Une méthode peu coûteuse pour l'analyse de la saisie-comme activité et de mouvement dans Drosophila

Résumé

En utilisant une webcam et une combinaison de logiciels libres et peu coûteux, les modèles de locomotives de Drosophila melanogaster peuvent être analysés pour détecter des différences dans la vitesse, la distance et le temps de diverses activités motrices.

Résumé

des systèmes de suivi vidéo ont été largement utilisés pour analyser Drosophila melanogaster mouvement et détecter diverses anomalies dans le comportement de la locomotive. Bien que ces systèmes peuvent fournir une foule de renseignements sur le comportement, le coût et la complexité de ces systèmes peuvent être prohibitifs pour de nombreux laboratoires. Nous avons mis au point un test à faible coût pour mesurer le comportement locomotive et le mouvement de saisie dans D. melanogaster. Le système utilise une webcam pour capturer des images qui peuvent être traitées en utilisant une combinaison de logiciel et peu coûteux libre de suivre la distance parcourue, la vitesse moyenne de circulation et de la durée du mouvement pendant un laps de temps spécifié. Pour démontrer l'utilité de ce système, nous avons examiné un groupe de mutants de D. melanogaster, les (BS) paralytiques Bang-sensibles, qui sont 3-10 fois plus sensibles à l'activité de saisie-comme (SLA) que sauvages mouches de type. L'utilisation de ce nouveau système, nous avons pu détecter que le BS mutanet coup insensé (BSS) présente des niveaux inférieurs de locomotion exploratoire dans un nouvel environnement de mouches de type sauvage. En outre, le système a été utilisé pour indiquer que la metformine, qui est couramment utilisé pour traiter le diabète de type II, réduit l'intensité de la SLA chez les mutants de BS.

Introduction

Compte tenu de sa courte durée de vie et les outils génétiques robustes disponibles, Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour étudier l'étiologie de diverses maladies et la physiologie sous-jacente de divers processus biologiques. Dans de nombreux cas, il est avantageux de mesurer les effets des manipulations que du comportement, génétiques ou pharmacologiques ont sur ​​la locomotion chez ces organismes modèles ^1,2.

Il existe une variété de procédés qui sont couramment utilisés pour mesurer le déplacement de la mouche à deux dimensions ^7.3. Ces systèmes peuvent soutenir le suivi des multiples vol simultanément et peuvent mesurer la vitesse, fiche chemin longueurs et enregistrer le pourcentage de temps une mouche a passé en mouvement. Ils ont été utilisés pour étudier le mouvement dans une variété de contextes, y compris les effets des médicaments sur la locomotion et la nature dimorphisme sexuel de la mouche mouvement ^6-9. L'inconvénient majeur de ces systèmes est le coût des systèmes de suivitempérature ou le logiciel et la caméra correspondante. Dans certains cas, cela peut fonctionner dans les milliers de dollars. Le coût est une préoccupation particulière pour un laboratoire qui suffit usage limité d'un tel système, par exemple, de quantifier les modèles de locomotives d'un mutant nouvellement isolée.

Une méthode plus simple mais moins robuste est d'utiliser des systèmes qui mouvement d'enregistrement basées sur le nombre de fois une mouche traverse un chemin de faisceau de lumière infrarouge qui est placé au milieu d'un tube fermé ^10,11. Bien que ces systèmes peuvent donner de précieuses informations sur les cycles de mouvement et de veille-sommeil, ils peuvent plus ou moins de mouvement estimation parce qu'ils ne parviennent pas à saisir la trajectoire réelle de la mouche. Par exemple, les mouches qui présentent un mouvement considérable aux extrémités du tube enregistreront aussi bas mouvement vole bien que les méthodes à haute résolution supplémentaires ont été utilisées pour essayer de contourner ces limitations ^12.

Plus simple et moins cher encore sont des dispositifs qui mesurent geotaxi grimpantess, le mouvement ascendant de vol, par un tube unique ou une série de tubes ^2,13. Bien que ces systèmes ne coûtent pas cher et peuvent facilement identifier les défauts de géotaxie, ils ne parviennent pas à capturer de nombreux autres aspects de mouvement qui serait intéressant pour les chercheurs.

Pour de nombreux laboratoires, un système d'analyse robuste à faible coût qui est simple à mettre en place et faire fonctionner serait un outil intéressant pour caractériser les différences de comportement dans D. melanogaster souches. Nous décrivons ici un test qui peut être mis en place depuis moins de deux cents dollars et est en mesure de donner des informations sur le chemin, la vitesse et la durée du mouvement de la mouche. Pour démontrer l'efficacité du dosage, on présente des données montrant que il peut être utilisé pour identifier: 1) un défaut locomoteur dans un mutant Bang-sensible (BS) qui est sensible à des convulsions et 2) la capacité de la metformine, qui est couramment utilisé pour traiter le diabète de type II, de réduire l'intensité de l'activité de saisie-comme (SLA) in deux mutants de BS.

