À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

Résumé

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

Résumé

En plus d'être un échafaudage physique pour maintenir la morphologie des tissus, la matrice extracellulaire (MEC) est activement impliqué dans la régulation de la fonction des cellules et des tissus au cours du développement et de l'homéostasie de l'orgue. Il le fait en agissant par l'intermédiaire de voies de signalisation biochimiques, biomécaniques et biophysiques, comme par la libération de fragments de protéines ECM bioactifs, réglage de la tension des tissus, et de fournir des voies de migration des cellules. La matrice extracellulaire du micro-environnement de la tumeur subit un remodelage important, caractérisé par la dégradation, le dépôt et l'organisation des protéines de la matrice fibrillaire et non fibrillaires. Stromale raidissement du micro-environnement de la tumeur peut favoriser la croissance des tumeurs et de l'invasion, et de provoquer le remodelage de vaisseaux sanguins et lymphatiques. Imagerie en temps réel des protéines de la matrice, cependant, à ce point est limitée aux collagènes fibrillaires qui peuvent être détectés par génération de seconde harmonique en utilisant la microscopie multi-photons, laissant la majorité des composants de la matrice largely invisible. Nous décrivons ici les procédures d'inoculation de la tumeur dans la peau fine de l'oreille dorsale, immunomarquage des protéines de la matrice extracellulaire et l'imagerie intravitale du tissu exposé dans des souris vivantes à l'aide épifluorescence et microscopie à deux photons. Notre procédé d'imagerie intravitale permet la détection directe de deux fibrillaire et des protéines de matrice non fibrillaires dans le contexte d'une tumeur cutanée de croissance. Nous montrons des exemples de remodelage vasculaire causée par la contraction de la matrice locale. Nous avons également constaté que la matrice fibrillaire de la tumeur détectée avec la génération de seconde harmonique est spatialement distincte de composants de la matrice nouvellement déposées telles que la ténascine C. Nous avons également montré à long terme (12 heures) l'imagerie de l'interaction des lymphocytes T avec des cellules tumorales et des cellules tumorales la migration le long du collagène IV de la membrane basale. Pris ensemble, cette méthode permet de façon unique pour la détection simultanée des cellules tumorales, leur micro-environnement physique et la réponse immunitaire du tissu endogène avec le temps, ce qui peut provide des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la progression tumorale et la réussite ou la résistance au traitement.

Introduction

Imagerie intravitale des processus de remodelage inflammatoire, métastatiques et de la matrice a été un domaine de recherche important et a motivé la création de nombreux modèles de souris rapporteurs transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ^1,2. En raison de hors-focus signaux fluorescents, qui réduisent la qualité de l'image et les limites s'allument pénétration à travers le tissu, l'imagerie des tissus épais est possible seulement avec confocale ou microscopie à balayage multi-photonique ^3. Utilisation rapide, microscopie à épifluorescence moins coûteux et complexe n'est possible qu'avec des tissus pratiquement à deux dimensions telles que la membrane chorio-allantoïde de poulet ou de l'oreille ⁴ derme de souris ^5. La plupart des systèmes d'imagerie de profiter des souris transgéniques exprimant différentes protéines fluorescentes d'une manière spécifique d'un type cellulaire. Même si ces protéines offrent faible phototoxicité, ils induisent la réponse immunitaire ^6. En outre, il est difficile de passer d'un sous-types spécifiques de cellules ou de marquer lebasale ir ou états activés en tant que tel changement nécessite la préparation d'un nouveau modèle génétique. De plus, comme l'expression de la protéine fluorescente est généralement limitée à un compartiment intracellulaire, il n'est généralement pas possible de l'image des structures extracellulaires comme les protéines de la membrane basale ou de dépôts de chimiokine de tissu ^7. Au lieu de cela, l'étiquetage indirecte avec des anticorps dirigés contre les antigènes extracellulaires offre une grande flexibilité pour pratiquement n'importe quel type de cellule ou de la matrice composant spécifique ^8,9. Cependant, l'inconvénient majeur de cette approche de marquage est associé à l'immunotoxicité médiée par des complexes immuns antigène-anticorps qui peuvent déclencher la toxicité cellulaire et la phagocytose des cellules et des structures extracellulaires ¹⁰ dépendant du système du complément.

