Super-résolution d'imagerie de l'Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Résumé

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

Résumé

Imagerie d'échantillons biologiques à l'aide de la microscopie à fluorescence a considérablement avancé avec les nouvelles technologies pour surmonter la barrière de la résolution de la diffraction de la lumière qui permet de super-résolution des échantillons vivants. Il existe actuellement trois grands types de techniques de super-résolution - stimulé l'épuisement d'émission (STED), la microscopie de localisation de molécule unique (y compris des techniques telles que PALM, STORM, et GDSIM) et la microscopie illumination structurée (SIM). Bien que les techniques de localisation STED et une seule molécule montrent les plus fortes hausses de la résolution, ils ont été plus lents à offrir des vitesses accrues d'acquisition d'image. Tridimensionnelle SIM (3D-SIM) est une technique de microscopie de fluorescence grand champ qui offre un certain nombre d'avantages par rapport à la fois simple molécule localisation et STED. La résolution est améliorée, avec des résolutions axiales et latérales typiques de 110 et 280 nm, respectivement, et la profondeur de prélèvement maximale de 30 um à partir de la lamelle couvre-objet, ce qui permet del'imagerie de cellules entières. Les récents progrès (rapide 3D-SIM) dans la technologie d'augmenter le taux d'images brutes de capture permet de capturer rapidement des processus biologiques qui se produisent en quelques secondes, tout en réduisant considérablement photo-toxicité et photoblanchiment. Nous décrivons ici l'utilisation d'un tel procédé à l'image des cellules bactériennes hébergeant la protéine marquée par fluorescence cytokinétique FtsZ à montrer comment les cellules sont analysées et le type d'information unique, que cette technique peut apporter.

Introduction

Un certain nombre de différentes technologies d'imagerie ont été utilisées au cours des années à étudier les bactéries, y compris divers électronique et des techniques de microscopie optique. Alors que la microscopie électronique offre une très haute résolution, soit une baisse de l'ordre du nanomètre, la nécessité d'un vide et l'utilisation d'agents de contraste est limitée à cette technique échantillons fixés et intégrés. Les artefacts peuvent également être introduits en raison de longue préparation de l'échantillon et un praticien expérimenté est nécessaire pour préparer les échantillons, et d'analyser et d'interpréter les images obtenues. La microscopie optique présente les avantages de simplifier la préparation des échantillons et l'application de plusieurs étiquettes avec une facilité relative par rapport à la microscopie électronique. En utilisant des protéines fluorescentes et des conjugués de colorant, la capacité d'étudier les cellules vivantes avec la microscopie de fluorescence est également possible. Avec l'amélioration de la stabilité du fluorophore et la protéine fluorescente taille / la structure conduisant à une diminution de la toxicité cellulaire, ainsi que des progrès dans la détection caméra technlogie, la microscopie de fluorescence à l'aide à champ large et systèmes d'imagerie confocale a considérablement élargi notre compréhension de la dynamique spatiale des cellules. Grâce à ces techniques, notre connaissance de la cellule bactérienne au cours des 20 dernières années a beaucoup progressé à une vue beaucoup plus détaillée qui révèle un niveau élevé de l'organisation structurelle et de protéines dans la cellule bactérienne ^1.

Cependant, les méthodes classiques de la microscopie optique de diffraction sont limitées, ce qui signifie que la résolution intrinsèque est d'environ la moitié de la longueur d'onde de la lumière d'excitation utilisée. Par conséquent, même avec le système le plus optimal en microscopie optique conventionnelle, la meilleure résolution latérale est d'environ 220 à 250 nm et la résolution axiale est d'environ 500 nm (pour une revue voir Schermelleh et al. ^2). Pour les biologistes cellulaires bactériennes, en particulier, ce qui limite encore fortement notre compréhension de l'organisation spatiale de ces cellules minuscules; étant seulement 1-2 pm de diamètremètre et 1-10 mm de longueur. Il ya aussi la nécessité pour les techniques de haute résolution qui peuvent être effectuées sur des cellules vivantes où le comportement dynamique spatiale d'une protéine peut être analysé afin de compléter les données in vitro.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs techniques d'imagerie par fluorescence super-résolution ont été développés. Super-résolution microscopie décrit les techniques d'imagerie qui au moins le double de la résolution latérale obtenue par microscopie optique conventionnelle, permettant ainsi de surmonter la barrière de diffraction. Ces techniques de manipuler l'éclairage et / ou l'analyse de la lumière émise de créer de réelles augmentations de la résolution apparente. Il existe actuellement trois grands types de techniques de super-résolution - i) l'émission stimulée épuisement microscopie ³ (STED); ii) une seule molécule microscopie localisation, y compris des techniques telles que la microscopie localisation photoactivation ^4,5 (PALM), la microscopie optique de reconstruction stochastique ^{6 (STORM), STORM directe 7 (dSTORM), et l'état fondamental épuisement de molécule individuelle rendement de 8 (GDSIM); et iii) un éclairage structuré microscopie 12.09 (SIM). Techniques de localisation de molécule unique offrent les plus fortes hausses de la résolution latérale, vers le bas pour entre 10-40 nm dans des échantillons biologiques. Dans de nombreuses implémentations de simple microscopie localisation molécule, la profondeur de l'échantillonnage est limitée à l'onde évanescente et les mises en œuvre initiales de STED ont été également limitée dans la profondeur d'échantillonnage. Toutefois, des améliorations, des progrès récents, tels que l'utilisation de l'optique adaptative, l'exploitation de l'astigmatisme dans la fonction d'étalement de point à différents points focaux, la détection multi-plan et l'aide de deux objectifs de déduire la position axiale de la lumière émise ont vu à la fois axial résolution et d'échantillonnage des profondeurs à la fois molécule STED et localisation unique 13,14. taux d'acquisition de données pour STED et techniques de localisation de molécule uniquesont également relativement lent en raison du grand nombre d'images qui doivent être acquises pour la résolution maximale (jusqu'à 50 000 pour les techniques de localisation). Cette acquisition de données lente ne se prête pas à l'imagerie des échantillons vivants sans modifications personnalisées qui sont souvent assez cher. Ces deux techniques sont actuellement parfaitement adaptés pour des échantillons fixés (pour revue, voir 2,15), cependant, beaucoup de travail est fait pour remédier à cette limitation.}

