Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

14.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/51395

⸱

28 avril 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Biophotonics Core Facility, Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel

Dans cet article

Résumé

Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH cytoplasmique et organtelaire. Ici, nous décrivons en détail une méthodologie rapide et précise pour mesurer simultanément le pH cytoplasmique et vésiculaire par imagerie ratiométrique de cellules vivantes.

Résumé

Le pH intracellulaire est étroitement régulé et des différences de pH entre le cytoplasme et les organites ont été signalées1. La régulation du pH cellulaire est cruciale pour le contrôle homéostatique des processus physiologiques qui comprennent : la synthèse des protéines, de l’ADN et de l’ARN, le trafic vésiculaire, la croissance cellulaire et la division cellulaire. Les altérations de l’homéostasie du pH cellulaire peuvent entraîner des changements fonctionnels préjudiciables et favoriser la progression de diverses maladies2. Diverses méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH dans le cytoplasme et dans les organites. Ici, nous décrivons en détail une méthode rapide et précise pour la mesure simultanée du pH cytoplasmique et organellaire par microscopie confocale sur cellules vivantes3. Cet objectif est atteint grâce à l’utilisation de deux colorants ratiométriques sensibles au pH qui possèdent une partition sélective du compartiment cellulaire. Par exemple, SNARF-1 est compartimenté à l’intérieur du cytoplasme tandis que HPTS est compartimenté à l’intérieur des organites endosomaux/lysosomaux. Bien que le HPTS soit couramment utilisé comme indicateur de pH cytoplasmique, ce colorant peut marquer spécifiquement les vésicules le long de la voie endosomale-lysosomale après avoir été absorbées par la pinocytose3,4. À l’aide de ces sondes de détection du pH, il est possible de mesurer simultanément le pH dans les compartiments endocytaires et cytoplasmiques. La longueur d’onde d’excitation optimale du HPTS varie en fonction du pH tandis que pour le SNARF-1, c’est la longueur d’onde d’émission optimale qui varie. Après le chargement avec SNARF-1 et HPTS, les cellules sont cultivées dans différentes solutions au pH calibré pour construire une courbe standard de pH pour chaque sonde. L’imagerie cellulaire par microscopie confocale permet d’éliminer les artefacts et le bruit de fond. En raison des propriétés spectrales de l’HPTS, cette sonde est mieux adaptée à la mesure du compartiment endosomal légèrement acide ou à la démonstration de l’alcalinisation des organites endosomaux/lysosomaux. Cette méthode simplifie l’analyse des données, améliore la précision des mesures de pH et peut être utilisée pour répondre à des questions fondamentales liées à la modulation du pH lors des réponses cellulaires à des défis externes.

Protocole

1. Préparation des solutions pour cellulaire pH Calibration

  1. Ajouter les composés suivants à cinq tubes de 50 ml coniques distincts 5 pour préparer des solutions à utiliser pour l'étalonnage:
    • De NaCl (1 ml de NaCl 1 M) (1 M NaCl = 0,58 g dans 10 ml H 2 0)
    • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g dans 10 ml H 2 0)
    • Glucose (1 ml de 1 M de D-glucose) (1M D-Glucose = 1,80 g dans 10 ml H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g dans 10 ml H 2 0)
    • HEPES 20 mM (1 ml d'HEPES 1M) (1 M HEPES = 2,38 g dans 10 ml H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 ml de CaCl2 1 M) (1 M CaCl2 = 1,47 g dans 10 ml H 2 0)
      Préparer toutes les solutions double distillée H 2 O (le trou DDH 2 O).
  2. Remplissez chaque solution avec 35 ml de ddH 2 O et mélanger avec un agitateur magnétique jusqu'à sortelution est atteint.
  3. Ajuster le pH de chaque solution de KOH 1 N ou HCl 1 N pour obtenir des valeurs de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 et 7,5. Ensuite, régler le volume avec de l'eau déminéralisée à un volume final de 50 ml.
  4. Mesure 5 mg de nigéricine et l'ajouter à 670 pi d'EtOH absolu pour préparer un 10 mM nigéricine solution stock.
    Attention: nigéricine est très toxique et doit être manipulé avec grand soin (gants, lunettes de protection et masque). Mélanger la solution par inversion jusqu'à la nigéricine est complètement dissous.
  5. Ajouter 0,05 ml de 10 mM de nigéricine (concentration finale de 10 pM) à chaque solution d'étalonnage. Nigéricine est un ionophore qui augmente la perméabilité de la membrane cellulaire et provoque l'équilibration du pH intracellulaire et extracellulaire en présence d'une concentration de dépolarisation de K + extracellulaire.
  6. Les solutions d'étalonnage peuvent être stockés jusqu'à 1 mois à 4 ° C

