Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Résumé

Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH cytoplasmique et organtelaire. Ici, nous décrivons en détail une méthodologie rapide et précise pour mesurer simultanément le pH cytoplasmique et vésiculaire par imagerie ratiométrique de cellules vivantes.

Résumé

Le pH intracellulaire est étroitement régulé et des différences de pH entre le cytoplasme et les organites ont été signalées¹. La régulation du pH cellulaire est cruciale pour le contrôle homéostatique des processus physiologiques qui comprennent : la synthèse des protéines, de l’ADN et de l’ARN, le trafic vésiculaire, la croissance cellulaire et la division cellulaire. Les altérations de l’homéostasie du pH cellulaire peuvent entraîner des changements fonctionnels préjudiciables et favoriser la progression de diverses maladies². Diverses méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH dans le cytoplasme et dans les organites. Ici, nous décrivons en détail une méthode rapide et précise pour la mesure simultanée du pH cytoplasmique et organellaire par microscopie confocale sur cellules vivantes³. Cet objectif est atteint grâce à l’utilisation de deux colorants ratiométriques sensibles au pH qui possèdent une partition sélective du compartiment cellulaire. Par exemple, SNARF-1 est compartimenté à l’intérieur du cytoplasme tandis que HPTS est compartimenté à l’intérieur des organites endosomaux/lysosomaux. Bien que le HPTS soit couramment utilisé comme indicateur de pH cytoplasmique, ce colorant peut marquer spécifiquement les vésicules le long de la voie endosomale-lysosomale après avoir été absorbées par la pinocytose^3,4. À l’aide de ces sondes de détection du pH, il est possible de mesurer simultanément le pH dans les compartiments endocytaires et cytoplasmiques. La longueur d’onde d’excitation optimale du HPTS varie en fonction du pH tandis que pour le SNARF-1, c’est la longueur d’onde d’émission optimale qui varie. Après le chargement avec SNARF-1 et HPTS, les cellules sont cultivées dans différentes solutions au pH calibré pour construire une courbe standard de pH pour chaque sonde. L’imagerie cellulaire par microscopie confocale permet d’éliminer les artefacts et le bruit de fond. En raison des propriétés spectrales de l’HPTS, cette sonde est mieux adaptée à la mesure du compartiment endosomal légèrement acide ou à la démonstration de l’alcalinisation des organites endosomaux/lysosomaux. Cette méthode simplifie l’analyse des données, améliore la précision des mesures de pH et peut être utilisée pour répondre à des questions fondamentales liées à la modulation du pH lors des réponses cellulaires à des défis externes.

Protocole

1. Préparation des solutions pour cellulaire pH Calibration

1. Ajouter les composés suivants à cinq tubes de 50 ml coniques distincts 5 pour préparer des solutions à utiliser pour l'étalonnage:
   • De NaCl (1 ml de NaCl 1 M) (1 M NaCl = 0,58 g dans 10 ml H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g dans 10 ml H ₂ 0)
   • Glucose (1 ml de 1 M de D-glucose) (1M D-Glucose = 1,80 g dans 10 ml H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml de 1 M de MgSO ₄₎ (1 M MgSO ₄ = 1,20 g dans 10 ml H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml d'HEPES 1M) (1 M HEPES = 2,38....

Résultats

Pour la mesure simultanée du pH intracellulaire dans les deux compartiments de la cellule et endosomal / lysosomal, les sondes fluorescentes pH détection ratiométrique SNARF-1 et HPTS ont été utilisés. SNARF-1 est limitée au compartiment cytosolique tandis HPTS permet la mesure ratiométrique de pH du compartiment endosomal / lysosomal. Cellule de chargement avec HPTS pour 16 heures permet sa localisation sélective dans les endosomes / lysosomes ^4. Un exemple typique de fluorescence enregistrée à partir de cel.......

Discussion

Mesure du pH quantitative en imagerie des cellules vivantes de différents compartiments cellulaires est nécessaire de mesurer avec précision les variations de pH dans les réponses cellulaires aux défis extérieurs. Cependant, l'un des principaux obstacles qui reste est de cibler facilement et précisément compartiments cellulaires. A cet égard, un certain nombre d'études ont mis en évidence l'utilisation de HPTS comme indicateur de pH intracellulaire introduit dans les cellules par électroporation ou micro-inj.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solutions pour l’étalonnage
Chlorure de sodium	Fischer	L-11621
Chlorure de potassium	Fischer	M-12445
D-Glucose (dextrose)	Fischer	D16-1
Sulfate de magnésium	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Chlorure de calcium dihydraté	Fischer	M-1612
Eau déminéralisée	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Toxique par inhalation ou par contact avec la peau
Tenir à l’abri de la lumière à 4 ° ; 35mm
	BD Biosciences	354456
sondes
8-Hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS)	Life technologies	H-348	Tenir à l’abri de la lumière à température ambiante
5-(et-6)-Carboxy SNARF® ;-1, Acetoxymethyl Ester, Acétate	Life technologies	C-1271	Tenir à l’abri de la lumière et de l’humidité à -20 ° ; C
Sufoxyde de diméthyle (DMSO)	Fischer	BP231-1  ;	nocif
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 100X
Chlorure de potassium	Fischer	M-12445	20 g
Phosphate de sodium monobasique	Fischer	S369-1	115 g
Phosphate de potassium monobasique	J.T Baker	3246-01	20 g
Eau déminéralisée	N/A	N/A Porter	à 1 L
l Autoclave et ajuster le pH à 7,4
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Chlorure de sodium	Fischer	L-11621	40,5 g
Eau déminéralisée	N/A	N/A	Porter à 5 L
les modulateurs
Bafilomycine A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-éthyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Chlorure d’ammonium	Fischer	A649-500

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