Article de méthode

Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons

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DOI :

10.3791/51387

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23 avril 2014

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1Department of Biological Sciences, Murray State University

Dans cet article

Résumé

Complexes de protéines multi-composants jouent un rôle crucial lors de la fonction cellulaire et le développement. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler des complexes de protéines natives à partir d'embryons de Drosophila après réticulation in vivo suivie d'une purification des complexes réticulés pour analyse subséquente structure-fonction.

Résumé

De nombreux processus cellulaires sont contrôlées par des complexes protéiques unités multiples. Souvent, ces complexes forment transitoire et nécessitent environnement natif à assembler. Par conséquent, afin d'identifier ces complexes de protéines fonctionnelles, il est important de les stabiliser in vivo avant la lyse des cellules et la purification ultérieure. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler de grands complexes de protéines de bonne foi à partir d'embryons de Drosophila. Cette méthode est basée sur l'embryon perméabilisation et la stabilisation des complexes à l'intérieur des embryons par reticulation in vivo en utilisant une faible concentration en formaldéhyde, qui peut facilement traverser la membrane cellulaire. Par la suite, le complexe de protéine d'intérêt est immunopurifié suivie d'une purification sur gel et analysés par spectrométrie de masse. Nous illustrons cette méthode en utilisant la purification d'un complexe protéique Tudor, qui est essentielle pour le développement de la lignée germinale. Tudor est une grosse protéine, qui contient plusieurs domaines Tudor - petitmodules qui interagissent avec arginines méthylées ou des lysines des protéines cibles. Cette méthode peut être adaptée pour l'isolement des complexes de protéines natives provenant d'organismes différents et des tissus.

Introduction

Isolement des assemblages de protéines unités multiples et complexes d'ADN-ou d'ARN-protéine est effectuée pour identifier des complexes de protéines, des loci génomiques reconnu par des protéines de régulation se liant à l'ADN ou des cibles d'ARN des protéines de liaison d'ARN. Différents procédés permettent l'identification de l'ensemble du génome d'ADN des sites reconnus par des facteurs de transcription ou des protéines de la chromatine (ChIP-seq) 1 et les cibles d'ARN associés à une protéine de liaison à l'ARN donné (CLIP-seq) 2. Les bibliothèques d'ADNc de l'ARN dérivé ou de cibles d'ADN sont ensuite profondément séquences. Ces procédés utilisent des produits chimiques ou de réticulation pour stabiliser les complexes suivie par une immunoprécipitation (IP) avec un anticorps dirigé contre un composant protéique du complexe étudié induite par les UV.

Au cours du développement d'un organisme, de nombreux complexes protéiques forment de manière transitoire. Par conséquent, il est essentiel d'analyser la composition et le fonctionnement de ces complexes in vivo pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent developpement. Une telle analyse in vivo serait supérieure à l'approche in vitro car il est pratiquement impossible de reproduire les concentrations indigènes des éléments en interaction et de l'environnement biochimique cellulaire in vitro. Ici, nous démontrons une approche in vivo que nous utilisons avec succès pour isoler grands complexes de protéines à partir d'embryons de drosophile. Dans ce procédé, les complexes de protéines dans les embryons vivants sont réticulés avec une faible concentration en formaldéhyde et ensuite complexes de protéines d'intérêt sont isolés par IP avec un anticorps dirigé contre un composant connu des complexes, suivie d'une purification sur gel des complexes et de l'analyse par spectrométrie de masse à identifier les composants complexes inconnus. Etant donné que le formaldéhyde est capable de traverser la membrane cellulaire et a une gamme de réticulation de 02.03 à 02.07 Å 3, des complexes de protéines peuvent être réticulés in vivo et les composants complexes sont susceptibles d'être proches les unes des autres. Dans cet article, nousdécrire ce procédé en utilisant l'isolement de Tudor (TUD) complexe de protéines, par exemple. Tud est une protéine de la lignée germinale qui est essentiel pour le développement de la lignée germinale 4-7. Cette protéine contient 11 domaines TUD connus pour interagir avec les arginines ou lysines méthylées d'autres polypeptides 8-10.

Auparavant, nous avons généré une ligne drosophile transgénique qui exprime HA-étiqueté Tud fonctionnelle 5 et donc, un anticorps spécifique anti-HA est utilisé pour tirer vers le bas complexe Tud après réticulation.

En plus des réticulations protéine-protéine, le formaldéhyde peut générer des réticulations d'acide nucléique-protéine et est utilisé dans des expériences de ChIP-seq. En outre, chez la drosophile, in vivo de réticulation avec le formaldéhyde a permis l'identification d'une cible d'ARN de l'ARN Vasa protéine hélicase 11.

Bien que dans cet article, nous décrivons un procédé pour la reticulation in vivo et purification des complexes de protéines à partir d'embryons de Drosophila, ce procédé peut être adapté à d'autres organismes et les tissus.