Protocole

Une. Préparation de l'individu vole pour Locomotion Assay

1. Transfert vole en tapotant doucement dans des flacons individuels vides et coiffer les flacons avec un tampon de coton. Permettre vol de s'asseoir tranquillement 20-30 min avant l'observation. Il est important de ne pas anesthésier les mouches dans les heures précédant l'observation du comportement que des études antérieures ont montré que l'exposition de l'anesthésie peut modifier le comportement par rapport aux mouches non anesthésiés ^14.
2. Tapoter doucement la volée sur le flacon et placez-mouches individuels sous un couvercle plat de Pétri de 5 cm de diamètre (5 mm de haut) avec de petites fentes pour permettre le passage de l'air. Éclairer par en dessous et observer les mouches à l'aide d'une webcam montée au-dessus de la boîte de Pétri.

2. Préparation de l'individu vole de saisie Assay

1. Nourrir deux jours anciens mouches sensibles de saisie soit médias gélose levure / farine de maïs / standards ou médias classiques mélangés directement avec la drogue. Pour les données présentées ici, les mouches ont été nourris soit 1 Gof médias standard ou 1 g de médias classiques mélangés avec 25 mg de metformine.
2. Après les mouches ont nourri pendant deux jours sur les médias ou les médias ainsi que la drogue, les transférer en tapotant doucement dans des flacons individuels vides et coiffer les flacons avec un tampon de coton. Permettre vol tranquille pendant 20 min avant l'observation. Il est important de ne pas anesthésier les mouches dans les heures précédant l'observation du comportement que des études antérieures ont montré que l'exposition de l'anesthésie peut modifier le comportement par rapport aux mouches non anesthésiés ^14.
3. Vortex flacons individuels contenant une mouche sur un vortex de laboratoire en utilisant le réglage le plus élevé pendant 10 sec. Placez la volée immobilisé sur une feuille de papier blanche directement sous une webcam montée au-dessus du papier.

3. Enregistrement vidéo

1. Enregistrer le mouvement ou SLA en utilisant le logiciel HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Ce programme utilise la webcamcapturer des images sur la base des paramètres de l'utilisateur.
2. Sélectionnez l'option Heure en images-Lapse sous l'onglet Capture, Lorsque la fenêtre s'ouvre, sélectionnez la webcam comme périphérique de capture. Pour la plupart des expériences, la taille de l'image vidéo de 640 x 480 est suffisante.
3. Sélectionnez Intel IYUV codec pour la compression et choisir 0,1 sec / cadre pour le dosage de la saisie ou de choisir 0,1-0,5 sec / cadre pour l'analyse de mouvement. Sous l'onglet Avancé, sélectionnez créer un fichier image bmp. Pour chaque capture et sélectionnez un dossier pour le programme pour stocker les images qu'il prend (la pile de l'image).
4. Placez une mouche morte sur la feuille de papier. Cliquez sur la boîte des paramètres vidéo et d'ajuster les paramètres sous l'onglet Paramètres de l'appareil afin qu'il y ait un fond blanc lumineux et un contraste évident avec la mouche sombre.
5. Cliquez sur le bouton start pour commencer l'enregistrement. Une fois la période d'enregistrement est terminée, cliquez sur le bouton d'arrêt. La pile de l'image devrait maintenant être dans le dossier sélectionné. Remarque: Avant d'enregistrer, d'assurer le respect des loisder sélectionné pour la pile d'image est vide.

