Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence

Résumé

Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l'interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées.

Résumé

Essais basés sur le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) fournissent un moyen sensibles et fiables pour surveiller les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. BRET est le transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un "donneur" à une enzyme luciférase "accepteur" protéine fluorescente. Dans la configuration la plus courante de ce dosage, le donneur est la luciférase de Renilla et l'accepteur est une protéine fluorescente jaune (YFP). Parce que l'efficacité du transfert d'énergie est fortement dépendant de la distance, de l'observation du phénomène BRET exige que le donneur et l'accepteur se trouver à proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d'intérêt dans des cellules de mammifères en culture, une protéine est exprimée comme une fusion avec la luciférase et la seconde comme une fusion avec YFP. Une interaction entre les deux protéines d'intérêt peut apporter le donneur et accepteur suffisamment proche pour le transfert de l'énergie de se produire. Par rapport à d'autres techniques d'investigation protéine-protéine dansinteractions, l'essai BRET est sensible, nécessite peu de mains sur le temps et quelques réactifs, et est capable de détecter les interactions qui sont faibles et transitoires, ou dépendant de l'environnement biochimique trouvé dans une cellule vivante. Il s'agit donc d'une approche idéale pour confirmer les interactions putatives ont été proposées par les deux hybrides de levure ou des études de protéomique par spectrométrie de masse, et en outre, il est bien adaptée pour les régions de cartographie interagissant, l'évaluation de l'effet de modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, et évaluer l'impact des mutations identifiées dans l'ADN du patient.

Introduction

Tant liaison classique et nouvelle génération analyses séquençage de troubles humains sont révélateurs de la pertinence clinique de protéines impliquées dans une gamme de voies biologiques. Il est souvent le cas que, préalablement à leur identification dans de telles études, on a observé peu ou pas d'investigation du rôle biologique de ces protéines. Une piste intéressante pour commencer à explorer la fonction biologique d'une protéine d'intérêt est d'identifier d'autres protéines interagit avec dans son contexte physiologique. Caractérisant les réseaux moléculaires de cette façon permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents ....

Protocole

Une. Création de plasmides

1. Sous-cloner les ADNc pour chacune des protéines d'intérêt dans les deux vecteurs Pluc et pYFP, ​​en utilisant des techniques standards de biologie moléculaire (figure 1). Pour les protocoles détaillés voir Green et al ^13.
2. Toutes les constructions de séquence pour vérifier que les protéines d'intérêt sont en phase avec la séquence Luc / YFP, sans codons d'arrêt intermédiaires.
3. Effectuer des essais fonctionnels comme souhaité afin de confirmer que les protéines de fusion conservent une activité biologique. Dans le cas présenté ici, la localisation subcellulaire de....

Résultats

Le principe de l'essai de BRET est illustré sur la figure 2. L'installation de dosage utilisée dans les expériences présentées ici est représenté sur la figure 3. La détection d'un signal de BRET solide à partir de cellules transfectées avec une protéine de fusion luciférase-YFP a confirmé que le transfert d'énergie était observable dans ce dispositif expérimental (figure 4).

Notre recherche se concentre sur le rôle de la fam.......

Discussion

La conception des produits d'assemblage d'expression de protéines de fusion est une étape critique dans la mise en place de l'essai de BRET. Dans les expériences présentées ici, les protéines d'intérêt ont été fusionnées à l'extrémité C-terminale de la luciférase ou de la YFP. Il est également possible, et peut être nécessaire, pour faire fondre les protéines à l'extrémité N-terminale de la luciférase / YFP. Pour certaines protéines, les fusions ne peuvent être acceptées à l'extrémité N-ou C-.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nanodrop 8000	Nanodrop		N’importe quel spectrophotomètre capable de lire des absorbances à 260 nm conviendra. La détermination de la masse moléculaire du plasmide est cruciale pour calculer les quantités d’ADN à utiliser dans les mélanges de transfection.
Plaques à 96 micropuits, fond plat,	Greiner Bio One	655098	blanches Les plaques blanches réduisent la diaphonie entre les puits et maximisent la sensibilité de la détection de luminescence. Les puits à fond clair permettent de surveiller la densité cellulaire. Les plaques doivent être adaptées à la culture cellulaire. Si vous utilisez un luminomètre à lecture par le haut, le couvercle de la plaque doit être retiré.
Lecteur de plaques Infinite F200Pro avec logiciel de contrôle	TECAN		Utilisez les filtres « Blue 1 » et « Green 1 » pour la mesure de la luminescence et les jeux de filtres et le miroir dichoïque pour GFP pour la mesure de la fluorescence. Tout lecteur de plaques à lecture par le haut capable de mesurer la luminescence et la fluorescence bicolores convient.  ;
Plasmides pLuc, pYFP, témoin positif	N/A	/A	Plasmides disponibles sur demande auprès des auteurs.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plasmide de remplissage pour l’équilisation de la masse d’ADN dans les mélanges de transfection. Tout plasmide dépourvu d’un promoteur eucaryote conviendrait.
Cellules HEK293	ECACC	85120602	D’autres lignées cellulaires qui transfectent avec une efficacité raisonnable peuvent convenir.
DMEM, à haute teneur en glucose, avec rouge de phénol	Gibco	41966	C’est le milieu utilisé pour la culture des cellules HEK293. Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation. Si vous utilisez une lignée cellulaire différente, remplacez le milieu de croissance décrit ici par un milieu spécifique à la lignée cellulaire.
DMEM, teneur élevée en glucose, sans rouge de phénol (milieu de dilution du substrat)	Gibco	21063	Il s’agit du milieu de dilution du substrat de la luciférase (EnduRen) car il ne contient pas de rouge de phénol, ce qui réduit la sensibilité du dos. Contient HEPES pour maintenir un pH correct pendant les mesures de luminescence lorsque les cellules sont hors de l’incubateur CO2. Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM est utilisé pour la dilution du réactif de transfection GeneJuice. D’autres milieux sans sérum conviendraient également. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
Sérum fœtal bovin	Gibco	10270	Pour la supplémentation de milieux de culture cellulaire à une concentration de 10 % v/v.
Réactif de transfection GeneJuice	Novagen	70967	Si vous utilisez une lignée cellulaire autre que HEK293, il peut être nécessaire d’ajuster le rapport entre le réactif de transfection Genejuice et l’ADN dans les mélanges de transfection. D’autres réactifs de transfection peuvent être utilisés. Si vous utilisez un réactif de transfection alternatif, il peut être nécessaire d’optimiser la quantité d’ADN utilisée dans les mélanges de transfection en fonction des instructions du fabricant.
DMSO	Sigma	D2650	Utilisez un DMSO stérile adapté à la culture tissulaire.
Substrat de cellules vivantes EnduRen	Promega	E6481	Reconstitue EnduRen à 34 mg/ml dans le DMSO. Lors de la dilution d’EnduRen dans un milieu de culture, un précipité peut se former. Cela n’interférera pas avec le test. Magasin reconstitué EnduRen à -20 ° ; C, et évitez plusieurs cycles de gel-dégel. Assurez-vous que EnduRen reconstitué est complètement décongelé avant de le diluer dans un milieu de culture.

N