La matrice extracellulaire du micro-environnement de la tumeur, mais également des tissus normaux au cours de l'inflammation ou de la cicatrisation des plaies, subit un remodelage important. Stromale raidissement du micro-environnement de la tumeur peut de promola croissance de la tumeur et te invasion en raison de mécanismes de signalisation induits par le stress et la cause remodelage de vaisseaux sanguins et lymphatiques ^11. Cependant, l'imagerie en temps réel des protéines de la matrice est limitée à des collagènes fibrillaires qui peuvent être détectés par génération de seconde harmonique en utilisant la microscopie multi-photons. Récemment, nous avons publié une méthode d'imagerie intravitale roman qui minimise le risque de photo-et immunitaire toxique dommages aux cellules de représentation et les structures tissulaires ^5. En comparaison avec les techniques d'imagerie établis où le seul tour de visualisation intravitale continu est dans une plage de 30 minutes à 2 heures ^12-17, notre immunofluorescence intravitale (SI) de technique a permis 12 heures (à long terme) ⁸ imagerie. Il est important de noter que le temps d'imagerie est limitée à 12 heures en raison de limites définies dans notre protocole des animaux, mais il n'y a pas de contre-indications techniques qu'il ne peut pas être prolongé si les paramètres critiques pour la santé de l'animal, comme la pression artérielle et le coeurtaux sont contrôlés ^8. En outre, en utilisant un stéréomicroscope à fluorescence automatisé, nous avons pu recueillir des images provenant de plusieurs champs au cours d'une seule expérience et observé rares processus immunologiques et de remodelage qui se sont produits dans le contexte physiologique de la peau soutenu par le sang et les vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Parce que la lentille a une stéréomicroscopique relativement grand, de 2 cm, la distance de travail et à la différence de deux photons optiques microscopiques ne nécessite pas de vaporisation immersion dans l'eau, de l'imagerie à long terme a été effectuée seulement dans la fluorescence stéréomicroscope. Intravitale SI a permis l'étiquetage immunitaire et la détection d'un composant de la matrice extracellulaire de la peau normale. La conception de cette technique est basée sur le concept innovant de l'immunomarquage à l'aide de cellules vivantes et des éléments de matrice de tissu sur le derme de souris exposées par voie chirurgicale sans causer d'effets nuisibles immunotoxiques ^5. La procédure chirurgicale elle-même est sans danger pour le dermesystème vasculaire car elle ne repose que sur la séparation de deux couches de peau dans l'oreille qui sont indépendamment innervé, alimenté de façon autonome par le sang et drainé par les circulations séparées lymphatiques. Notre dispositif expérimental permet l'imagerie d'une série d'événements physiopathologiques importantes sur au moins 12 heures, y compris le trafic des leucocytes entre vaisseaux sanguins et lymphatiques et les processus de cicatrisation des plaies. Dans la publication originale, nous avons comparé notre technique pour les normes sur l'état de l'art dans divers domaines de l'imagerie intravitale. Par conséquent, nous avons observé une extravasation du sang et des vaisseaux lymphatiques événements intravasation par différents types de leucocytes, y compris la visualisation unique de cellules immunitaires qui entrent dans la collecte prévu à la place de vaisseaux lymphatiques initiaux ^15. Aussi, en complément des observations faites par d'autres groupes ^9,18, nous avons constaté que dans CCL21 vivo est capable de former de solides, des dépôts discontinus sur la collecte mais seulement rarement sur ​​lymphatiques initiaux.

Nous décrivons ici un intravitale IF modifié technique qui peut être combinée avec la microscopie à deux photons à détecter le réseau de collagènes fibrillaires utilisant génération de seconde harmonique (SHG). Nous montrons que ce procédé peut également être utilisé pour l'invasion des cellules du cancer de formation d'image dans le cadre de la micro-environnement de la tumeur dynamique, qui comprend des molécules de la matrice telles que la ténascine C, qui sont largement inexploré par les techniques actuelles d'imagerie ^19. Nous avons constaté que la matrice fibrillaire de la tumeur, détectée avec la génération de second harmonique, occupe des emplacements différents de la micro-environnement de la tumeur de la matrice nouvellement déposée composé de ténascine C. En outre, nous décrivons des exemples de remodelage vasculaire causée par la contraction de la matrice locale, à long terme (12 heures) l'imagerie des interactions des cellules T avec des cellules tumorales et la migration des cellules tumorales ainsi que le collagène IV de la membrane basale. Ces événements peuvent être visualisés tout en enregistrant simultanément des paramètres physiologiques locales comme pe des vaisseaux sanguinsrmeability et le drainage lymphatique.

Protocole

Toutes les procédures effectuées sur les animaux étaient en stricte conformité avec la Loi sur la protection des animaux en Suisse, l'ordonnance sur la protection des animaux et de l'ordonnance sur l'expérimentation animale. Nous confirmons que notre soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC), nommée Commission de surveillance de l'Etat de Vaud (numéro de permis: 2687), spécifiquement approuvé cette étude.