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Protocole

1. Préparation grandes jus de pomme-agar plaques

  1. Pour faire 4 assiettes, ajouter 375 ml H 2 O, 11,25 g d'agar mouche et une barre d'agitation dans un ballon de 1000 ml. C'est Mix A. autoclave Mix A avec le couvercle du ballon sans serrer plafonné sur un cycle de 30 min-stérilisation pour les produits liquides.
  2. Ajouter 125 ml de jus de pomme, 12,5 g de sucre de table et d'un barreau à un bécher de 500 ml. Ce mélange est B. chaleur Mix B sur une plate-forme chauffée sous agitation et maintenir la température à environ 70 ° C jusqu'à ce que le passage à l'autoclave de mélange A est terminée.
  3. À la fin de Mix Un autoclave, transférer Mix B à A. Mélanger Gardez en remuant doucement le mélange combiné et le laisser refroidir pendant 15 minutes. Évitez de trop le refroidissement et la solidification de la gélose entraîné avant l'ajout d'agents de conservation.
  4. Faire 10% (poids / volume) méthyle solution 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol. Ceci agira comme un agent de conservation. Ajouter 3,75 ml de la solution dans le mélange jus-agar de pomme ci-dessus. Gardez en remuant pour another 5 min.
  5. Verser 125 mélange de jus de pomme-agar ml avec conservateur dans chaque 300 cm 2 en plastique ou une plaque de polystyrène. Laisser refroidir à température ambiante et se solidifier. Éviter la formation de bulles d'air tout en versant.
    Remarque: Les plaques jus-agar pomme sont prêts à utiliser immédiatement. Couvrir les plaques inutilisées avec enveloppements claires et stocker à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.

2. Drosophila collecte d'embryons et le traitement pré-réticulation

  1. Chargez une cage de population à environ 40.000 à 50.000 mouches partir desquels les embryons seront collectées.
  2. Faire deux plaques contenant chacune 125 ml de farine de maïs mélasse standard intermédiaire 12 et saupoudrer environ 4 g de levure de boulanger séchée sur chaque plaque. Placez ces plaques dans la cage de la population dans un incubateur à 25 ° pendant 48 heures pour engraisser les mouches.
  3. Chauffez 2 jus de pomme des plaques de gélose à 25 ° C. Saupoudrer environ 1 g de levure de boulanger séchée sur chaqueplaque. Placez les deux plaques dans la cage de la population de commencer à recueillir des embryons de 0-1 h âgé.
  4. Retirer les plaques à la fin de la collection de 1 hr. Remplacer avec 2 nouvelles plaques si un autre cycle de collecte est nécessaire.
  5. Ajouter suffisamment d'eau pour couvrir les plaques et remettre en suspension les embryons doucement avec un pinceau fin. Verser les embryons remises en suspension à travers un tamis à deux couches faites de treillis métallique inoxydable en acier.
    Remarque: La couche supérieure est faite de la taille des pores moyens (850 pm) maillage qui recueille une grande partie de mouches tout en laissant passer les embryons. La couche inférieure est faite de mailles fines (75 um) qui collecte des embryons tout en laissant passer la levure et de l'eau.
  6. Utilisez le pinceau fin pour transférer les embryons collectés dans un panier de collecte faite avec un tube de 50 ml et fine maille de nylon. Rincer les embryons brièvement à l'eau puis épongez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
  7. Plonger les embryons dans 50% de javel remuer doucement pendant 3 min. Rincer approfondiement avec de l'eau pour éliminer tout agent de blanchiment. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
  8. Plonger les embryons dechorionated dans de l'isopropanol sous agitation douce pendant 15 sec ou jusqu'à ce que la répartition des bouquets multi-embryon (cela ne devrait pas prendre plus de 30 secondes). Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
  9. Plonger les embryons dans l'heptane pendant 5 minutes tout en utilisant une pipette pour écouter heptane sur les embryons pour les garder remis en suspension. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
  10. Rincer les embryons avec des flux de saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS) contenant 0,1% de Triton X-100 (PBST) pendant 3 min.
  11. Démonter le panier de collecte et de transfert des embryons avec le maillage à un tube de 15 ml contenant 10 ml de PBST. Retourner doucement le tube pour laver les embryons de la maille.
  12. Retirez le filet du tube. Mettre le tube dans une position verticale et laisser les embryons se déposent au fond du tube par gravité.
    Remarque: Environ 100-300ul d'embryons est prévu pour une collection de 1 heure d'une cage.
  13. Retirez le PBST et continuer à effectuer la réticulation immédiatement.

3. In vivo réticulation des embryons collectés

  1. Préparer 0,2% de formaldehyde dans du PBST, immédiatement avant utilisation. Ajouter 10 ml de fixateur de formaldéhyde pour les embryons et incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 10 min. Jeter fixateur utilisé à la fin de la journée.
  2. Stopper la réaction de réticulation
    1. A la fin de la réticulation, que les embryons se déposent au fond du tube.
    2. Retirer la solution de formaldéhyde. Ajouter immédiatement 10 ml de 0,25 M de glycine dans du PBST pour arrêter la réaction de réticulation. Incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 5 min.
    3. Laissez les embryons se déposent au fond du tube. Retirer la solution de refroidissement. Laver les embryons avec 10 ml de PBST trois fois.
    4. Supprimer complètement le Psolution de lavage de BST à l'aide d'une pipette. embryons de conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.

