aspirateur et versez lentement la solution dans l’entonnoir.
24. Jetez le matériau solide.
25. Ajoutez une barre d’agitation dans la fiole contenant le filtrat et placez la fiole sur une plaque d’agitation réglée à vitesse moyenne. Ajouter goutte à goutte de l’acide chlorhydrique concentré à la solution jusqu’à l’obtention d’un pH de 2,0 (environ 20 ml).
26. Laissez la solution acidifiée reposer toute la nuit à température ambiante.
27. Centrifuger la solution à 9 300 x g pendant 30 min dans des tubes coniques. Pipetez soigneusement la solution hors du tube conique et jetez-la.
28. Remettre la pastille en suspension dans 30 ml d’eau distillée ou désionisée par vortex.
29. Répétez les étapes 2.27-2.28 15 fois pour bien laver le granulé.
30. Après la centrifugation, retirez le surnageant et conservez la pastille pour la lyophilisation. Une fois lyophilisé, placez l’échantillon dans un flacon étiqueté « lignine ».

3. Préparation des cultures de croissance microbienne

Plaques de gélose

1. Ajouter 0,2 % (p/v) de produits d’extraction de lignocellulose stériles dans un milieu minimal M9¹³ gélose avant de verser les plaques.
2. Plaques solidifiées striées avec environ 200 ul d’une culture bactérienne cultivée dans un milieu minimal M9 avec un diamètre extérieur d’environ 2,0.
3. Incuber les plaques à 37 °C et surveiller la croissance.
   Cultures liquides
4. Ajouter 50 ml de milieu stérile Luria-Bertani (LB)¹³ ou M9 minimal¹³ dans une fiole stérile de 125 ml. Ajouter de la liqueur noire à 10 % (v/v) ou 0,2 % (p/v) des produits d’extraction de lignocellulose.
5. Inoculer le milieu avec 0,1 % (v/v) d’une culture bactérienne à un diamètre extérieur d’environ 2,0.
6. Incuber les cultures à 37 °C en secouant à 200 tr/min.
7. Évaluer la croissance toutes les 6 heures pendant la période d’élevage en mesurant la densité optique (λ = 600 nm). Déposer une aliquote de 1 ml de la culture dans une cuvette. Déterminer la densité optique de la culture blanchie par rapport aux milieux non inoculés.
8. Transférez les bactéries dans un flacon de sérum anaérobie à mi-log.
   1. Pour préparer le flacon de sérum anaérobie : scellez le flacon de sérum avec un bouchon en caoutchouc butyle et un bouchon à sertir en aluminium dans des conditions aérobies et en autoclave. Ne modifiez pas l’espace libre à l’intérieur du flacon de sérum après la stérilisation.
   2. Transvaser à l’aide d’une seringue la totalité de la culture de 50 ml de la fiole de 125 ml dans le flacon de sérum stérile scellé.
   3. Incuber à 37 °C avec agitation à 200 tr/min.

4. Préparation des échantillons pour la GC-MS

Préparer les échantillons selon Raj, Reddy et Chandra¹⁴. Le témoin négatif utilisé pour la comparaison consiste en un milieu minimal M9 avec 10 % de liqueur noire et est également appelé échantillon non inoculé.

1. Centrifuger des cultures bactériennes non inoculées et inoculées (50 ml) à 9 300 x g pendant 30 min après 450 heures d’incubation.
2. Transvasez 10 ml de surnageant dans un tube à essai en verre. (Remarque : le plastique est incompatible avec les produits chimiques dans les étapes suivantes.)
3. Acidifiez le surnageant avec du HCl concentré à pH 1-2.
4. Ajouter 3 volumes d’acétate d’éthyle (30 ml), boucher le tube et mélanger en inversant 4-6x.
5. Placez une petite quantité de Na₂SO₄ anhydre (1-2 g) dans un tube à essai en verre propre.
6. Prélever soigneusement la couche organique (en haut) de la solution d’acétate d’éthyle par pipetage à l’aide d’une pipette Pasteur en verre jetable.
7. Placez la couche organique dans le tube à essai avec du Na₂SO₄ anhydre.
8. Déshydratez la couche organique sur le Na₂SO₄ anhydre en tapotant doucement le tube à essai pour mélanger. Ajouter graduellement de petites quantités de Na₂SO₄anhydre et mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gros grumeaux.
9. Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner au-dessus d’une fiole à bras latéral fixée à un aspirateur.
10. Versez la solution dans l’entonnoir. Jetez le matériau solide.
11. Transférez la solution dans une fiole d’évaporation et évaporez le filtrat à l’aide d’un évaporateur rotatif.
12. Placer 3 mg de résidus d’extraction d’acétate d’éthyle dans un flacon de chromatographie ambrée de 2 ml.
13. Dissoudre le résidu avec l’ajout de 100 μl de 1,4-dioxane et de 10 μl de pyridine.
14. Ajouter 50 μl de N,O-Bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec du triméthylcholorsilane 99:1 % (BSTFA). Placez ensuite dans un incubateur à 60 °C en agitant pendant 15 min.
15. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à utilisation.