1. Tumeur inoculation de l'oreille

1. Culture B16-F10-GFP cellules de mélanome dans une boîte de 10 cm de Petri en utilisant DMEM + 10% de FBS médias.
2. Lorsque les cellules sont 80-90% de confluence, les laver avec du PBS et les détacher par traitement à la trypsine. Isoler les cellules à 1500 g pendant 5 min à 4 ° C, remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution de Ringer et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Spin nouveau et retirer le surnageant à l'exception d'une mince couche de milieu qui reste juste au-dessus du culot. Remettre en suspension les cellules de se retrouver avec une suspension de cellules d'épaisseur.
3. Anesthésier les souris avec un mélange de ketamine / Dorbene [médétomidine] (75mg/kg-1mg/kg) et confirmer que l'animal est suffisamment anesthésié en effectuant un pincement de l'orteil doux. Augmenter la concentration d'isoflurane dans les étapes de 0,1% dans les mouvements de cas sont observés (par exemple le retrait de la patte). Gardez la souris sur une thermistance contrôlée coussin chauffant rectale (37 ° C) durant toute la procédure et de protéger ses yeux avec une pommade ophtalmique approprié.
4. Préparer une seringue Hamilton (33 aiguille G, 10 ml de volume de la seringue). Retirer le bouchon de pointe avec l'aiguille et charger 20 pi de suspension cellulaire sur le dessus de la chambre de pointe. Tirez sur le piston jusqu'à 5 ml suspension est chargé dans la seringue. Retirer l'excès de suspension de la chambre de pointe et fermer le bouchon de pointe.
5. Avec du ruban adhésif, fixer le bord proximal de l'oreille sur le bout de l'index. Dans un angle de 45 °, insérez-la délicatement l'aiguille de seringue Hamilton entre derme dorsal et le cartilage. Une fois à l'intérieur, pénétrer la partie proximale de l'oreille à distal pendant environ 2-3 mm.
   Remarque: La procédure de l'injection de cellules doit être effectué par un technicien qualifié et certifié. En outre, ce procédé doit être lente et effectuer dans l'ordre: d'abord l'aiguille doit être placée horizontalement sur la peau de l'oreille et lentement inséré dans le derme de l'oreille. Une fois que et seulement ensuite l'extrémité de l'aiguille est dans la peau, le plongeur doit être enfoncé. En appuyant sur le piston se lancer cellules inoculation dans la peau. Dans le cas peu probable de l'aiguille passer les deux couches du derme de l'oreille, la couche de cartilage et pénètre dans la peau de la personne qui effectue l'expérience, la douleur infligée au doigt de expérimentateur doit être considéré comme un signe alarmant et provoquer un retrait immédiat de l'aiguille de la peau de l'expérimentateur. Dans ce cas, le piston ne doit pas être pressé et de la peau doit être stérilisé avec de l'alcool. En variante, objet inanimé au lieu d'un doigt peut être utilisé pour stabiliser l'oreille.
6. Injecter 3 microlitres cellule suspension et se rétracter lentement l'aiguille de l'oreille.Laissez les cellules tumorales forment une tumeur solide pendant 7-9 jours et de suivre la croissance de la tumeur à l'aide d'un microscope stéréoscopique à fluorescence.
7. En variante, de suivre les étapes précoces de la tumeur interaction cellulaire avec la matrice de tissu, appliquer 50 ul de 100 000 cellules tumorales en suspension dans une solution de Ringer au niveau du derme et de l'oreille exposées colorées après l'étape (3.3).

2. Chirurgie des oreilles

1. Trois jours avant l'expérience, de se raser la tête de la souris, épiler les poils autour de la tête et l'oreille (10-15 sec) et rincer à l'eau.
2. Anesthésier la souris avec un mélange d'oxygène humidifié et isoflurane (3-4% induction, entretien de 1-2%) et de confirmer que l'animal est suffisamment anesthésié en effectuant un pincement de l'orteil doux. Augmenter la concentration d'isoflurane dans les étapes de 0,1% dans les mouvements de cas sont observés (par exemple le retrait de la patte). Gardez la souris sur une thermistance contrôlée coussin chauffant rectale (37 ° C) durant toute la procédure et de protéger ses yeux avec unpommade ophtalmique approprié.
3. Construire une plate-forme faite de 8 lames d'histologie de verre collées. Tourner la souris sur le dos et placez doucement l'oreille portant une tumeur sur l'empilement de lames de verre. Utiliser de petites bandes de ruban adhésif pour fixer les bords antérieur et postérieur de l'oreille de la pile.
4. Coupez la peau ventrale de l'oreille le long de l'anthélix du pavillon de la souris à l'aide d'un scalpel. A l'aide de pinces incurvées, retirez délicatement le derme ventral et le cartilage du derme dorsales où la tumeur a été inoculé. Retirez la peau ventrale et le cartilage avec des pinces courbes, exposant le derme dorsales. NOTE: Si les gros vaisseaux de l'oreille sont coupés ou la circulation du sang ne retourne pas à l'écoulement normal dans les 15 minutes, l'oreille ne peut pas être utilisé pour l'imagerie. Toujours garder la peau de l'oreille ouverte humide en utilisant le tampon de Ringer et protéger de l'humidité à l'aide d'une lamelle.
5. Dans le cas où il est navires forme de tumeur de saignements persistants, arrêter le saignement en ajoutant 100 ulthrombine (5 U / ml) dans du tampon de Ringer (NaCl 102 mM, KCl 5 mM, CaCl2 ₂ mM, lactate de sodium à 28 mM) sur le dessus de l'oreille pendant 5 min.
6. Laver l'oreille deux fois avec environ 5 ml de tampon de Ringer et enlever le liquide supplémentaire avec des lingettes stériles. Procéder immédiatement à l'étape suivante (ne laissez pas l'oreille ouverte à sec à tout moment!).

3. Immunofluorescence

L'utilisation du tampon de Ringer complété avec du sérum humain (01:10), anticorps polyclonal de souris de l'anticorps secondaire IgG humaine (01:50), et de 125 UI / ml (2,5 mg / ml aprotinine) (tampon de blocage) pour toutes les étapes de coloration. Aprotinine inhibe la plasmine favoriser la coagulation de limiter le saignement initial qui peut se produire après la chirurgie.

