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Article de méthode

Détection colorimétrique sur papier d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes d’eau agricole

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DOI :

10.3791/51414

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9 juin 2014

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1Department of Animal Science, University of Wyoming, 2Department of Chemistry, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 4Department of Animal Sciences, Colorado State University, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Food Science and Human Nutrition, Citrus Research and Education Center, University of Florida, 7Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University

Dans cet article

Résumé

Un protocole impliquant la concentration, l’enrichissement et la détection colorimétrique intégrée des agents pathogènes d’origine alimentaire dans de grands volumes d’eau agricole est présenté ici. L’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés (MMS), enrichis de milieux sélectifs ou non sélectifs, et la détection est effectuée à l’aide de dispositifs analytiques à base de papier (μPAD) intégrés dans des substrats colorimétriques bactériens-indicatifs.

Résumé

Ce protocole décrit la détection colorimétrique rapide d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes (10 L) d’eaux agricoles. Ici, l’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés stériles (MMS), qui consistent en un simple filtre de gaze enfermé dans une cartouche en plastique, pour concentrer les bactéries. Après filtration, des enrichissements non sélectifs ou sélectifs des bactéries cibles sont effectués dans le MMS. Pour la détection colorimétrique des bactéries cibles, les enrichissements sont ensuite dosés à l’aide de dispositifs analytiques sur papier (μPAD) intégrés dans des substrats indicateurs de bactéries. Chaque substrat réagit avec des enzymes bactériennes indicatives cibles, générant des produits colorés qui peuvent être détectés visuellement (détection qualitative) sur le μPAD. Alternativement, des images numériques des μPADs réactifs peuvent être générées à l’aide d’appareils de balayage ou photographiques courants et analysées à l’aide du logiciel ImageJ, ce qui permet une interprétation plus objective et standardisée des résultats. Bien que les procédures de dépistage biochimique soient conçues pour identifier les agents pathogènes bactériens susmentionnés, dans certains cas, les enzymes produites par le microbiote de fond ou la dégradation des substrats colorimétriques peuvent produire un faux positif. Par conséquent, une confirmation à l’aide d’un diagnostic plus discriminatoire est nécessaire. Néanmoins, cette plateforme de concentration et de détection bactérienne est peu coûteuse, sensible (limite de détection de 0,1 UFC/ml), facile à réaliser et rapide (la concentration, l’enrichissement et la détection sont réalisés dans un délai d’environ 24 heures), justifiant son utilisation comme première méthode de dépistage de la qualité microbiologique de l’eau agricole.

Introduction

Il est important que les agents pathogènes d’origine alimentaire soient détectés rapidement et de préférence sur le terrain afin de réduire le fardeau des maladies d’origine alimentaire. Les stratégies courantes de détection des agents pathogènes bactériens d’origine alimentaire comprennent le profilage biochimique, la culture sélective et différentielle, l’isolement et la détection immunologiques, et la détection moléculaire. Cependant, ces méthodes sont entravées par une contamination sporadique, la petite taille des échantillons testés, les concentrations souvent faibles de bactéries pathogènes d’origine alimentaire, nécessitent de longs délais de traitement et/ou ne sont pas applicables sur le terrain. De plus, les composés de nombreuses matrices alimentaires sont inhibiteurs pour les applications de détection et de diagnostic. Afin d’améliorer la probabilité de détection microbienne, la Food and Drug Administration des États-Unis a suggéré que l’analyse de l’eau agricole (comme l’eau de lavage et l’eau d’irrigation) qui entre en contact avec une grande surface de fruits et légumes frais ou qui sert de véhicule à la contamination des fruits et légumes constitue une solution de rechange viable à l’analyse directe des aliments1. Malgré cela, la charge pathogène naturelle souvent faible, associée à l’effet de dilution de l’échantillon d’eau agricole représentatif, rend essentielles les méthodes de préparation des échantillons pour la concentration d’agents pathogènes. Une telle méthode nécessiterait l’échantillonnage de grands volumes d’eau (≥10 L), une concentration adéquate d’agents pathogènes et une compatibilité avec les stratégies de détection en aval.