5. GC-MS

Equiper le chromatographe en phase gazeuse (GC) interfacé avec un spectromètre de masse (MS) avec une colonne capillaire non polaire et de l’hélium comme gaz porteur avec un débit de 1 ml/min.

1. Une fois la température de l’étuve stabilisée à 50 °C, injecter 1 μl de l’échantillon dans un rapport de 1/50.
2. Maintenez la colonne à 50 °C pendant 5 min et augmentez à 280 °C à 5 °C/min. Maintenez la température finale de 280 °C pendant 20 min.
3. Maintenir la ligne de transfert entre le chromatographe en phase gazeuse et le spectromètre de masse à 300 °C.
4. Sélectionnez un délai de solvant de 15 min.
5. Enregistrer des spectres de masse par ionisation d’électrons compris entre 10 et 500 (m/z) à une énergie d’électron de 70 eV.
6. Dérivatiser et chromatographe standard comme ci-dessus. Identifiez les composés en comparant les temps de rétention des étalons achetés ou des données de la base de données spectrale de masse du National Institute of Standards and Technology (NIST).

Résultats

La collecte et la modification de la liqueur noire générée dans le processus de mise en pâte kraft (Figure 1) permettront d’utiliser ces déchets de mise en pâte pour déterminer la capacité de biodégradation d’un isolat bactérien unique ou d’une culture mixte. La figure 2 montre la croissance aérobie mesurée par la densité optique de l’isolat environnemental microbien cultivé dans des milieux LB seuls et des milieux LB complétés par de la liqueur noire neutralisée à 10 %. Ces résultats in...

Discussion

Ce protocole décrit une combinaison de techniques qui vise à identifier les micro-organismes qui peuvent dégrader les déchets de mise en pâte, les sources de carbone utilisées pendant la croissance sur les déchets de mise en pâte et les produits métaboliques microbiens produits lorsqu’ils sont cultivés sur des déchets de mise en pâte. Nous avons montré le succès de ce protocole avec l’isolat environnemental microbien : un anaérobie facultatif qui peut se développer avec 10 % de liqueur noire et utiliser les composants d’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,4-dioxane (certifié ACS)	Fisher	D111	Produit chimique inflammable et préoxydable
Liqueur noire	Département des biomatériaux forestiers de l’Université d’État de Caroline du Nord	/A	pH 12,72, 13,67 % de solides
Éthanol (qualité microbiologique)	Fisher	BP2818
Acétate d’éthyle (qualité réactif ACS)	EMD	EX0240-9	Inflammable
Acide acétique glacial (Certifié ACS)	EMD	AX0073	Corrosif
Guaiacol	Sigma Aldrich	PHR1136	Nocif par ingestion, corrosif
Colonne capillaire HP-5	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm de diamètre intérieur, 0,18 &mu ; m épaisseur
Acide chlorhydrique (certifié ACS)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide avec triméthylcholorsilane 99:1 % (BSTFA)	Fluka	15238	Inflammable, provoque des brûlures cutanées et des lésions oculaires avec
Na2SO4 (grade FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80 %)	Sigma Aldrich	244155	Inflammable, toxique   ;
NaOH (certifié ACS)	EMD	1.06498.1000
Rubans d’essai de pH alkacide	Fisher	A979
Acide phosphorique (certifié ACS)	Spectromètre de masse Fisher	A242
Polaris Q  ;	Thermo Electron Corporation
Pyridine (99 %)	Alfa Aesar	A12005	Inflammable, toxique au contact de la peau
Ferme de recherche sur le cerisier Switchgrass Goldsboro, NC	n/a	Récolté en août 2011
Thermo Finnigan Chromatographe en gaz de trace	Thermo Electron Corporation
Whatman no. 1 papier filtre	Whatman	1001-150