4. Analyse des données utilisant ImageJ

1. Image libre de ImageJ logiciel de traitement d'Open NIH, qui peut être téléchargé à http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Remarque: En plus de télécharger le programme, le plug-in Multitracker doit être téléchargé et installé comme indiqué à http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
2. Importez la pile d'images dans ImageJ en cliquant sur l'onglet Fichier, puis sélectionnez Importer → séquence de l'image.
   1. Sélectionnez le dossier qui contient la pile d'images, sélectionnez l'une des images et sélectionnez Ouvrir. Une boîte de dialogue Options de la séquence s'ouvre. Cliquez sur les noms Trier numérique, puis cliquez sur OK et la pile d'image sera chargée dans ImageJ.
3. Seuil toutes les images de sorte que chaque compose d'un fond blanc avec la mouche étantconverti à un point noir. Pour commencer ce processus, convertir l'image en un format 8 bits en sélectionnant type → 8 bits sous l'onglet Image.
   1. Cliquez sur l'onglet Image et sélectionnez Ajuster → Seuil. Cela va ouvrir la boîte de dialogue de seuil dans lequel le seuil point de coupure peut être réglée.
   2. Parcourez les images pour voir s'il ya des points noirs supplémentaires ou si une tranche manque un point noir. Si tel est le cas, ajuster le seuil pour atténuer le problème. Habituellement, le seuil n'a pas besoin d'être ajusté les paramètres par défaut du programme à une valeur adéquate.
      Remarque: Chaque diapositive dans la pile devrait avoir seulement un point noir représentant la position de la mouche.
   3. Sélectionnez s'applique dans la boîte de dialogue de seuil et un Convertir Masque boîte de dialogue s'ouvre. Ne cliquez pas sur l'une des options, mais il suffit de cliquer sur OK pour seuil, la pile d'images.
4. Après seuillage la pile d'images, sélectionnez la Multitracker plug-in dans l'onglet Plugins pourmesurer le mouvement de la mouche en pixels. La boîte de dialogue Objet Tracker apparaît.
   1. Cliquez sur toutes les quatre options proposées dans la boîte de dialogue, puis sélectionnez OK. Le plug-in Multitracker alors joindre coordonnées pour le point noir dans chaque tranche et énumérez-les dans la fenêtre des résultats, ainsi que la longueur totale du trajet en pixels. La fenêtre Chemins donne un affichage graphique de la trajectoire de la mouche a.
   2. Copiez le x et y coordonner liste de la fenêtre Résultats et coller les données dans une feuille de calcul Excel. Si n'importe quelle diapositive de la pile n'a pas de point noir, le programme Multitracker s'arrête à cette diapositive. Si cela se produit, il est nécessaire de revenir à l'étape 4.2 et re-seuil, la pile à veiller à ce que les registres de mouches comme un point noir dans la diapositive en question.
5. Afin de convertir le chemin longueurs de pixels cm, prendre une image distincte de deux points qui sont espacés d'un cm d'intervalle sur un morceau de papier blanc.
   1. Suivez ci-dessusles étapes (3.1-4.4.2), afin de déterminer les coordonnées x, y pixel pour les deux points et à utiliser cette information pour déterminer le nombre de pixels correspondant à un cm. Ce facteur de conversion est utilisé dans l'étape cinq pour générer des données de mouvement en cm. Remarque: Une fois cela fait, il est important de garder la caméra fixe pour tous les futurs enregistrements. Chaque fois que la caméra est déplacée ou ajusté, on a besoin de répéter cette étape pour convertir les pixels cm.
   2. La longueur du chemin qui est généré par le plug-in Multitracker surestime mouvement parce que de légères fluctuations de la position du corps et l'intensité lumineuse / réflexion auront une incidence sur la taille et le centre du point noir qui est généré lorsque seuillage des images. Ce bruit doit être enlevé afin d'obtenir une estimation précise du mouvement de la mouche.

5. Analyse des données Utilisation d'Excel

1. Retirez le bruit à partir des données enregistrées par l'importation de la série de coordonnées x, y généré par le pr MultitrackerOgram dans Fly analyse, un programme Visual Basic Excel créé par les auteurs. (Le programme est disponible en communiquant avec les auteurs.)
2. Cliquez sur l'icône Click Me bouton et sélectionnez une valeur de seuil de coupure. Sélectionner une valeur seuil de 0,5 cm / sec pour l'analyse de SLA ou sélectionnez une valeur comprise entre 0,1 à 0,3 cm / sec pour l'analyse du mouvement. Cliquez sur OK et le programme va calculer la vitesse, le temps et la distance de mouvement. Remarque: Le programme utilise une analyse de fenêtre coulissante pour évaluer les données séquentielles 0,5-1,0 bacs sec et calcule la vitesse au cours de cette fenêtre. Tout ce qui dépasse le seuil défini par l'utilisateur est considéré comme un mouvement à la mouche.

Résultats

La technique décrite ici a déjà été utilisé pour analyser les différences de SLA dans les mutants de Drosophila BS ^1. Les résultats présentés ici concernent les souches de BS facilement choqué (SD), coup insensé (BSS), et KO technique (TKO). Le locus eas code pour une kinase impliquée dans la synthèse de l'éthanolamine phosphatidyl éthanolamine ¹⁵ et le locus tko code pour une riboprotein mitochondrial ^16. La mutation de BSS est un al...

Discussion

Lors de l'examen locomoteur ou les habitudes de déplacement chez la drosophile, il est utile de pouvoir extraire des informations sur la distance parcourue, la vitesse de déplacement et le modèle de mouvement. Pour extraire ces informations, du matériel coûteux a été traditionnellement employée qui est souvent prohibitif pour les petits laboratoires ou des laboratoires qui souhaitent utiliser ces tests avec parcimonie ^4,8,9.

L'essai décrit ici peut être utilisé po...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
WebCam	Logitech	Pro900 N’importe	quelle webcam de qualité suffira.
Logiciel HandiAVI time-lapse		Azcendant	La dernière version peut être trouvée sur http://www.azcendant.com/
ImageJ	NIH		La dernière version peut être trouvée sur http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-In	NIH		La dernière version peut être trouvée sur http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
Vortexer		VWR Vortex Genie 2	La plupart des vortex de taille standard tels que le Vortex Genie 2 suffiront.
Couvercle de boîte de Pétri de 5 cm	LabM Limited	D011	Des couvercles de boîte de Pétri plus petits ou plus grands peuvent être utilisés pour une arène dans le test de mouvement.
Caisson lumineux	fabriqué		Construit à partir de matériaux de rebut. L’éclairage est utilisé pour le test de locomotion. En fonction de l’éclairage de la pièce, il est possible d’effectuer le test sans la boîte à lumière.