Les écouvillons Moore modifiés (MMS) sont des dispositifs peu coûteux, simples et robustes utilisés pour concentrer les bactéries à partir de grands volumes (≥10 L) d’eau2-4. Le MMS se compose d’une cassette en plastique remplie de gaze, qui sert de filtre grossier pour de grands volumes d’eau pompés à travers la cassette à l’aide d’une pompe péristaltique. La MMS est une méthode non discriminatoire de concentration bactérienne (concentration ≥10 fois) qui capture les matières particulaires organiques et inorganiques, y compris les micro-organismes, dans les échantillons liquides traités. Il est probable que l’excellente efficacité de la concentration des microorganismes cibles par le SMM puisse s’expliquer par le fait que les microorganismes sont censés être attachés à la fraction limono-argileuse ou aux micro-agrégats organiques des solides en suspension3. La conception robuste du MMS permet de surmonter la plupart des défauts associés aux autres méthodes de filtration pour la capture et la concentration des bactéries dans l’eau, telles que l’obstruction des filtres, l’incapacité à traiter de grands volumes, les échantillons de filtre à haute turbidité et les coûts élevés. Pour ces raisons, la FDA recommande que les MMS soient incorporés dans les procédures officielles de collecte d’échantillons liés à l’environnement et aux fruits et légumes5.

Ici, une méthode est décrite pour la concentration, l’enrichissement et la détection d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans les eaux agricoles. Un MMS est utilisé pour la concentration des bactéries et sert également de récipient pour l’enrichissement bactérien sélectif ou non sélectif. La détection bactérienne est réalisée biochimiquement à l’aide d’appareils analytiques sur papier (μPAD)6. Les PAD peuvent être fabriqués sous forme de réseaux fluidiques ou d’essais ponctuels à l’aide de diverses méthodes, notamment la photolithographie, l’impression à jet d’encre, l’estampage et l’impression à la cire7-11. Des exemples de conceptions fluidiques peuvent être des modèles de canaux dendritiques où l’échantillon est déposé au centre et s’écoule ensuite vers des réservoirs distaux, ou des modèles à canal unique dans lesquels l’échantillon ou le substrat sont tirés des réservoirs externes du canal par capillarité vers le centre12. Pour ce protocole, nous avons choisi d’utiliser pour 7 mm de diamètre des réseaux de spots en papier ciré enrobés de substrats chromogènes pouvant être traités par des enzymes représentatives des micro-organismes testés ici : le rouge de chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG) et le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc) pour la détection de la β-galactosidase et de la β-glucuronidase produites par E. coli; caprylate de 5-bromo-6-chloro-3-indolyle (caprylate magenta) pour la détection de la C8-estérase produite par Salmonella spp. ; et le phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-myo-inositol (X-InP) pour la détection de la phospholipase C SPÉCIFIQUE DU PHOSPHATIDYLINOSITOL (PI-PLC) produite par L. monocytogenes6. Ainsi, la présence d’une bactérie particulière peut être observée visuellement sans avoir besoin d’un équipement complexe ou d’une interprétation des données. La spécificité et la sensibilité de la détection colorimétrique μPAD de ces bactéries cibles spécifiques ont déjà été explorées6. De plus, la sensibilité de la méthode intégrée de détection de la concentration pour ces bactéries cibles a été évaluée par dopage de grands volumes d’eau avec des concentrations prédéterminées de microorganismes (données inédites et Bisha et al.13).

