Article de méthode

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

DOI :

10.3791/51408

⸱

29 mai 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Résumé

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L'hétérogénéité de la population des cellules souches entrave compréhension détaillée de la biologie des cellules souches, telles que leur propension de différenciation vers les différentes lignées. Une analyse du transcriptome d'une cellule unique peut être une nouvelle approche pour disséquer la variation individuelle. Nous avons développé la méthode qRT-PCR seule cellule, et a confirmé que cette méthode fonctionne bien dans plusieurs profils d'expression génique. En niveau de la cellule unique, chaque cellule souche embryonnaire humaine, triées par OCT4 :: cellules positives à l'EGFP, a une forte expression dans OCT4, mais un niveau d'expression de NANOG différente. Notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile pour interroger des hétérogénéités de la population.

Introduction

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Populations eucaryotes plus élevés sont hétérogènes donc à l'analyse de la population mis en commun, il est souvent difficile d'interpréter leurs fonctions cellulaires. Les cellules individuelles au sein d'une population peut être légèrement différente, et ces différences peuvent avoir des conséquences importantes pour la propriété et la fonction de l'ensemble de la population 1, 2. Surtout, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont connus pour être hétérogène, ce qui entraîne différents niveaux de la pluripotence et potentiels divers aux spécifications de la lignée dans délicatement façons distinctes 3, 4. Par exemple, les différents antigènes de surface cellulaire peuvent être utilisées pour classer les cellules souches pluripotentes indifférenciées, 5 et le groupe Austin Smith a proposé différents niveaux de la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris, en fonction de leur morphologie, la différenciation propension et la dépendance de la voie 6 de signalisation. Ce phénomène a émis l'hypothèse d'un embryon humaincellules souches nic 7. Considérant que les études globales ont été effectuées entre les différentes lignées de cellules souches, et non pas des cellules souches simples particuliers, il pourrait être très intéressant d'analyser les différents niveaux de la pluripotence au niveau d'une seule cellule, ce qui affecte potentiellement leurs capacités de différenciation vers toutes les lignées de cellules somatiques.

Hétérogénéité cellulaire et moléculaire pourrait être dicté par profilage de transcription, qui est appelé le «transcriptome d'une cellule unique» et met l'accent sur ​​de nouvelles approches pour quantifier les niveaux d'expression des gènes 8-10. Pour l'analyse des niveaux d'expression de gènes dans des cellules individuelles, nous avons développé un protocole simple mais robuste de la cellule unique de RT-PCR quantitative. Nous avons confirmé l'efficacité et la faisabilité de notre protocole en comparant chaque moitié de lysats de cellules individuelles ainsi que ARN totaux dilués en série de CSEh, résultant des variations techniques minimales et les différences. En outre, nous avons utilisé une ligne de reporter génétique pour isoler p homogèneopulation de CSEh à l'aide de système de ciblage de gène. Le vecteur donneur pour cibler OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construire) et une paire de plasmides ont été utilisés Talen 11. Le vecteur donneur et une paire de plasmides Talen ont été introduits dans les CSEh (H9, WA09) à l'aide de notre nucléofection et protocole de sélection clonale et l'entretien des CSEh a été réalisée sur la base de notre protocole de routine 12. Nous avons confirmé cette ligne de reporter génétique exprimer EGFP pour l'expression de OCT4 dans OCT4 :: EGFP CSEh.

Notre résultat démontre que les CSEh individuelles (classés par OCT4 :: cellules fortement positives à l'EGFP) détiennent des niveaux élevés d'expression de OCT4, mais différents niveaux d'expression de NANOG. Ainsi, notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile d'étudier les hétérogénéités de la population de cellules souches pluripotentes.

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Protocole

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1. Préparation d'une plaque de 96 puits

  1. Mélanger 1 pl de Single Cell DNase1 à 9 pi Single Cell Lysis Solution.
  2. Mettez le 10 ul solution mixte dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR.