1. Pliez la partie de l'oreille avec le derme ouverts dans le cornet éminence et sécher le derme de l'oreille externe fermés avec des lingettes stériles. Immobiliser l'oreille sur la pile de lame de verre par l'application de 0,5 ul de la colle chirurgicale à la partie antérieure et postérieure dorsal bords. Ensuite, aplatir délicatement le derme de l'oreille dorsales sur le verre.
2. Appliquer des anticorps primaires des molécules de ciblage de la matrice extracellulaire, à une concentration de 10 pg / ml dans un volume total de 100 pl de tampon de blocage à l'oreille exposée. Couvrir l'oreille avec une lamelle couvre-objet afin d'empêcher la solution de coloration à sécher sur les bords de l'oreille. Incuber pendant 15 min. Laver l'oreille deux fois avec environ 5 ml de tampon de Ringer.
3. Appliquer des anticorps secondaires appropriés ou des conjugués de streptavidine (fluorophores avec une longueur d'onde d'excitation élevée telle que 594 nm ou 647 nm sont favorables pour l'imagerie intravitale) à une concentration de 10 ug / ml dans un volume total de 100 pl de tampon de blocage à l'oreille exposée. Couvrir l'oreille avec une lamelle et incuber pendant 15 min. Laver l'oreille deux fois avec environ 5 ml de tampon de Ringer.

4. Interaction des splénocytes activés par le sang avec des cellules tumorales in situ

1. 7 jours après inoculation de la GFP-B16-F10 mélanome sur la peau du dos de souris congéniques, euthanasier l'animal et de recueillir rates. Isoler splénocytes avec une rupture mécanique de la rate à travers un tamis cellulaire de 70 um.
2. splénocytes d'étiquetage pour les 8 min à 37 ° C avec Red CMTPX cytoplasme de la cellule tache (1 uM dans du PBS), laver 4 fois en 15 ml à 4 ° C et injecter immédiatement avec un milieu exempt de 200 sérum de pi dans la veine de la queue de la souris dont les oreilles étaient inoculés avec B16-F10-GFP sept jours plus tôt.

5. Imagerie intravitale l'aide d'un Stéréomicroscope

1. Pour l'imagerie à court terme (jusqu'à 2 heures), ajouter un tampon stérile fraîchement préparé de l'ascorbate-Ringer contenant ascorbate 140 mM de sodium, 10 mM d'HEPES, 4 mM KCl et _CaCl2 5 mM, à un pH de 7,5 (finale de tampon de l'ascorbate-Ringer osmolarité 320 mOsM) sur le dessus de l'oreille immobilisé. Couvrir l'oreille avec une lamelle et commencer imagerie en utilisant un stéréomicroscope à fluorescence avec un objectif 2X.
2. Pour l'imagerie à long terme(Plus de 2 heures), placer l'orifice de sortie d'une aiguille (relié à un réservoir contenant un tampon de Ringer-ascorbate), sous la lamelle couvre-objet, à une distance d'environ 0,5 cm de l'oreille. Utiliser une pompe péristaltique à une vitesse de 1 pl / min pour fournir en permanence la mémoire tampon de l'ascorbate-Ringer à la chambre sous la lamelle couvre-objet.
3. Changer la lentille 1X (distance de travail de 6 cm) à 2x (distance de travail de 2 cm). Ouvrez le logiciel d'acquisition et de configurer les paramètres du microscope stéréoscopique fluorescent. Dans paramètres de l'appareil choisir 12 bits comme la profondeur de couleur de l'image et ajuster le champ de la caméra de valeurs de gris de 0% (minimum) à 5,1% (maximum) et régler la correction de gamma à 2.
   1. Réglez le gain d'acquisition de 1 (minimum), l'intensité de fluorescence à 1000 (maximum), grossissement mis à 280X-320X et ajuster le temps d'exposition évite la sur-ou sous-exposition (temps d'exposition doit être inférieure à 1 sec). En fonction du nombre de champs d'imagerie (habituellement 10 à 20), l'intervalle de temps pour un cycle d'acquisition doit être réglée soitinterpoler 1 à 2 min. Réduire les temps peuvent causer la décoloration et la phototoxicité.
4. Choisir plusieurs champs qui contiennent des cellules tumorales ainsi que des protéines de la MEC colorées (par exemple, sur la figure 3). Utilisation de la platine motorisée, acquérir des images des canaux fluorescents appropriés (tels que la GFP et fluorophore 647 à la figure 3) dans le temps (par exemple toutes les 2 min).
5. Après l'expérience, euthanasier la souris selon les directives des animaux institutionnels. Dans ce cas, à la fin de l'expérience, les souris anesthésiée euthanasie par dislocation cervicale suivie par exsanguination (perfusion intracardiaque).

6. Imagerie intravitale l'aide d'un microscope multiphotonique

1. Utilisation de la graisse silicone, de construire une paroi circulaire d'environ 2 cm de diamètre et 2 à 3 mm de hauteur autour de l'oreille, à partir de la base de l'oreille. Assurez-vous qu'il n'y a pas de points de fuites. Remplissez le cercle avec le tampon de l'ascorbate-Ringer.
2. Placez la sourissur la scène et connecter le coussin chauffant (37 ° C).
3. Logiciel d'acquisition ouvert et configurer les paramètres du microscope multiphotonique.
4. Choisir un maximum de quatre domaines différents qui contiennent des cellules tumorales et des protéines de la MEC teinté (comme sur la figure 3). Dans cet exemple, accorder le laser Ti-saphir à 850 nm pour la GFP signaler un photon unique ultérieure 647 647 pour fluorophore coloration et de visualiser collagènes fibrillaires avec SHG. Acquérir des images des canaux fluorescents appropriés (tels que la GFP et fluorophore 647 à la figure 3) et génération de second harmonique dans le temps, par exemple toutes les 2 min, avec immersion dans l'eau HCX APO 20X avec 1,00 lentille NA et 2 mm de distance de travail.
5. Après l'expérience, euthanasier souris anesthésiée à la dislocation cervicale suivie par saignée (perfusion intracardiaque).