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Protocole

1. Concentration de bactéries à partir de grands volumes d’eau agricole à l’aide du MMS

  1. Préparation MMS
    1. Découpez une section rectangulaire d’étamine à 4 plis de 40 x 12 cm.
    2. Pliez l’étamine le long des deux axes pour obtenir un rectangle de 20 x 6 cm.
    3. Roulez l’étamine en serrant fermement le long de son axe long pour former un écouvillon cylindrique d’environ 6 cm de haut et 3 cm de diamètre.
    4. Autoclavez l’écouvillon en étamine dans une feuille d’aluminium, n’autoclavez pas la cassette. Décontaminer la cassette en la trempant pendant 30 min dans de l’eau de Javel domestique à 10 %, et désactiver le chlore résiduel en trempant la cassette pendant 15 min dans une solution de thiosulfate de sodium pentahydraté (Na2S2O3·5H2O) (50 mg/L préparée dans de l’eau stérile).
    5. Insérez l’écouvillon dans la cassette MMS.
      REMARQUE : Si la version non jetable de la cassette MMS est utilisée, commencez avec une feuille d’étamine à 4 plis mesurant 80 x 22 cm, pliez-la à 40 x 11 cm et roulez-la pour former un cylindre d’environ 11 cm de haut et 6 cm de diamètre.
    6. Assemblez le MMS.
    7. Fixez le tube en vinyle aux embouts des deux côtés du MMS, en vous assurant que le tube adhère parfaitement aux embouts, et fixez le tube dans la pompe péristaltique. S’assurer que la tubulure en amont de la pompe péristaltique est d’une longueur suffisante pour l’échantillonnage.
  2. Concentration de bactéries
    1. Prélever au moins 10 L d’eau agricole en faisant fonctionner la pompe péristaltique à grande vitesse.
    2. Une fois l’échantillonnage terminé, retirer l’entrée de la pompe péristaltique de l’échantillon d’eau et continuer à faire fonctionner la pompe jusqu’à ce qu’aucune eau d’effluent ne sorte du SMM.
    3. Si un collecteur est utilisé pour prélever plusieurs échantillons en même temps, prélever l’effluent de chaque MMS et, lorsque 10 L sont filtrés par un seul MMS, fermer la vanne de ce MMS particulier et continuer à faire fonctionner la pompe.
      1. Une fois l’échantillonnage terminé, prélever l’entrée de la pompe péristaltique de l’eau agricole, ouvrir toutes les vannes du collecteur et continuer à faire fonctionner la pompe jusqu’à ce qu’aucune eau d’effluent ne sorte des MMS.
  3. Lorsque la concentration est terminée pour tous les MMS, retirez soigneusement le tube en vinyle des embouts MMS et fermez les embouts des deux côtés du MMS. Les MMS bien bouchés peuvent être stockés jusqu’à 12 heures avant d’ajouter un support d’enrichissement.

2. Enrichissement MMS et préparation des échantillons

  1. enrichissement
    1. Dévissez le couvercle du MMS et ajoutez aseptiquement 20 ml du bouillon d’enrichissement stérile approprié. Utilisez un MMS pour chaque enrichissement sélectif. Vous pouvez également effectuer un enrichissement non sélectif pour propager les trois bactéries cibles dans le même échantillon.
      REMARQUE : Si la version non jetable de la cassette MMS est utilisée, retirez aseptiquement le filtre en étamine de la cassette et placez-le dans un sac stérile avant d’ajouter 225 ml du milieu d’enrichissement approprié.
      1. Pour l’enrichissement d’E. coli, ajouter 20 ml d’eau peptonée tamponnée (EPP) complétée par 8 mg/L de chlorhydrate de vancomycine.
      2. Pour l’enrichissement de Salmonella spp., ajouter 20 ml d’EPT complété par le supplément de Salmonella (4 ml/L).
      3. Pour l’enrichissement de L. monocytogenes, ajouter 20 ml de bouillon VIDAS UP Listeria (LPT).
      4. Pour un enrichissement non sélectif simultané des trois micro-organismes à l’aide d’un seul MMS, utilisez un bouillon de préenrichissement universel (UPB).
    2. Revissez fermement le couvercle du MMS. Assurez-vous que les robinets sont bien bouchés pour éviter les déversements et la contamination possible lors de l’enrichissement.
    3. Incuber le MMS jusqu’à 18 à 24 heures dans un incubateur à agitation à 200 tr/min. Utiliser 42 °C pour les enrichissements sélectifs d’E. coli et de Salmonella spp. Utiliser 30 °C pour l’enrichissement sélectif de L. monocytogenes, et utiliser 37 °C pour l’enrichissement non sélectif.
  2. Préparation des échantillons
    1. Une fois l’incubation terminée, retirez le MMS de l’incubateur, débouchez l’un des robinets et versez doucement environ 0,5 ml dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Vous pouvez également dévisser le MMS et pipeter 0,5 ml d’enrichissement pendant la nuit.
      REMARQUE : Si la version non jetable de la cassette MMS est utilisée, pipetez 0,5 ml d’enrichissement à partir du sac.
    2. Pour l’analyse colorimétrique de l’enrichissement sélectif d’E. coli, ou pour l’analyse des enrichissements non sélectifs, sonicer 0,5 ml d’enrichissement à 5 W, 22 kHz pendant 20 secondes à l’aide d’une sonde sonicatrice.

