Un protocole impliquant la concentration, l’enrichissement et la détection colorimétrique intégrée des agents pathogènes d’origine alimentaire dans de grands volumes d’eau agricole est présenté ici. L’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés (MMS), enrichis de milieux sélectifs ou non sélectifs, et la détection est effectuée à l’aide de dispositifs analytiques à base de papier (μPAD) intégrés dans des substrats colorimétriques bactériens-indicatifs.
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Article de méthode
Détection colorimétrique sur papier d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes d’eau agricole
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit la détection colorimétrique rapide d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes (10 L) d’eaux agricoles. Ici, l’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés stériles (MMS), qui consistent en un simple filtre de gaze enfermé dans une cartouche en plastique, pour concentrer les bactéries. Après filtration, des enrichissements non sélectifs ou sélectifs des bactéries cibles sont effectués dans le MMS. Pour la détection colorimétrique des bactéries cibles, les enrichissements sont ensuite dosés à l’aide de dispositifs analytiques sur papier (μPAD) intégrés dans des substrats indicateurs de bactéries. Chaque substrat réagit avec des enzymes bactériennes indicatives cibles, générant des produits colorés qui peuvent être détectés visuellement (détection qualitative) sur le μPAD. Alternativement, des images numériques des μPADs réactifs peuvent être générées à l’aide d’appareils de balayage ou photographiques courants et analysées à l’aide du logiciel ImageJ, ce qui permet une interprétation plus objective et standardisée des résultats. Bien que les procédures de dépistage biochimique soient conçues pour identifier les agents pathogènes bactériens susmentionnés, dans certains cas, les enzymes produites par le microbiote de fond ou la dégradation des substrats colorimétriques peuvent produire un faux positif. Par conséquent, une confirmation à l’aide d’un diagnostic plus discriminatoire est nécessaire. Néanmoins, cette plateforme de concentration et de détection bactérienne est peu coûteuse, sensible (limite de détection de 0,1 UFC/ml), facile à réaliser et rapide (la concentration, l’enrichissement et la détection sont réalisés dans un délai d’environ 24 heures), justifiant son utilisation comme première méthode de dépistage de la qualité microbiologique de l’eau agricole.
Introduction
Il est important que les agents pathogènes d’origine alimentaire soient détectés rapidement et de préférence sur le terrain afin de réduire le fardeau des maladies d’origine alimentaire. Les stratégies courantes de détection des agents pathogènes bactériens d’origine alimentaire comprennent le profilage biochimique, la culture sélective et différentielle, l’isolement et la détection immunologiques, et la détection moléculaire. Cependant, ces méthodes sont entravées par une contamination sporadique, la petite taille des échantillons testés, les concentrations souvent faibles de bactéries pathogènes d’origine alimentaire, nécessitent de longs délais de traitement et/ou ....
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Protocole
1. Concentration de bactéries à partir de grands volumes d’eau agricole à l’aide du MMS
- Préparation MMS
- Découpez une section rectangulaire d’étamine à 4 plis de 40 x 12 cm.
- Pliez l’étamine le long des deux axes pour obtenir un rectangle de 20 x 6 cm.
- Roulez l’étamine en serrant fermement le long de son axe long pour former un écouvillon cylindrique d’environ 6 cm de haut et 3 cm de diamètre.
- Autoclavez l’écouvillon en étamine dans une feuille d’aluminium, n’autoclavez pas la cassette. Décontaminer la cassette en la trempant pendant 30 min dans de l’eau de Javel domestique à 10 %, et désactiver le chlore résiduel....
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Résultats
Comme décrit dans ce protocole, la concentration de bactéries à l'aide du MMS (Figure 1) peut être réalisée en environ 15 à 20 minutes. Le MMS est fabriqué en acrylonitrile butadiène styrène (ABS) et se compose de deux éléments distincts : un couvercle et une cartouche, chacun intégrant un ensemble robinet dans lequel est inséré un tampon de gaze cylindrique (Figure 1A). Les deux composants sont ensuite vissés ensemble pour former le MMS (Figure 1B). Le traitement basé s.......
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode intégrée de détection d’E. coli, de Salmonella spp. et de L. monocytogenes dans l’eau agricole. Ici, la concentration en MMS de bactéries à partir de grands volumes (10 L) d’eau agricole, est couplée à l’enrichissement bactérien et à la détection colorimétrique indicative bactérienne à l’aide de μPADs. La procédure MMS peut faire face à une teneur élevée en particules dans les échantillons d’eau tout en concentrant les bactéries par 10, est robuste et suffisammen.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le financement de ce projet par les subventions 2009-01208 et 2009-01984 de l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Eau | Eau d’irrigation, eau de lavage des produits, eau de puits, etc. | ||
| Tubes en vinyle | Wilmar | BN-CVT1005 | ; Diamètre intérieur de 1/4", Diamètre extérieur de 3/8", disponible chez : ; http://www.wilmar.com |
| Cartouche Moore Swab modifiée ; | Lumiere Diagnostics | 11 ½ ; cm de longueur et 4 ½ ; cm de largeur, disponible à l’adresse : ; http ://www.lumierediagnostics.com. ; Alternativement, une version non jetable de la cartouche peut être utilisée (voir le texte) | |
| Étamine | Chesapeake Wiper & Approvisionnement, Inc. | CC90 | Grade #90, tissage 44 x 36, disponible chez : ; |
| www.raglady.com Eau de Javel domestique | Divers | Concentration d’hypochlorite de sodium env. 6 | |
| %Thiosulfate de sodium 5-hydraté | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Collecteur | Construit en interne | En option, l’appareil peut être construit à partir de tuyaux en PVC et de raccords appropriés | |
| Pompe péristaltique | Micronmètres RPP1300 | Disponible à l’adresse : ; http://www.micronmeters.com | |
| Pipette sérologique | Divers | Jetable, 10 ml | |
| Bouillon universel de pré-enrichissement | Difco | 223510 | |
| Eau peptonée tamponnée | Difco | 218105 | |
| Supplément de Salmonella | Biomé ; rieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Bouillon | Biomé ; rieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Divers | Drummond DP-110 utilisé ici | |
| Incubateur à secousses | Divers | Excella E25, New Brunswick Scientific utilisé ici | |
| Micropipette ; | Divers | 10 &mu ; l, 1 ml | |
| Pointes de micropipette | Barrière diverse | , 10 &mu ; l, 1 ml | |
| 1,5 microtubes à centrifuger | Divers | sans RNase et sans DNase | |
| Q Sonica LLC | série | ||
| µ ; PADS | Avant ; | Cercles de 7 mm de diamètre, imprimés à la cire, avec une épaisseur de ligne de 4 pts. Contactez le Dr Charles Henry pour plus d’informations | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime ; Acide -2-éthanesulfonique] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) ; | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) ; | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Boîtes de Pétri, polystyrène 100 mm x 15 mm | Divers | Scanner à | |
| plat | Divers | Scanner USB Xerox | |
| Logiciel ImageJ | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Références
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D.
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Réimpressions et autorisations