2. Retrait CSEh pour FACS Purification

  1. Détachez OCT4 :: lignée cellulaire EGFP ES à partir de la boîte de 60 mm avec 1 ml Accutase pendant 20 min, à 37 ° C, qui ont été neutralisés avec les médias ES humaine.
  2. Préparer population de cellules dans 1 ml de tampon FACS et ajuster la cellule à 1 x 10 6 cellules / ml.
  3. Passez l'échantillon de cellules à travers un tamis cellulaire tube à bouchon de 35 um.
  4. Stocker le tube dans la glace avant tri cellulaire.

3. Lysis de FACS purifié cellule unique dans chaque puits de la plaque de 96 puits

  1. Trier l'échantillon pour les cellules positives à l'EGFP sur un trieur de cellules avec un opérateur qualifié. Mettez la cellule unique dans une solution Lysis/DNase1 Single Cell dans la plaque PCR 96 puits. Si nécessaire, le 9Plaque à 6 puits à échantillon peut être stocké à -80 ° C un congélateur inférieur à un mois.
  2. Incuber les échantillons 5 min à température ambiante pendant la lyse des cellules.
  3. Ajouter 1 ul de solution d'arrêt pour arrêter la réaction de lyse.
  4. Incuber 2 min à température ambiante.

4. Transcription inverse

  1. Ajouter à chacun une aliquote de 0,5 ul de 20 uM SMA-T15, SMA-A.
  2. Ajouter 4 ul de tampon 5X, 2 yl de DTT, 1 pi de transcriptase inverse, et 1 ul de dNTP à chaque puits.
  3. Effectuer une transcription inverse dans un thermocycleur.
    1. Réglez le programme thermique à 42 ° C × 90 min et inactiver la transcriptase inverse à 85 ° C × 5 min.

5. Amplification

  1. Ajouter 4 pi de réactif ExoSAP-IT pour chaque échantillon transcrit inverse.
    1. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min et 80 ° C pendant 15 min pour inactiver le réactif ExoSAP-IT.
  2. Préparer mélange réactionnel PCR wvec SMA-p2 (2 nM)
  3. Ajouter 10 ul de mélange réactionnel de PCR pour chaque échantillon transcription inverse.
  4. Effectuer l'amplification, constitué de 20 cycles de dénaturation (94 ° C pendant 30 sec), annelage (57 ° C pendant 30 s) et extension (68 ° C pendant 10 min).

6. Performance qRT-PCR

  1. Ajouter 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul d'ADNc amplifié, 2 nM d'amorces, et 7 ul de l'eau dans chaque puits.
    1. Régler le programme suivi par 95 ° C pendant 3 sec, 60 ° C pendant 30 sec x 40 cycles.
  2. Effectuer en double pour des erreurs techniques.

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Résultats

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Efficace et robuste simple amplification de l'ARN cellulaire

Pour minimiser la variation de la transcription chez les CSEh, nous avons utilisé OCT4 :: EGFP CSEh clone pour la purification FACS. Après le tri oct4 :: cellules positives à l'EGFP dans une plaque de 96 puits, chaque cellule est lysée dans un tampon de lyse et converti poly (A) + ARN à ADNc pleine longueur à l'aide SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) amorce et d'ancrage avec SMA-A (ACATGT...

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Discussion

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Seul gène cellulaire profilage pourrait être un outil important pour prédire la fonctionnalité d'une seule cellule ou une population entière. En raison de limitations techniques, toute l'analyse de profilage génétique a été limitée aux moyennes de la population. Variations dans les modes et les niveaux entre les cellules individuelles et les sous-populations expression génique ont été proposés pour entraîner une interprétation erronée. Ces aspects cellulaires diverses peuvent être trouvés dans les CSEh et leur h...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque PCR 96 puitsUSA scientific1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe Transcriptase inverseClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA polymérase Haute fidélitéInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS buffer45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu ; l DNase, filtre stérilisé
35 &mu ; Tubes de capuchon de crépine de cellule mBD Biosciences352235

Références

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  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
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Mots-clés

qRT PCR sur cellule uniquetri cellulaire activ par fluorescencetranscription inverser action en cha ne par polym rasecellules positives pour OCT4 EGFPprofilage de l expression g niqueh t rog n it de la populationmarqueurs de cellules souches

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