3. Préparation et enrobage de substrats colorimétriques dans des μPADs

  1. Préparez suffisamment de μPAD pour chaque échantillon et cible testé. Pour détecter E. coli, préparer les PAD CPRG et X-Gluc, pour la détection de Salmonella spp., préparer les PAD MC et pour la détection de L. monocytogenes, préparer les PAD X-InP.
    1. Préparez le tampon HEPES [0,1 M HEPES avec 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA)] pour les substrats colorimétriques et ajustez le pH du tampon en fonction du substrat qui va être utilisé : pH 7,5 pour la préparation du CPRG ou du X-Gluc, pH 9 pour le MC et pH 7 pour le X-InP.
    2. Préparer des solutions mères des substrats dans le tampon HEPES au pH ajusté à des concentrations de 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Protégez les solutions mères de la lumière.
    3. Placez les μPAD dans une boîte de Pétri stérile, puis intégrez le microspot μPAD avec 24 μl de chaque solution mère de substrat
      4. .

4. Détection et analyse des données

  1. détection
    1. Ajouter 6 μl de l’échantillon enrichi à chaque microspot μPAD approprié contenu dans une boîte de Pétri.
    2. Remettez le couvercle sur la boîte de Pétri et fermez-le avec du Parafilm.
    3. Incuber l’échantillon avec le μPAD à 37 °C pendant 3 heures maximum pour permettre le développement de la couleur et le séchage des microtaches.
  2. Examen visuel des résultats
    1. Effectuer la détection par simple inspection visuelle des changements de couleur des μPADs.
      REMARQUE : En règle générale, de fortes réactions produisant des changements de couleur définitifs sont attendues après 18 à 24 heures d’enrichissement, ce qui devrait éviter la nécessité d’une clarification supplémentaire et devrait être considéré comme positif.
    2. Déterminez la présence d’un échantillon positif à E. coli en observant les microtaches incrustées de CPRG passer du jaune au rouge-violet et les microtaches incrustées de X-Gluc passer de l’incolore au bleu-vert.
    3. Déterminez la présence d’un échantillon positif à L. monocytogenes en observant des microtaches incrustées de X-InP qui passent de l’incolore à l’indigo.
    4. Déterminez la présence d’un échantillon positif à Salmonella spp. en observant les microtaches incrustées de CM qui passent de l’incolore au violet-mauve.
  3. Analyse de données assistée par logiciel
    REMARQUE : Réalisé pour déterminer clairement si les réactions faibles sont positives ou négatives et pour permettre une analyse semi-quantitative des résultats.
    1. Laissez les μPAD sécher complètement.
    2. Numérisez le μPAD à l’aide d’un scanner à plat.
    3. Utilisez le logiciel ImageJ pour traiter l’image.
      1. « Ouvrir » l’image numérisée à analyser dans ImageJ située sous l’onglet « Fichier » du menu principal (ou appuyez sur « Clt+O »).
      2. Inversez l’image en sélectionnant « Inverser » situé sous l’onglet « Modifier » du menu principal (ou appuyez sur « Clt+Maj+I »).
      3. Utilisez l’onglet « Analyser » du menu principal et sélectionnez « Définir les mesures... » pour sélectionner les mesures analysées rapportées.
      4. Assurez-vous que les cases « Intensité moyenne du gris », « Limiter au seuil » et « Afficher l’étiquette » sont cochées, puis appuyez sur « OK ». Cela définit la façon dont le logiciel analyse chaque zone sélectionnée et comment il la signale.
      5. Utilisez l’outil « Ovale » pour dessiner un cercle qui délimite la zone dans laquelle vous souhaitez mesurer.
      6. Sous l’onglet « Analyser », sélectionnez « Mesurer » (ou appuyez sur « Clt+M »). Le logiciel mesurera l’intensité moyenne du gris dans la zone définie et la signalera dans un écran contextuel qui peut être copié et collé dans Excel pour une analyse plus approfondie.
        REMARQUE : Pour des analyses plus précises, au moins deux répétitions techniques de chaque échantillon doivent être effectuées.