Résultats

À ce jour, immunologique dans les tissus vivants n'est généralement pas utilisée en raison de la formation de complexes immuns menant à une grande coloration fond et immunotoxicité ^20. Cela a été vaincu par pré-blocage des récepteurs Fcy sur les macrophages tissulaires, donc "aveuglant" ces cellules à la suite fort immunomarquage indirect. Comme le marquage était extracellulaire, la phototoxicité et fluorophore blanchiment peut être contrôlée par immersion du tissu dans antioxydant naturel tamponné, l'acide ascorbique iso-osmotique (Fig. 1A). Depuis notre première description de cette méthode ^5, nous avons amélioré notre technique anti-blanchiment et anti-phototoxique sorte que photoblanchiment peut désormais non seulement être inhibée mais complètement empêché (Fig. 1B). Ceci est fait par enrobage de l'oreille dans un grand volume d'anti-oxydant (100 ul) dans la chambre où l'oreille est immobilisé. Notez que 300 secondes d'imagerie constante correspond à 10 heures de l'imagerie lorsque les images sontrecueillies pour 500 ms toutes les minutes (les paramètres d'imagerie moyennes).

Figure 1. Photoblanchiment et de phototoxicité a été arrêté en remplaçant le chlorure de l'ascorbate dans le tampon de Ringer et l'incorporation de l'oreille exposée à un volume de 100 ul de cette solution. (A) Le tissu a été teint avec un premier anticorps biotinylé contre le collagène IV, le composant de la membrane basale. La coloration a été détectée plus tard avec de la streptavidine-647 (rouge), puis constamment imagée pendant 300 secondes dans les deux tampon de Ringer normale (en haut) ou de l'ascorbate-Ringer (panneau inférieur) de. Notez que 300 secondes de temps d'imagerie constante correspond à 10 heures de l'imagerie lorsque les images sont recueillies pour 500 ms toutes les minutes (les paramètres d'imagerie habituelles). La plus brillante de 25% de pivaleurs d'intensité de xel sont de couleur verte. (B) Quantification des immunofluorescence décroissance (50% dans le rapport de Ringer 0% en ascorbate-Ringer). Les valeurs ont été normalisées à la fluorescence initiale. Images recueillies par immunofluorescence stéréoscopique. La barre d'échelle en A, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Étude de l'interaction entre les cellules tumorales métastatiques et le stroma de la tumeur est essentiel pour comprendre le processus de migration de cellules de tumeur et de l'immunité tumorale. C'est parce que le stroma associé à une tumeur compose jusqu'à 90% de la masse tumorale et un contrôle actif de la croissance tumorale et la dissémination métastatique ^21. Cependant, une approche mécanistique de la façon dont la migration des cellules tumorales des disques de matrice soit vers lymphatique ou des vaisseaux sanguins est absente ^22. Ceci est partiellement dû au fait que im intravitalevieillissement des protéines de la matrice est limitée à la visualisation des fibres de collagènes fibrillaires affinés à l'aide de génération de second harmonique dans la microscopie à deux photons ^23. Par conséquent, nous avons adapté notre méthode pour la visualisation du microenvironnement de tissus, y compris vaisseaux sanguins et lymphatiques, péricytes, les nerfs, les muscles et les adipocytes pour inclure la visualisation directe des composants de la matrice extracellulaire. De nombreuses structures peuvent être distinguées sur la base de leur morphologie après immunomarquage pour sous-sol composants de la membrane telles que le collagène IV ou perlecan (Fig. 2A), toutefois, une coloration directe des marqueurs spécifiques de la surface cellulaire, par exemple, LYVE1 (Fig. 2B et C) et podoplanin (Fig. . 2C), permet en outre de distinguer initiales, lymphatiques capillaires (LYVE1 ⁺⁾ des collecteurs lymphatiques (LYVE1 ^-). Coloration pour CCL21 lié à la matrice de la peau a révélé des dépôts de cette chimiokine sur la membrane basale des collecteurs lymphatiques identified avec la coloration pour perlecan, le sulfate protéoglycanes héparane (Fig. 2D).

