Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

Résumé

Le protocole décrit ici vise à expliquer et abréger les nombreux obstacles sur le chemin de la route complexe menant à nucléosides triphosphates modifiés. Par conséquent, ce protocole facilite à la fois la synthèse de ces éléments constitutifs activés et leur disponibilité pour les applications pratiques.

Résumé

La stratégie traditionnelle pour l'introduction de fonctionnalités chimiques est l'utilisation de la synthèse en phase solide par l'ajout de précurseurs des phosphoramidites modifiés de façon appropriée à la chaîne naissante. Cependant, les conditions utilisées lors de la synthèse et de la restriction de séquences assez courtes entravent l'application de cette méthodologie. D'autre part, des triphosphates de nucléosides modifiés sont activés blocs de construction qui ont été utilisées pour l'introduction douce de nombreux groupes fonctionnels dans des acides nucléiques, une stratégie qui ouvre la voie à l'utilisation d'acides nucléiques modifiés dans une palette large d'applications pratiques tels que l'étiquetage fonctionnel et génération de ribozymes et DNAzymes. L'une des principales difficultés réside dans la complexité de la méthode qui conduit à l'isolement et la caractérisation de ces analogues nucléosidiques.

Dans cet article, vidéo, nous présentons un protocole détaillé pour la synthèse des these analogues modifiés en utilisant des réactifs à base de phosphore-(III). En outre, la procédure pour leur caractérisation biochimique est divulguée, avec un accent particulier sur les réactions d'extension d'amorce et TdT polymérisation de résidus. Ce protocole détaillé sera utile pour l'artisanat de dNTP modifiés et leur utilisation ultérieure en biologie chimique.

Introduction

Triphosphates de nucléosides 5'-((d) PNT) représentent une classe de biomolécules vitaux qui sont impliqués dans d'innombrables processus et les fonctions allant d'être la monnaie universelle de l'énergie aux régulateurs du métabolisme cellulaire. En plus de leur rôle dans ces transformations biologiques fondamentaux, leurs homologues modifiés ont avancé comme une plate-forme souple et doux pour l'introduction de groupes fonctionnels dans des oligonucleotides, une méthodologie qui complète bien la synthèse en phase solide automatisée qui est habituellement appliqué ^1,2. En effet, à condition que les (d) PNT peuvent agir en tant qu....

Protocole

Une. Synthèse des nucléosides triphosphates modifiés

L'approche de synthèse choisie suit la procédure mise au point par Ludwig et Eckstein puisque cette méthode est généralement fiable et conduit à très peu de produits secondaires (figure 1A) ^39.

1. Coevaporate le nucléoside 3'-OAc convenablement protégé (typiquement 0,1 mmol) deux fois avec de la pyridine anhydre (2 ml), puis séché sous vide pendant une nuit. Dans le même temps, le pyrophosphate de tributylammonium sec (0,13 mmol) sous vide pendant une nuit.
2. Dissoudre le nucléoside dans un minimum de pyridine anhydre (0,2 ml) et ajout....

Résultats

Nucléosides triphosphates modifiés sont séduisantes cibles synthétiques, car ils permettent la mise en place facile d'un vaste éventail de groupes fonctionnels dans des acides nucléiques ^41. Cependant, l'isolement et la caractérisation de ces blocs de construction activés est souvent révélée être difficile. Par conséquent, les résultats présentés ici sont pensés pour offrir un coup de main pour suivre les différentes étapes dans les procédés de synthèse et biochimiques ci-dessus (figure 1B).

Discussion

L'inclusion des modifications dans les acides nucléiques de l'intérêt pour de nombreuses applications pratiques, y compris le développement de antisens et antigéniques des agents ^42,43, l'étiquetage et le marquage fonctionnelle d'oligonucléotides ^41, et dans les efforts visant à élargir l'alphabet génétique ^44-46. des altérations chimiques et les groupes fonctionnels sont généralement introduits dans des acides nucléiques par l'application de protocoles de synthès.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pyrophosphate de tributylammonium  ;	Sigma Aldrich	P8533	Solide hygroscopique, conserver sous Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  ;	Sigma Aldrich	324124	Sensible à l’humidité
Pyridine	Sigma Aldrich	82704	Sous tamis moléculaires
Dioxane	Sigma Aldrich	296309	Sous tamis moléculaires
Diméthylformamide (DMF)	Sigma Aldrich	40248	Sous tamis moléculaires
Acétonitrile  ;	Fisher Scientific		Qualité HPLC
Triéthylamine	Sigma Aldrich	90342
Tributylamine	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Eau déminéralisée		, autoclavée en présence de Diéthylpyrocarbonate (DEPC)
Diéthylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ ;-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natural dNTPs	Promega	U1420
Vent (exo-) ADN polymérase	NEB	M0257S
ADN polymérase I, grand fragment (Klenow)	NEB	MO210S
9° ; Nm ADN polymérase	NEB	MO260S
Terminal désoxynucléotidyl transférase (TdT)	Promega	M828A
Pwo ADN polymérase	Peqlab	01 01 5010
T4	PNK Thermo Scientific	EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40 %)	Serva	10679.01
Agarose	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
Urée	Apollo Scientific	BIU4110
Jupiter colonne RP-HPLC semi-préparative (5μ ; C18 300 Å ;)	Thermocycleur Phenomenex
Gene Q	Bioconcept	BYQ6042E
flacons PCR	Bioconcept	3220-00
Système HPLC	Amersham Pharmacia Biotech		Ä ; kta basic 10/100
Tous les oligonucléotides ont été achetés chez Microsynth et purifiés par PAGE
5' ;-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5' ;-GACATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5' ;-GAATTCGATATCAAG P2
Vous trouverez plus d’informations sur les procédures et l’équipement expérimentaux dans les articles suivants : Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 org. Biomol. Chem. 2013, DOI : 10.1039/C3OB40842F

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