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Résultats

Comme décrit dans ce protocole, la concentration de bactéries à l'aide du MMS (Figure 1) peut être réalisée en environ 15 à 20 minutes. Le MMS est fabriqué en acrylonitrile butadiène styrène (ABS) et se compose de deux éléments distincts : un couvercle et une cartouche, chacun intégrant un ensemble robinet dans lequel est inséré un tampon de gaze cylindrique (Figure 1A). Les deux composants sont ensuite vissés ensemble pour former le MMS (Figure 1B). Le traitement basé s...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode intégrée de détection d’E. coli, de Salmonella spp. et de L. monocytogenes dans l’eau agricole. Ici, la concentration en MMS de bactéries à partir de grands volumes (10 L) d’eau agricole, est couplée à l’enrichissement bactérien et à la détection colorimétrique indicative bactérienne à l’aide de μPADs. La procédure MMS peut faire face à une teneur élevée en particules dans les échantillons d’eau tout en concentrant les bactéries par 10, est robuste et suffisammen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le financement de ce projet par les subventions 2009-01208 et 2009-01984 de l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EauEau d’irrigation, eau de lavage des produits, eau de puits, etc.
Tubes en vinyleWilmarBN-CVT1005  ; Diamètre intérieur de 1/4", Diamètre extérieur de 3/8", disponible chez :  ; http://www.wilmar.com
Cartouche Moore Swab modifiée  ;Lumiere Diagnostics11 ½ ; cm de longueur et 4 ½ ; cm de largeur, disponible à l’adresse :  ; http ://www.lumierediagnostics.com.  ; Alternativement, une version non jetable de la cartouche peut être utilisée (voir le texte)
ÉtamineChesapeake Wiper & Approvisionnement, Inc.CC90Grade #90, tissage 44 x 36, disponible chez :  ;
www.raglady.com Eau de Javel domestiqueDiversConcentration d’hypochlorite de sodium env. 6
 %Thiosulfate de sodium 5-hydratéMallinckrodt Baker Inc8100-04
CollecteurConstruit en interneEn option, l’appareil peut être construit à partir de tuyaux en PVC et de raccords appropriés
Pompe péristaltiqueMicronmètres RPP1300Disponible à l’adresse :  ; http://www.micronmeters.com
Pipette sérologiqueDiversJetable, 10 ml
Bouillon universel de pré-enrichissementDifco223510
Eau peptonée tamponnéeDifco218105
Supplément de SalmonellaBiomé ; rieux Industry42650http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) BouillonBiomé ; rieux Industry410848http://www.biomerieux-usa.com
VancomycinSigma-Aldrich861987http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-AidDiversDrummond DP-110 utilisé ici
Incubateur à secoussesDiversExcella E25, New Brunswick Scientific utilisé ici
Micropipette  ;Divers10 &mu ; l, 1 ml
Pointes de micropipetteBarrière diverse, 10 &mu ; l, 1 ml
1,5 microtubes à centrifugerDiverssans RNase et sans DNase
Q Sonica LLCsérie
µ ; PADSAvant  ;Cercles de 7 mm de diamètre, imprimés à la cire, avec une épaisseur de ligne de 4 pts. Contactez le Dr Charles Henry pour plus d’informations
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime ; Acide -2-éthanesulfonique]Sigma-AldrichH3375
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)Sigma-Aldrich59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-glucuronide (X-Gluc)Sigma-AldrichB8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  ;Sigma-Aldrich53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  ;Sigma-Aldrich38896
Boîtes de Pétri, polystyrène 100 mm x 15 mmDiversScanner à
platDiversScanner USB Xerox
Logiciel ImageJNational Institutes of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
agricole sonificateurs à sonde XL-2000 stérile

Références

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  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
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  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
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Réimpressions et autorisations

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