2. Préparation des cellules

  1. En vertu d'un Safet biologiquey capot, des cellules de semences en 35 mm x boîtes de culture de 10 mm dans 2 ml de milieu de croissance supplémenté par 10% de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal. Utiliser la quantité de cellules nécessaire pour assurer environ 50% de confluence après 24 h.
    NOTE: Dans nos expériences, nous utilisons la lignée cellulaire HT-1080 et la plaque 1 x 10 5 cellules par boîte de culture.
  2. Déterminer le nombre de boîtes de culture nécessaires pour l'expérience et la plaque 5 boîtes de culture supplémentaires qui seront utilisés pour l'étalonnage.
  3. Plats place de la culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 24 heures.

3. Préparation des sondes de détection de pH

  1. Préparer une solution stock de 1M de la sonde de pH fluorescent 8 hydroxypyrène-1, 3,6 trisulfonique, sel trisodique (HHP / pyranine) dans le trou DDH 2 0. Cette solution doit être conservé à température ambiante et protégé de la lumière.
  2. Préparer une solution stock de 1 mM 5 - (et 6)-carboxy seminaphthorhodafluor acétoxyméthylique ester acétate (C-SNARF-une heures; appelé Thereafter SNARF-1) en dissolvant 1 mg de SNARF-1 dans 1,76 ml de DMSO. Bien mélanger par pipetage répété. SNARF-1 solution doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière.

4. Portable étiquetage

  1. Seize heures avant imagerie des cellules vivantes, ajouter 2 pi de 1M HPTS solution stock (concentration finale 1 mM) à chaque boîte de culture contenant 2 ml de milieu complet.
  2. Retour des boîtes de culture à l'incubateur. La sonde est HPTS cellulaire imperméant, donc étiquette organites la sonde doit être prise par pinocytose. Cette condition exige que les incubations de cellules avec HPTS sont effectuées dans un milieu de culture additionné de sérum.
  3. Après incubation avec HPTS, laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu exempt de sérum pendant au moins 2 heures. L'incubation avec SNARF-1 doit être effectuée dans un milieu sans sérum, car le sérum peut empêcher l'absorption de la sonde.
  4. Ajouter 10 ul d'une SNARF-1 solution 1 mM pour obtenir afconcentration inal de 5 uM et permettent aux cellules incuber pendant 20 min à 37 ° C, sous une lumière faible. C-SNARF-1 et de concentration temps d'incubation peuvent varier en fonction du type de cellule.
  5. A la fin de l'incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu sans sérum.

5. Ajout de pH modulateurs

  1. Pour évaluer si la méthode peut détecter des changements de pH dans les cellules, les différents réactifs qui modulent le pH intracellulaire peuvent être utilisés:
    • Bafilomycine A1, un inhibiteur spécifique de la V-ATPase 5
    • Na + / H + échangeur isoforme 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, une base faible qui augmente le pH intracellulaire 7
    1. Préparer des solutions de des réactifs mentionnés ci-dessus:
      • Bafilomycine A1: ajouter 10 pg de bafilomycine A1 160 ul de DMSO pour obtenir une solution stock de 100 um
      • IEAP: ajouter 25 mg de l'IEAP à 1,67 ml de méthanol à obtena concentration finale de 50 mM
      • NH 4 Cl: dissoudre 0,53 g de chlorure d'ammonium dans 10 ml de trou DDH 2 O pour obtenir une concentration finale de 1 mM.

