Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

Samantha Khoury; Pamela Ajuyah; Nham Tran

doi:10.3791/51443

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Article de méthode

Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

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DOI :

10.3791/51443

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19 juin 2014

Samantha Khoury¹ , Pamela Ajuyah¹ , Nham Tran²^,³

¹School of Medical and Molecular Biosciences, Faculty of Science, University of Technology, Sydney, ²Centre for Health Technologies, Faculty of Engineering and Information Technology, University of Technology, Sydney, ³The Sydney Head and Neck Cancer Institute, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un procédé d'extraction de petits ARN à partir de sérum humain. Nous avons utilisé cette méthode pour isoler les micro-ARN à partir de sérum de cancer destiné à être utilisé dans les puces à ADN et PCR quantitative singleplex également. Le protocole utilise le phénol et du thiocyanate de guanidinium réactifs avec des modifications pour donner l'ARN de haute qualité.

Résumé

L'analyse de l'ARN et son expression est une caractéristique commune à de nombreux laboratoires. D'importance est l'émergence de petits ARN comme les microARN, qui se trouvent dans les cellules de mammifères. Ces petits ARN sont des régulateurs de gènes puissants de contrôle des canaux vitaux tels que la croissance, le développement et la mort et beaucoup d'intérêt a été réalisé à leur expression dans les fluides corporels. Ceci est dû à leur dérégulation dans les maladies humaines telles que le cancer et leur application possible en tant que biomarqueurs sériques. Cependant, l'analyse de l'expression des miARN dans le sérum peut être problématique. Dans la plupart des cas, la quantité de sérum est de limiter et de sérum contient de faibles quantités d'ARN total, dont de petits ARN constituent seulement 0,4-0,5% ^1. Ainsi l'isolement de quantités suffisantes d'ARN de qualité à partir de sérum est un défi majeur pour les chercheurs d'aujourd'hui. Dans ce document technique, nous démontrons une méthode qui utilise seulement 400 pi de sérum humain pour obtenir l'ARN est suffisante pour soit des puces à ADN ou analyse qPCR. L'unvantages de ce procédé sont sa simplicité et sa capacité à produire de l'ARN de haute qualité. Il ne nécessite pas de colonnes spécialisées pour la purification de petits ARN et utilise des réactifs généraux et du matériel trouvés dans des laboratoires communs. Notre procédé utilise un gel de verrouillage de phase pour éliminer la contamination de phénol tout en donnant en même temps l'ARN de haute qualité. Nous introduisons également une étape supplémentaire pour éliminer encore tous les contaminants lors de l'étape d'isolement. Ce protocole est très efficace pour isoler l'ARN total des rendements allant jusqu'à 100 ng / ul de sérum, mais peut également être adapté à d'autres tissus biologiques.

Introduction

Au cours des dernières années, il ya eu une poussée de plus en plus de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies humaines. Beaucoup d'attention a été porté sur l'utilisation de petits ARN tels que les microARN ² (miARN ou mirs) comme marqueurs potentiels. Ces petits ARN sont trouvés dans les fluides corporels tels que le sérum, et des études ont montré qu'ils sont résistants à la dégradation et sont stables dans une gamme de conditions environnementales variables ^3. Compte tenu de ces caractéristiques miARN, de sérum ou de circulation sont le biomarqueur idéal ^{4, 5.} Actuellement, il existe d....