Figure 2. Exemples de coloration en direct dans une des oreilles de souris normales. (A) Coloration pour perlecan, un composant de la membrane basale, représente tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques, les nerfs, les fibres musculaires et les adipocytes. (B) LYVE1 coloration marque le premier réseau capillaire lymphatique. (C) Co-coloration pour LYVE1 et podoplanin, un marqueur pan-lymphatique, représente les réseaux de vaisseaux lymphatiques initiaux et collective. Le derme dorsale de l'oreille peuvent être imagées par microscopie à épifluorescence classique (sans sectionnement optique) comme le derme de l'oreille a un faible nombre d'adipocytes qui, autrement, couvrir le domaine de l'imagerie. (D) CCL21 stai Ning (vert) sur la membrane basale lymphatique teinté pour perlecan (rouge). Images recueillies par immunofluorescence stéréoscopique. Barres d'échelle en A et B, 1 mm; en C, 100 um et 50 um D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Plus important encore, les protéines de structure qui normalement ne peuvent pas être détectés par SHG, le procédé de détection de la matrice classique ^23, peuvent être visualisées. Par exemple, nous avons trouvé que la ténascine C (figure 3A), une protéine de matrice qui est exprimé au cours de la tumorigenèse, la cicatrisation et l'inflammation ¹⁹ est déposé dans des endroits différents de stroma de la tumeur que les collagènes fibrillaires (Fig. 3B). Cette matrice peut affecter la distribution hétérogénéité des cellules tumorales et des métastases (Fig. 3C).

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Figure 3. Le derme dorsale de l'oreille peuvent être visualisés en direct en utilisant la microscopie multi-photons. Un champ unique de la tumeur B16-F10. Stroma tumoral a été marqué avec un anticorps tenascin C et la coloration a été détectée avec un anticorps anti-chèvre-594 anticorps d'âne. Immunofluorescence de la ténascine C (rouge) réseau est représenté en A et collagènes fibrillaires détectée avec génération de seconde harmonique (SGH) dans B. Ces deux réseaux sont superposés avec des cellules tumorales (cyan) à C (fusionnés). Nouvelle matrice de tumeur marquée par la ténascine C n'est pas en chevauchement avec les collagènes fibrillaires détectés avec SHG (vert). L'image de 44, soit quatre fois la moyenne z-sections avec z-étape 1,0 um a été acquise en mode profondeur de couleur de 16 bits. Images recueillies avec deux photons microscope. La barre d'échelle, 100 um.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Suite à l'immuno-marquage des différents composants de la matrice de la tumeur (par exemple, la ténascine C et le collagène IV) de la matrice de la tumeur que nous pouvions identifier restreinte et événements soudains de tumeur directionnel remodelage matriciel (vidéo 1). Les forces qui se développent à l'intérieur de micro-environnement de la tumeur peut conduire à l'expansion ou la contraction de la matrice de la tumeur et en conséquence le remodelage et l'allongement de la vascularisation de la tumeur à un degré similaire, nous avons montré précédemment que dans le cas de la cicatrisation des plaies ^11,24.

Vidéo 1. Expansion de la matrice tumorale marquée avec le collagène IV (rouge) et la ténascine C (cyan) allongé vaisseaux sanguins (flèche) et passivement translocation trois cellules tumorales (en vert). Contraction localisée de teascin C-riche tumeur matrice transloquer vaisseau sanguin (rouge orienté horizontalement de structure) d'environ 100 um en 12 heures de l'imagerie. Images recueillies par immunofluorescence stéréoscopique. Cliquez ici pour voir la vidéo.

En utilisant la microscopie multi-photons avec un étiquetage fluorophore est problématique, car le flux de photons utilisée dans ces expériences va rapidement blanchir colorants fluorescents qui ne sont pas protégés de l'oxydation ^25. Ici, nous montrons que nous pouvons effectuer à deux photons time-lapse microscopie en imagerie simultanément immunomarquées matrice tenascin C avec un minimum de photoblanchiment des fluorophores même à haute densité de photons microscopie à deux photons (vidéo 2).

Cellules Vidéo 2. Faible niveau de photoblanchiment tenascin C immunofluorescence (rouge) au cours de la microscopie à deux photons. B16-F10-GFP tumorales (cyan) ont été imagées dans l'oreille dorsale ouvert 9 jours après inoculation. Le signal fluorescent a été protégé par l'application de l'ascorbate-Le tampon de Ringer sur le tissu imagé. Génération de seconde harmonique (vert) n'est pas chevauchement avec la nouvelle matrice représentée par C. image de profondeur de couleur de 16 bits ténascine avec 11, soit quatre fois la moyenne z-sections avec z-étape 1,9 um a été acquise pour 15 min. Les images ont été recueillies toutes les 1 minute 5 secondes en 6 z-avions recueillies. Cliquez ici pour voir la vidéo.

Nous avons également imagé interactions immunitaire des lymphocytes avec des cellules tumorales métastatiques. Splénocytes CMTPX marquées à partir d'une souris portant une tumeur extravasation des vaisseaux sanguins associés aux tumeurs 8 heures après transfusion intraveineuse, ont envahi la matrice de la tumeur et en interaction active avec des cellules tumorales en formant des contacts cellulaires de longue durée (Vidéo 2). Fluorophore-647-étiquetés structures collagène IV étaient résistants au photoblanchiment durant les 12 heures de l'imagerie.

Vidéo 3. Interaction des splénocytes CMTPX marqués de tumeur (B16-F10)-bformation de cornes de souris avec des cellules tumorales individuelles (GFP-B16-F10). splénocytes ont été transfusés iv après coloration des tissus pour le collagène IV. Collagène IV-vert (647), les splénocytes-rouge (CMTPX), B16-F10 cyan (GFP). Images recueillies par immunofluorescence stéréoscopique. Durée de la vidéo de 12 heures. Cliquez ici pour voir la vidéo.