      Remarque: Toutes les solutions mères doivent être conservés à 4 ° C sauf pour bafilomycine A1 qui doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière.
    2. Dans des cultures distinctes, ajouter l'un des réactifs tels que décrits ci-dessous:
      • 2 pl de 100 uM bafilomycine A1 (concentration finale de 100 nM)
      • 1 pl de l'IEAP 50 mM (concentration finale de 25 uM)
      • 40 pl de 1 M de NH 4 Cl (concentration finale 20 mM)
    3. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
  2. Procéder à l'acquisition de l'image.

6. Spécifications du microscope d'imagerie des cellules vivantes et des paramètres d'acquisition

  1. Effectuer imagerie des cellules vivantes en utilisant un objectif 40x monté sur un balayage inversé microsco confocale spectralepe équipé d'une platine XY motorisée, une chambre pouvant accueillir des plats de verre de la culture de fond dans un (température, humidité, CO 2) incubateur à environnement contrôlé de phase.
  2. L'instrument confocal (Olympus FV1000) utilisé ici est équipé de:
    • Un laser à diode de 405 nm
    • A 40 mW laser argon (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Un laser hélium néon (543 nm)
    • Objectif fluorite 10X, NA0.4
    • Un objectif LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • Un objectif de l'huile PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4
    • Un miroir dichroïque DM 405/458/488/543
    • Un SDM 560 et un SDM 640 filtres dichroïques
    • Un filtre de barrière BA655-755
    • Un BS20/80 de diviseur de faisceau
    • logiciel d'analyse de données pour l'acquisition et l'analyse d'images,
  3. Une fois l'incubateur d'étape a réchauffé à 37 ° C et le microscope est mis en place, placer une boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1 dans la chambre d'imagerie confocale stade.
  4. Après avoir localiser une zone d'intérêt, régler les paramètres d'acquisition de logiciels Figure 1.
    • Mettre en place deux ensembles de canaux virtuels.
    • Initier la première phase qui correspond à HPTS excitation à 405 nm et la collecte d'émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d'émission à 570-600 nm.
    • Lancer la deuxième phase qui correspond à HPTS excitation à 458 nm et la collecte d'émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d'émission à 640-650 nm.
    • L'ouverture confocale est fixé à 175 um par défaut et l'ouverture optimale doit être réglé manuellement à 300 um.
    • Prenez l'image par l'empilement des sections optiques horizontales série (800 x 800 pixels) de 0,4 um d'épaisseur.

NOTE: Un objectif 40X est utile d'observer plusieurs cellules simultanément et fonctionne bien pour organite visualisation. Cependant, la résolution spatiale et de l'intensité du signal sont better obtenue en utilisant un objectif 60x huile. En outre, il n'y a pas d'excitation ou d'émission de la diaphonie entre les deux colorants.

7. Étalonnage de sondes pH-détection

  1. Avant l'étalonnage, éliminer le milieu de la boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1, laver deux fois avec du PBS stérile, puis ajouter 2 ml d'une des solutions d'étalonnage cinq.
  2. Placez la boîte de culture dans la chambre de stade confocale.
  3. Procéder à une acquisition d'image temps-lapse selon les paramètres suivants:
    1. Définissez le nombre d'images et de durées d'intervalle pour l'expérience.
      NOTE: Nous utilisons généralement un intervalle de 1 min entre les images pour un maximum de 30 minutes.
    2. Programmer le déclencheur pour fermer entre l'acquisition de chaque image.
  4. Enregistrer l'intensité de fluorescence par minute dans un logiciel de feuille de calcul et de déterminer le moment où l'intensité de fluorescence est stable. PH intracellulaire est généralement stable après le 15 - 20 min.
  5. REPEAT les étapes 7.1 à 7.4 en utilisant une nouvelle boîte de culture pour chaque solution d'étalonnage restant.

8. D'acquisition de données

  1. Une fois le calibrage a été fait, l'acquisition de données de l'échantillon 4-5 champs choisis au hasard contenant 15-20 cellules par champ. Deux images sont obtenues pour chaque domaine: l'un pour l'étiquetage HPTS (vésicules) et le second pour SNARF-1 étiquetage (cytosol).
  2. Fluorescence de fond (zone extracellulaire) est numériquement soustrait des images fluorescentes de deux sondes. Vésicules marquées et cytosol de leurs images stockées respectives sont sélectionnés à l'aide d'un masque binaire. Pour chaque sonde pH-détection, les intensités de fluorescence sont mesurées sur une échelle numérique (0-4,095 échelle de niveaux de gris). Une intensité moyenne de tous les pixels dans le cytoplasme ou organelle est calculée et les valeurs sont utilisées pour calculer les rapports de fluorescence.

