Application de l'acide rétinoïque pour obtenir des cultures de ostéocytes de primaires ostéoblastes de souris

Résumé

Traitement des ostéoblastes primaires de souris avec de l'acide rétinoïque produit une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes. La méthode permet de surmonter la difficulté d'obtenir et de maintenir ostéocytes primaires en culture, et peut être avantageux d'étudier les cellules dérivées de modèles transgéniques.

Résumé

La nécessité pour les cultures de ostéocytes est bien connu de la communauté des chercheurs d'os; isolement des ostéocytes primaire est difficile et produit un faible nombre de cellules. Par conséquent, le système cellulaire le plus largement utilisé est la lignée de cellules ostéocytes MLO-Y4-like.

Le procédé décrit ici se réfère à l'utilisation de l'acide rétinoïque pour générer une population homogène de cellules ramifiées ayant des caractéristiques morphologiques et moléculaires ostéocytes.

Après isolement des ostéoblastes à partir de calvaria de souris, de l'acide tout-trans rétinoïque (ATRA) est ajouté au milieu de la cellule, et la surveillance de la cellule est réalisée tous les jours sous un microscope inversé. Premiers changements morphologiques sont détectables au bout de 2 jours de traitement et la différenciation est généralement complète en 5 jours, avec le développement progressif de dendrites, la perte de la capacité de produire la matrice extracellulaire, la régulation des marqueurs des ostéoblastes et la régulation des molécules spécifiques ostéocytes. contenu "> le suivi des cellules quotidien est nécessaire en raison de la variabilité inhérente de cellules primaires, et le protocole peut être adapté avec une variation minime de cellules obtenues à partir de différentes souches de souris et appliquées à des modèles transgéniques.

Le procédé est facile à réaliser et ne nécessite pas d'instruments spéciaux, il est hautement reproductible, et génère rapidement une population d'ostéocytes matures en absence totale de matrice extracellulaire, ce qui permet l'utilisation de ces cellules pour des applications biologiques illimitées.

Introduction

Les ostéocytes, le type de cellules osseuses les plus abondants, sont définitivement différenciés, les cellules hautement ramifiés profondément situés à l'intérieur du squelette. Le corps de la cellule de ostéocytes matures sont contenues dans les lacunes de l'os et avoir des formes diverses; ostéocytes avec les corps cellulaires allongées sont trouvés dans l'os cortical, alors que les ostéocytes arrondis sont plus fréquents dans l'os trabéculaire ^1. Dendrites ramifiées s'étendent à partir du corps cellulaire et résident dans les canaux minuscules appelés canalicules, formant un réseau complexe qui fait plusieurs contacts non seulement ....

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon la réglementation en vigueur européennes concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Milan et national.

Une. Isolement des ostéoblastes primaires

Le procédé, avec des modifications mineures, suit le mode opératoire décrit par ¹⁴ Dodig et al.

1. Préparer digérer milieu, par addition de 0,1% de collagénase P et 0,05% de trypsine (à partir de 2,5% de trypsine 10X, sans rouge de phénol) de milieu HBSS (sol....

Résultats

Les résultats ont été obtenus de 5 à 10 expériences indépendantes.

Morphologie des cellules

AA / GP traité cellules primaires ont des caractéristiques principalement pavées comme, caractéristique des ostéoblastes matures. Cellules ramifiées entrecoupées (comme indiqué par les flèches rouges dans la figure 1A) peut être trouvé, qui représentent probablement des ostéocytes.

Avec un traitement ATRA, les cellules commencent rap.......

Discussion

Dans les dernières années, le ostéocyte a émergé comme la cellule la plus centrale dans l'os. progrès de la recherche sont progressivement révèlent un certain nombre de propriétés de ostéocytes insoupçonnées ou non prouvées, qui sont d'une valeur inestimable pour la conception de nouveaux et de meilleurs traitements pour une variété de maladies osseuses. Toutefois, l'enquête de ostéocyte biologie a souffert de la disponibilité limitée des modèles in vitro à un point tel que les ostéoblastes ont été .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase P	Roche Sciences Appliquées	11213857001
Trypsine	Gibco, Technologies de la Vie	15400054
HBSS	Gibco, Technologies de la Vie	14175129	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycine/Pénicilline	Sigma-Aldrich	P4333
Acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A4403
Glycérol 2-phosphate disodium sel hydraté	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protéger ATRA de la lumière
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissoudre dans le PBS et filtrer avant utilisation. Travaillez toujours sous un capot chimique.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Peut être ajouté à l’anticorps secondaire
Rouge d’alizarine	Sigma-Aldrich	A5533
Vert Janus	Sigma-Aldrich	201677
Acide perchlorique	Sigma-Aldrich	176745	Utilisation prudente (protection de la peau et des yeux recommandée)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	À utiliser avec prudence (une protection de la peau et des yeux est recommandée)
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Pince à épiler économique #7, pointes de 0,40 x 0,5 mm World	Precision Instruments	501981
pince à épiler économique #4, pointes de 0,40 x 0,45 mm	World Precision Instruments	501978
Ciseaux de dissection, droits, courbés 10 cm	World Precision Instruments	14394
Ciseaux chirurgicaux, 14 cm, droits, S/S	World Precision Instruments	501218
Fioles de culture	Corning	430168
Plaques de puits	Corning	3335
Thermanox lamelles Thermo	Scientific Nunc	12-565-27
Microscope	Zeiss Apotome
Spectromètre	Safas Xenius