Cellules tumorales fraîchement isolés ont été superposées sur le derme de l'oreille exposés pré-colorées pour le collagène IV. Nous n'avons observé que, après adhésion au tissu certains groupes de cellules ont commencé collective migration le long de la membrane basale des vaisseaux sanguins et des adipocytes.

Les cellules tumorales vidéo 4. Migrent le long des membranes basales. Peau de l'oreille normale coloré pour le collagène IV (647, rouge) a été recouvert avec des cellules B16-F10-GFP à des passages et fraîchement imagée pendant 5 heures. Certaines cellules tumorales qui ont adhéré au tissu commencé la migration collective longla membrane basale des vaisseaux sanguins et des adipocytes. Images recueillies par immunofluorescence stéréoscopique. Durée de la vidéo:. 5 heures Cliquez ici pour voir la vidéo.

Aussi, parce que le derme de l'oreille est pratiquement deux dimensions, nous pourrions facilement recueillons de grands volumes de données en utilisant la fluorescence rapide stéréomicroscopie, au lieu de confocal plus lent et plus coûteux ou microscopie multiphotonique. Cependant, il est également possible d'utiliser l'une des méthodes de microscopie à balayage mentionnés avec notre intravitale SI préparations (fig. 3, vidéo 1).

Discussion

Importance

Nous présentons ici une approche de microscopie intravitale roman qui permet une haute résolution et la visualisation dynamique des différentes composantes de micro-environnement tissulaire, y compris fibrillaire ainsi que des protéines de la matrice maille. Cette méthode a plusieurs avantages par rapport aux techniques actuelles d'imagerie intravitale: (i) l'imagerie de fluorescence intravitale a été utilisée dans les études de la microcirculation, par exemple, pour suivre la fuite de soluté à partir de sang ou dans les vaisseaux lymphatiques, mais n'a pas été associée à une immunocoloration. (Ii) L'utilisation de souris rapporteurs génétiquement modifiés permet de types cellulaires spécifiques à imagées, mais nécessite leur disponibilité (ou d'efforts considérables pour en créer de nouveaux) et limite le nombre d'interagir types de cellules qui peuvent être étudiés. (Iii) la matrice extracellulaire peut être imagée in vivo en utilisant génération de second harmonique, mais cette technique ne permet de détecter les collagènes fibreux, laissant un grand nombre de composants extracellulaires importantestels que les membranes basales, fibronectines, ténascines, facteurs de croissance, des chimiokines et de glycosaminoglycanes de tissus hors de portée pour la recherche actuelle. Notre méthode permet de surmonter ces limitations, et permet à des techniques d'imagerie standard pour être incorporés et en outre combinés avec des immunomarquages ​​pour d'autres types de cellules, les structures tissulaires, des dépôts de sulfate d'héparine facteurs de croissance (par exemple, le VEGF ²⁶⁾ et de chimiokines (CCL21 ^5,18 et Fig. 2D liaison ), ou des protéines de la matrice extracellulaire qui suivent simultanément tandis que le sang et / ou le flux lymphatique.

Limites

L'imagerie à épifluorescence de intravitale SI est limitée aux minces lambeaux de peau, privés de l'hypoderme épais (tissu adipeux). Nous avons constaté que le derme dorsale de l'oreille est optimale pour l'exposition chirurgicale relativement inoffensive de la peau de l'oreille, épifluorescence avec intravitale SI technique ne se limite pas à derme de l'oreille et pourraient être appliquées à par exemplela peau exposée des orteils ou la peau du dos de la souris nouveau-né. La coloration d'anticorps rapide (15 minutes) en immunofluorescence IF ne dépend pas de la diffusion passive mais nécessite le drainage lymphatique fonctionnel, et l'écoulement de fluide interstitiel, par conséquent, pas de coloration peut être observée si les vaisseaux lymphatiques sont occlus ^27. Conformément à cela, les vaisseaux lymphatiques se colorent plus fort alors fuite vasculaire sanguin (navires blessés, artérioles) ^5. La séparation de la partie dorsale et ventrale oreille lambeaux de peau est une procédure chirurgicale bénigne, mais elle cause un dommage à des capillaires et la mort des cellules à différentes cellules d'un tissu. Cela pourrait être un problème quand on a besoin pour enquêter tissu intact, par exemple en regardant l'effet doux de médicaments sur la survie de la cellule. En outre l'application d'anti-oxydant qui sert à protéger la peau contre la phototoxicité et photoblanchiment exclut l'utilisation de la technique d'immunofluorescence intravitale pour étudier par exemple le stress oxydatif des tissus ou de l'oxyde nitrique biology.

Enfin, l'aveuglement des macrophages résidents du tissu par des complexes immuns peut activer ces cellules et l'influence par exemple l'étude de la réponse immunitaire des tissus et l'activation des cellules dendritiques.

