Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

Résumé

Ce protocole décrit un procédé d'extraction de petits ARN à partir de sérum humain. Nous avons utilisé cette méthode pour isoler les micro-ARN à partir de sérum de cancer destiné à être utilisé dans les puces à ADN et PCR quantitative singleplex également. Le protocole utilise le phénol et du thiocyanate de guanidinium réactifs avec des modifications pour donner l'ARN de haute qualité.

Résumé

L'analyse de l'ARN et son expression est une caractéristique commune à de nombreux laboratoires. D'importance est l'émergence de petits ARN comme les microARN, qui se trouvent dans les cellules de mammifères. Ces petits ARN sont des régulateurs de gènes puissants de contrôle des canaux vitaux tels que la croissance, le développement et la mort et beaucoup d'intérêt a été réalisé à leur expression dans les fluides corporels. Ceci est dû à leur dérégulation dans les maladies humaines telles que le cancer et leur application possible en tant que biomarqueurs sériques. Cependant, l'analyse de l'expression des miARN dans le sérum peut être problématique. Dans la plupart des cas, la quantité de sérum est de limiter et de sérum contient de faibles quantités d'ARN total, dont de petits ARN constituent seulement 0,4-0,5% ^1. Ainsi l'isolement de quantités suffisantes d'ARN de qualité à partir de sérum est un défi majeur pour les chercheurs d'aujourd'hui. Dans ce document technique, nous démontrons une méthode qui utilise seulement 400 pi de sérum humain pour obtenir l'ARN est suffisante pour soit des puces à ADN ou analyse qPCR. L'unvantages de ce procédé sont sa simplicité et sa capacité à produire de l'ARN de haute qualité. Il ne nécessite pas de colonnes spécialisées pour la purification de petits ARN et utilise des réactifs généraux et du matériel trouvés dans des laboratoires communs. Notre procédé utilise un gel de verrouillage de phase pour éliminer la contamination de phénol tout en donnant en même temps l'ARN de haute qualité. Nous introduisons également une étape supplémentaire pour éliminer encore tous les contaminants lors de l'étape d'isolement. Ce protocole est très efficace pour isoler l'ARN total des rendements allant jusqu'à 100 ng / ul de sérum, mais peut également être adapté à d'autres tissus biologiques.

Introduction

Au cours des dernières années, il ya eu une poussée de plus en plus de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies humaines. Beaucoup d'attention a été porté sur l'utilisation de petits ARN tels que les microARN ² (miARN ou mirs) comme marqueurs potentiels. Ces petits ARN sont trouvés dans les fluides corporels tels que le sérum, et des études ont montré qu'ils sont résistants à la dégradation et sont stables dans une gamme de conditions environnementales variables ^3. Compte tenu de ces caractéristiques miARN, de sérum ou de circulation sont le biomarqueur idéal ^{4, 5.} Actuellement, il existe deux approches principales pour l'isolement de petits ARN à partir de fluides biologiques. La première approche utilise une technologie basée sur les colonnes de lier et éluer les petits ARN ^6, tandis que la seconde approche utilise le protocole de longue date avec le phénol et guanidinium thiocyanate réactifs ^7. Nous avons développé un protocole simple, efficace, sans colonne pour isoler de petits ARN à partir de sérum humain. L'ARN isolé est immédiatementment utilisable dans des applications en aval, y compris les tableaux ADN d'oligonucléotides et le séquençage de l'ARN.

Ce protocole a été développé parce que nous avons été confrontés à plusieurs problèmes lors de l'utilisation des méthodes à base de phénol pour isoler l'ARN à partir de sérum. L'approche traditionnelle Chomczynski est fréquemment utilisé dans la plupart des laboratoires avec une gamme de réactifs disponibles dans la plupart des fournisseurs commerciaux. Toutefois, compte tenu de leur utilisation généralisée, les lignes directrices strictes n'ont pas été développées pour produire toujours ARN de haute qualité à partir de fluides corporels, dans le sang ou le sérum particulier.

Les problèmes courants associés à l'isolement d'ARN à partir de sérum d'ARN comprennent des rendements faibles et une contamination par des réactifs utilisés au cours de l'isolement, en particulier le phénol. Notre approche élimine ces impuretés phénoliques pour fournir de l'ARN de haute qualité pour analyse en aval telles que la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de l'ARN. Nous avons également testé cet ARN sur les tableaux de miARN.