9. Analyse des données

  1. Divers logiciels sont disponibles dans le commerce pour l'analyse des données. DireFluoview logiciel.
  2. Dans une feuille de calcul, valeurs de l'enregistrement et le calcul des ratios de fluorescence comme suit: Dans le cas de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) et, dans le cas de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Tracer les données en utilisant un logiciel graphique scientifique comme GraphPad Prism. La parcelle doit présenter des ratios de fluorescence (axe Y) en fonction du pH (axe X). d'ajustement de courbe est réalisé en utilisant une régression non linéaire.
  4. Recueillir les intensités de fluorescence des échantillons de la manière décrite dans l'étape 8.2 et de calculer les rapports de fluorescence. Utilisation des courbes d'étalonnage pour transformer en ratios des valeurs de pH.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Pour la mesure simultanée du pH intracellulaire dans les deux compartiments de la cellule et endosomal / lysosomal, les sondes fluorescentes pH détection ratiométrique SNARF-1 et HPTS ont été utilisés. SNARF-1 est limitée au compartiment cytosolique tandis HPTS permet la mesure ratiométrique de pH du compartiment endosomal / lysosomal. Cellule de chargement avec HPTS pour 16 heures permet sa localisation sélective dans les endosomes / lysosomes 4. Un exemple typique de fluorescence enregistrée à partir de cel...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Mesure du pH quantitative en imagerie des cellules vivantes de différents compartiments cellulaires est nécessaire de mesurer avec précision les variations de pH dans les réponses cellulaires aux défis extérieurs. Cependant, l'un des principaux obstacles qui reste est de cibler facilement et précisément compartiments cellulaires. A cet égard, un certain nombre d'études ont mis en évidence l'utilisation de HPTS comme indicateur de pH intracellulaire introduit dans les cellules par électroporation ou micro-inj...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Nous remercions le Dr Gilles Dupuis pour la lecture critique du manuscrit.

Financement

Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada, subvention # MOP-126173. C.M.D est membre du Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel, financé par le Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solutions pour l’étalonnage
Chlorure de sodiumFischerL-11621
Chlorure de potassiumFischerM-12445
D-Glucose (dextrose)FischerD16-1
Sulfate de magnésiumFischerM65-500
HEPESSigma-AldrichH3375
Chlorure de calcium dihydratéFischerM-1612
Eau déminéraliséeN/AN/A
NigericinCalbiochem481990Toxique par inhalation ou par contact avec la peau
Tenir à l’abri de la lumière à 4 ° ; 35mm
BD Biosciences354456
sondes
8-Hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS)Life technologiesH-348Tenir à l’abri de la lumière à température ambiante
5-(et-6)-Carboxy SNARF® ;-1, Acetoxymethyl Ester, AcétateLife technologiesC-1271Tenir à l’abri de la lumière et de l’humidité à -20 ° ; C
Sufoxyde de diméthyle (DMSO)FischerBP231-1  ;nocif
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 100X
Chlorure de potassiumFischerM-1244520 g
Phosphate de sodium monobasiqueFischerS369-1115 g
Phosphate de potassium monobasiqueJ.T Baker3246-0120 g
Eau déminéraliséeN/AN/A Porterà 1 L
l Autoclave et ajuster le pH à 7,4
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X
PBS 100XN/AN/A50 ml
Chlorure de sodiumFischerL-1162140,5 g
Eau déminéraliséeN/AN/APorter à 5 L
les modulateurs
Bafilomycine A1Sigma-AldrichB-1793
5-(N-éthyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)Sigma-AldrichA3085
Chlorure d’ammoniumFischerA649-500
de détection du pHdu pH

Références

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Compartiments endocytairespH cytosoliquecolorant HPTSsonde SNARF 1ratio de fluorescencecourbe talon du pHtrafic v siculaire
Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.