La combinaison unique molécule manipulation et d'imagerie pour l'étude des interactions protéine-ADN

Résumé

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

Résumé

L’article décrit la combinaison de pinces optiques et de détection de fluorescence de molécules uniques pour l’étude de l’interaction protéine-ADN. La méthode offre la possibilité d’étudier les interactions se produisant en solution (évitant ainsi les problèmes dus aux surfaces proches comme dans d’autres méthodes à molécule unique), de contrôler l’extension de l’ADN et de suivre la dynamique des interactions en fonction des paramètres mécaniques et de la séquence d’ADN. Les méthodes permettant d’établir avec succès le piégeage optique et la localisation nanométrique de molécules uniques sont illustrées. Nous illustrons les conditions expérimentales permettant l’étude de l’interaction du répresseur de lactose (lacI), marqué avec Atto532, avec une molécule d’ADN contenant des séquences cibles spécifiques (opérateurs) pour la liaison de Laci. La méthode permet l’observation d’interactions spécifiques au niveau des opérateurs, ainsi que la diffusion unidimensionnelle de la protéine pendant le processus de recherche de cibles. La méthode est largement applicable à l’étude des interactions protéine-ADN mais aussi aux moteurs moléculaires, où le contrôle de la tension appliquée au polymère de piste partenaire (par exemple l’actine ou les microtubules) est souhaitable.

Introduction

Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels ^1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères ⁴ et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine ⁵ et interactions protéine-ADN ^6,7. SM détection de fluorescence, d'autre part, représente un outil très polyvalent pour l'étude de l'activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit....

Protocole

1. optiques pincettes installation avec nanomètre stabilité

Le dispositif expérimental doit fournir deux pinces optiques à pointer la stabilité au niveau et l'intensité nanomètre fluctuations du laser de piégeage en dessous de 1%. La combinaison de ces conditions sera d'assurer la stabilité du nanomètre de l'haltère sous tension typique (1 pN - quelques dizaines de PN), la rigidité de piège (0,1 pN / nm) et la bande passante de mesure (taux d'acquisition d'image 20 sec ^-1). Un schéma du dispositif expérimental est représenté sur la figure 1.

1. Conception optique des pincettes et la ....

Résultats

Dans une expérience réussie, une (ou plusieurs) des protéines marquées subissent liaison / déliaison diffusion et / ou monodimensionnelle long de la molécule d'ADN (figure 3A). La localisation des protéines le long de la molécule d'ADN permet la quantification de paramètres cinétiques en fonction de la séquence d'ADN. Lorsque les conditions de tampon provoquant la diffusion 1D sont appliqués, il est possible de suivre des trajectoires de protéines, et de déterminer, par exemple, le coefficient de diffus.......

Discussion

Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d'imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d'imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l'état mécanique d'un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymère . Contrôle .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isolateurs élastomères	Newport	Newdamp	Choisissez l’élastomère Newdamp approprié en fonction du poids du microscope et des fréquences de résonance
Isolateur optique	Optique pour la recherche	Laser IO-3-YAG-VHP
Nd :YAG, longueur d’onde de 1 064 nm	Spectra-Physics	Millennia IR
Déflecteurs acousto-optiques (AOD)	A& A optoélectronique	DTS-XY 250
Direct Digital Synthétiseurs	Analog Devices
Détecteur de quadrants photodiodes	OSI optoélectronique	SPOT-15-YAG
DIO et FPGA	National Instruments	NI-PCI-7830R
Lampe halogène	Schott	KL 1500
LCD Condenseur	Olympus	U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objectif	Nikon	CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA immersion
532 nm laser	Coherent	Sapphire
CCD 200X et 2000X	Hamamatsu  ;	XC-ST70 CE
CCD multiplié par électrons	Hamamatsu  ;	C9100-13
Platine piézoélectrique avec précision nm	Physik Instrumente	P-527.2CL  ;
Filtre d’émission	Chroma Technologies	600/100m
Billes de silice (1,54 mm)	Bangs Laboratories	SS04N/5303
Albumine de sérum bovin (BSA)	Sigma Aldrich	B4287
Acétate de pentyle  ;	Sigma Aldrich	46022	Liquide et vapeur inflammables (n° 1272/2008)
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8267-5EA	Solide inflammable  ; (n° 1272/2008)
Bloc chauffant	MPM Instruments Srl	M502-HBD	avec 2 blocs amovibles ; préchauffé à 120 ° ; C
NanoPort assemble	Upchurch Scientific Inc.	N-333
Tube en polyétheréthercétone  ;	Upchurch Scientific Inc.	1535
Support métallique fait maison pour le montage du réservoir de pression de la chambre d’écoulement en plexiglass
Seringues à embout verrouillable Luer 2,5 ml	Terumo	SS 02LZ1
Vannes d’arrêt  ;	Upchurch Scientific, Inc.	P-732
Raccords sans bride  ;	Upchurch Scientific, Inc.	LT-111
Tube d’éthylène-propylène fluoré  ;	Upchurch Scientific, Inc.	1549
Deux électrovannes commandées par ordinateur	Clippard, Cincinnati, USA	ET-2-H-M5
Transducteur de pression	Druck LTD	PTX 1400
biotine-14-dCTP  ;	Life Technologies	19518-018
Désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT)	Thermoscientific	EP0161
ATTO532 maleimide	Sigma Aldrich	68499
N,N-diméthylformamide (DMF)  ;	Sigma Aldrich	227056	Liquide combustible, nocif par absorption cutanée. Irritant, tératogène. H226 ; H303 ; H312 ; H316 ; H319 ; H331 ; H360 ; P201 ; P261 (traduction libre) P280 ; P305 ; P. 351 ; P. 338 ; P311
Chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)  ;	Sigma Aldrich	C4706
L-Glutathion réduit (GSH)	Sigma Aldrich	G4251	Toxicité aiguë, orale (catégorie 5), H303
Amicon Ultra-15, Membrane PLQK Ultracel-PL, 10  ; Concentrateurs de centrifugation de coupure kDa	Merck Millipore	UFC901024
billes de polystyrène recouvertes de streptavidine 1.87 µ ; m	Spherotech, Inc.	SVP-15-5