Modifications et dépannage

Afin d'étudier le stress oxydatif des tissus ou de la biologie de l'oxyde nitrique, l'ascorbate doit être remplacée par d'autres supports compatibles avec des tissus qui n'interfère pas avec la production expérimentale. De même, les bloquants des récepteurs Fc sur les cellules immunitaires cutanées devraient être évités si l'objectif de l'étude est la fonction et l'activation de la réponse immunitaire des tissus et l'activation de cellules dendritiques et de la migration. Cela peut être fait avec l'utilisation d'un anticorps secondaire avec le fragment Fc clivé (F (ab) 2 des fragments d'anticorps) ou l'utilisation d'anticorps biotinylé et de la streptavidine fluorescente en tant que réactifs de détection.

Les applications futures

Nous présentons une intra original et uniquevital SI technique à l'image des composants non fibrillaires de la matrice extracellulaire dans les tumeurs de la peau transplantables en combinaison avec fibrillaire SHG-détecté et collagènes mûri en utilisant la microscopie à deux photons. L'un des avantages de l'utilisation multi-photons (ou confocale) microscopie sur l'imagerie à épifluorescence est z-empilage possibilité et en conséquence l'espace de co-localisation d'événements se produisant à l'intérieur de la matrice extracellulaire, par exemple intravasation tumorale dans lymphatique ou un vaisseau sanguin, ce qui dans le cas d' microscopie à épifluorescence standard peut être que déduite de changements morphologiques de la cellule d'invasion. Cette technique a un potentiel beaucoup plus large. Par exemple, nous avons utilisé le intravitale SI pour étudier le mécanisme de l'occlusion lymphatique en particulier-lymphatique thérapie photodynamique ^27. D'autres applications possibles de ce procédé comprennent, mais ne sont pas limités à l'investigation de l'immunité de la peau au cours de l'inflammation, le mécanisme de rejet ou méthodes de transplantation de sang et de la lymphe systématique la croissance des vaisseaux pendant la tumorigenèse.

Étapes importantes de la procédure

L'étape la plus importante qui a des conséquences critiques pour le maintien d'un environnement tissulaire physiologique est une séparation chirurgicale de la peau ventrale et le cartilage de derme dorsales. Coupe ou d'occlusion de l'artère ou de la veine principale conduira à un saignement excessif et une hypoxie tissulaire locale, ce qui affectera la réponse cellulaire à des traitements et le mouvement des cellules ^8. Immobiliser l'oreille avec de la colle chirurgicale doit être fait avec soin comme répandre la colle sur le tissu exposer causera une blessure permanente au tissu par l'occlusion des vaisseaux sanguins. La température de la souris doit être contrôlée et maintenue à 37 ° C. En outre, l'oxygène humidifié doit être utilisée pour l'anesthésie à l'isoflurane, de sorte que les yeux et les poumons restent convenablement humidifié pendant l'expérience. En outre, l'ascorbate de sodium doit être préparée et son pH contrôlé avant utilisation.

ntent "> En résumé, ce immunofluorescence intravitale ponts en temps réel, des mesures locales de la fonction physiologique avec l'imagerie moléculaire des événements cellulaires complexes dans la peau de souris. Par ailleurs, cette méthode a un grand potentiel, car il peut être facilement appliquée à par exemple étude post-développement mécanismes de sang et de la lymphe de l'angiogenèse ou de visualiser les phases précoces de l'infection de la peau par divers agents pathogènes. Grâce à sa flexibilité et le potentiel à haut débit, cette technique intravitale peuvent contribuer de manière significative à de multiples domaines de la biologie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris souche
souris BALB/C souris (8-12 semaines )	Charles River		Orléans,France
C57/Bl6 souris (8-12 semaines)	Harlan		Carshalton UK
Cell Line  ;
B16 F10 Mélanome exprimant OVA-GFP  ;
Entretien de l’anesthésie  ;
Isofluorane  ;	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Système de distribution humidifié  ;	Rothhacher GmBH		Berne, Suisse  ;
Système de contrôle de la température CC  ;	FHC Inc		Bowdoin, MA
Stéréomicroscope  ;
Stéréomicroscope à fluorescence avec platine motorisée.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Allemagne
Objectif 1X (grossissement du système linéaire de 7,5X à 160X)	Objectif Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Allemagne
Objectif 2X (grossissement du système linéaire de 15,6X à 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Allemagne
Caméra DFC 350 FX contrôlée par le logiciel LAS AF  ;	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Allemagne
Microscopie multiphotonique
LEICA SP5, multiplicateur à deux photons, platine motorisée  ;	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Allemagne
HCX APO 20X/1.2 immersion dans l’huile
Chameleon Ultra Laser  ;
Tampon de Ringer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM de lactate de sodium)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Allemagne
Aprotinine  ;	Elastin	AP92	Owensville, MO
Thrombin  ;	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Allemagne  ;
Ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Allemagne  ;
Sérum de souris élevé contre les IgG humaines  ;	Abcam	ab34834	Cambridge, Royaume-Uni
Collagène IV  ;	Abcam	AB6581	Cambridge, Royaume-Uni
Perlacan  ;	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C  ;	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1  ;	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ; ttel, Allemagne
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidin Pacific Blue  ;	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647  ;	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488  ;	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Âne Anti Chèvre 594  ;	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Âne Anti Lapin 594  ;	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, Californie
Histocryl (colle chirurgicale)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Allemagne
Réactifs de culture cellulaire  ;
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Sérum fœtal bovin (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS  ;	Gibco Invitrogen		Grand Island, État de New York