Protocole

Remarque: les échantillons de sérum humain provenant de patients sains ou des patients atteints de cancer ont été obtenus avec le consentement éclairé sous protocoles éthiques humaines agréés du Royal Prince Alfred Hospital de Sydney (numéro de protocole X10-0016 et HREC/10/RPAH/24) et l'Université de Technologie, Sydney. Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients avant la chirurgie de divers hôpitaux de Sydney et placés dans le stockage à -80 ° C.

1. Petite isolement d'ARN à partir de sérum

L'ARN total a été préparé à partir de sérum humain à l'aide d'une version modifiée du protocole du Tri-Reagent LS RT.

1. Décongeler échantillon de sérum congelé sur de la glace, puis transférer 400 pl de sérum fraîchement décongelé dans un tube à centrifuger étiqueté.
2. Diluer le sérum avec 100 ul de RNase H ₂ O et ajouter la proteinase K à une concentration de 1 mg / ml.
3. Incuber à 37 ° C pendant 20 min pour permettre la digestion des protéines par la protéinase K.
4. To assurer la solubilisation complète, ajouter 1,5 fois son volume de Tri-Reagent RT LS et 100 pi de 4 bromoanisole.
5. Inverser brièvement l'homogénat, effectuer pipetage répétitif pendant 5 secondes et transférer dans un tube de 2 ml lourd à verrouillage de phase marquée.
6. Spin l'homogénat à 12 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
7. Décanter avec soin au moins 1 ml de la solution aqueuse obtenue dans un nouveau tube ADN LoBind. L'interphase organique et doit être pris au piège sous le gel blanc du tube à verrouillage de phase.
8. Ajouter 5,0 pl de glycogène (5 mg / ml) et 500 ul d'isopropanol à 100% à la solution aqueuse, mélanger par retournement, et incuber O / N à 20 ° C.
9. Suite à O / N incubation, centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse 4 C °.
10. Jeter le surnageant clair et effectuer un "flash" rotation pendant 2 min à 16000 x g dans une centrifugeuse C 4 °.
11. Retirez délicatement le sol clairution entourant la pastille à l'aide d'une pipette.
12. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifuger à 10 000 g pendant 10 min. Décanter la solution de lavage et répétez l'étape de lavage.

2. ARN remise en suspension dans la solution

1. Reprendre le culot dans 10 ul de RNase H ₂ O, en assurant le culot est complètement dissous. Afin de s'assurer que l'ARN est complètement solubilisé l'échantillon peut être chauffé à 55 ° C pendant 5 min. Pendant ce temps, mélanger l'échantillon avec pipetage répété. Pour un rendement élevé de l'ARN total, en commun deux préparations d'ARN provenant du même patient.
2. Quantifier l'ARN remises en suspension à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis et évaluer la qualité de l'ARN en utilisant une Bioanalyseur 2100. Stocker les échantillons d'ARN regroupées à -80 ° C pour une utilisation dans des applications en aval.

Résultats

La figure 1 représente un spectre typique UV / Vis de l'ARN isolé à partir de sérum. De ce profil, nous avons constaté la contamination de la protéine à 280 nm avec du phénol et de contaminants organiques à la fois à 270 nm et 230 nm, respectivement. Résidu thiocyanate de guanidinium a également été noté à 260 nm. Afin de réduire les contaminants, une série d'étapes d'optimisation ont été apportées à la procédure de Tri-Reagent RT-LS standard. On a ajouté 5 mg / ml de glycogène à augmenter à...

Discussion

La population de microARN représente environ 0,4-0,5% de l'ARN total dans le sérum. En outre il existe également une teneur élevée en protéine présente dans le sérum humain. Pour améliorer l'ARN et de réduire à la fois la protéine et le phénol contamine nous avons modifié l'approche traditionnelle Chomczynski ⁹ avec l'ajout de plusieurs étapes.

L'ARN total a été isolé à partir de sérum en utilisant la norme Tri-Reagent RT-LS (Centre de recherche moléculaire) ma...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tri-réactif RT LS	Molecular Research Center, États-Unis	TR 118
RNase libre H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finlande	EO0491
Tube Heavy Phase Lock	5PRIME	2302830	capacité de 2 ml
DNA Tube Lobind	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml capacité
Glycogène	Invitrogen,	États-Unis 10814-010	5 mg/ml
Isopropanol de qualité ARN	Sigma Aldrich, États-Unis	I9516 Centrifugeuse	réfrigérée à 100 %
	Spectrophotomètre UV-Vis John Morris
Nanodrop Thermo	Fisher Scientific, États-Unis
Éthanol de qualité ARN	Sigma Aldrich, États-Unis	E7023	70 %
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent, États-Unis