4. Protéine préparation de l'échantillon et immunoprécipitation

  1. Homogénéiser 500 pi embryons réticulés en utilisant un homogénéisateur Dounce dans 2 ml de tampon de lyse (0,5 M d'urée, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, phénylméthanesulfonyle fluorure 2 mM [PMSF] et inhibiteur de la protéase cocktail dans PBS).
    Remarque: Effectuez cette et les étapes suivantes à la température ambiante, sauf indication contraire.
  2. Transférer le lysat tubes de 1,5 ml à centrifuger et secouez-la délicatement sur une plate-forme tournante pendant 15 min à assurer une lyse approfondie. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 5 minutes pour sédimenter les débris cellulaires. Enregistrez le surnageant dans un tube de 15 ml propre.
  3. Ajouter 40 ul de billes d'agarose anti-HA suspension pour le surnageant et laisser incuber sur une plateforme rotative pendant 2,5 heures.
  4. Sédimenter les billes par centrifugation à 2500 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant mais laisser approximately 250 pi dans le tube. Remettre en suspension les perles dans le surnageant restant et le transférer à une colonne de centrifugation de 1,5 ml avec un filtre à pores de 10 um.
  5. Centrifuger la colonne de centrifugation à 12 000 g pendant 10 sec et jetez l'écoulement à travers.
  6. Laver les billes en ajoutant 200 ul de tampon de lavage (0,1 M de glycine, NaCl 1 M, 1% d'IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20 dans du PBS). Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et jeter le lavage. Répétez le lavage deux fois de plus.
  7. Ajouter 40 ul de tampon d'élution (2 mg / ml HA-peptide dans du PBS) pour les billes et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes avec agitation douce toutes les 5 min. Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et recueillir l'éluat.
  8. Confirmer l'élution du complexe par analyse Western-blot en utilisant l'anticorps anti-HA 13.

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Résultats

L'efficacité de la réticulation et la purification réussie du complexe protéique réticulé TUD ont été analysés par SDS-PAGE sur un 3% - 7% de gel de l'étape (illustré sur la figure 1), suivie par transfert de Western (Figure 2).

Le but de l'utilisation de 3% - gel de l'étape 7% est basé sur la séparation effective du complexe protéique réticulé Tud de la protéine restante Tud non réticulé et la concentration du complexe. Sous nos vivo dan...

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Discussion

Le formaldehyde a été couramment utilisé comme réactif de réticulation pour identifier la protéine-protéine et des interactions protéine-acide nucléique. Sa bonne solubilité et la perméabilité membranaire de la cellule, ainsi que la compatibilité avec les procédés de spectrométrie de masse en aval, de faire un formaldéhyde agent candidat idéal pour les applications de reticulation intracellulaires 3,15-17. En particulier, il a été utilisé avec succès pour identifier les ARNm associés à Vasa, un ARN hélicase d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler et Jimiao Zheng pour leur aide technique à cette étude. Ce travail a été soutenu par la NSF Career Grant MCB-1054962 ALA

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Ne pas autoclaver le mélange d’eau et de gélose pendant une période prolongée car cela rendrait les plaques de jus de pomme fragiles
Methyl 4-hydroxybenzoateSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Autre nom : TEGOSEPT
Cage de populationFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
Maille fine en nylonFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Lors de la fabrication du panier de collecte, coupez la maille légèrement plus grande que l’ouverture du capuchon du tube de faucon pour assurer une étanchéité
Homogénéisateur de dénonçageSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETRéfrigérez l’homogénéisateur sur de la glace et prérincez-le avec un tampon de lyse à froid avant utilisation pour éviter la dégradation des protéines
.Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS pourrait être utilisé pour préparer une solution mère concentrée d’inhibiteur de protéase
Billes d’agarose anti-HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Le kit comprend également des colonnes de peptide HA et
de spin PeptideHA MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Préparer à 2 mg/ml avec PBS  ;
Colonne de centrifugationMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8colonnes de centrifugation sont incluses dans le kit
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)BP151-500
HeptaneFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Diluer de 10X à 1X avec de l’eau nanopure avant
utilisation FormaldéhydeFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)BP531-500
GlycineBioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)161-0724
FDSBioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)161-0301
UréeBioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)161-0730
Fluorure de phénylméthanesulfonyleSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GPréparer une solution mère de 200 mM dans de l’isopropanol puis diluer à une concentration de travail de 2 mM dans un tampon de lyse
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)BP337-100
Tubes de 15 mlUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
Eau de Javelde marqueDiluer avec un volume égal d’eau nanopure pour obtenir 50 % d’eau de Javel
Tubes de 50 mlBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Tamis de couche supérieureFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)04-884-1AK
Tamis de couche inférieureFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)Référence 04-884-1BA
Les BP26324 Clorox

Références

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