Microscopie tridimensionnelle d'illumination structurée (3D-SIM) est une technique à grand champ qui améliore à la fois la résolution latérale et axiale résultant des résolutions de l'ordre de 110 et 280 nm, respectivement. La profondeur de l'échantillonnage est de 30 um à partir de la lamelle couvre-objet, ce qui permet pour l'imagerie de cellules entières. La variation de 3D-SIM développé par Sedat, Agard, et Gustaffsson sur l'optique de microscope de laboratoire (OMX) plate-forme consiste à éclairer l'échantillon avec un motif de grille connue qui est déplacé dans 15 différentspositions dans chaque plan z ^9-11. Les franges dans les effets de moiré résultant qui sont créés dans l'espace de fréquence en dehors de la région observable sont mesurés. L'information à partir de l'espace des fréquences est reconstruit calcul pour générer une image visible de super-résolution ^10,11. La vitesse relative à laquelle les premières images peuvent être acquises en utilisant cette technique permet l'imagerie des cellules vivantes. Cependant, il est important de noter que pour les processus biologiques qui se produisent sur une échelle de temps de quelques secondes, le taux des images brutes d'acquisition est encore trop lente pour capturer les changements dynamiques. Pour des séries chronologiques avec un taux de secondes de capture, l'acquisition répétée sans temps de récupération suffisant peut conduire à la phototoxicité et photoblanchiment, en particulier lors de l'imagerie en direct de petites cellules bactériennes.

Pour surmonter ces problèmes, les progrès récents pour rapide 3D-SIM (F3d-SIM) ont été développés. Nous décrivons ici un connu sous le nom OMX Blaze ¹⁶ c'était introdu à la fin de 2011, ce qui crée de la technologie de l'éclairage à motif sans l'utilisation d'un réseau physique que celui utilisé dans les systèmes antérieurs. L'utilisation d'interférence des faisceaux lumineux et de nouvelles technologies de l'obturateur permet de créer de la lumière structurée sur l'échantillon d'une façon très rapide. La vitesse d'acquisition des images a été encore améliorée avec l'introduction de scientifiques complémentaires semi-conducteurs d'oxyde de métal (sCMOS) caméras, surtout lorsqu'on les compare aux caméras EMCCD existants. Ces changements ont donné lieu à un taux d'acquisition d'image possible d'une image par seconde pour une profondeur de 1 um (512 x 512 pixels, 9 z tranches) échantillonnage, permettant le suivi des changements dynamiques dans les cellules qui se produisent en quelques secondes ^16. La diminution de l'exposition (excitation) fois apparents aux cellules en utilisant cette méthode permet de navigateur série de temps prolongée pour être capturée ou une augmentation du taux de captage direct.

Ici, nous décrivons l'application de la microscopie F3d-SIM pour examine la structure et le mouvement dynamique de l'anneau cytokinétique Z dans les cellules de deux espèces bactériennes: l'organisme modèle Bacillus subtilis en forme de tige et l'agent pathogène humain cocciforme Staphylococcus aureus. FtsZ est une protéine du cytosquelette tubuline qui joue un rôle clé dans la division cellulaire chez les bactéries ^17,18. Il se localise sur le site de division de recruter au moins 20 autres protéines de la division, en formant le dispositif de division ^17,18, et est censé fournir la force de constriction des cellules ^19-23. Ce procédé révèle que FtsZ est distribué de façon hétérogène dans le cycle de Z dans les deux organismes dans un agencement en forme de bourrelet; résoudre le problème de longue date si l'anneau Z est une bande continue et uniforme autour de la cellule, comme visualisé par microscopie de fluorescence à champ large classique, ou une structure discontinue comme suggéré par cryo-tomographie (ECT) ^24. Nous montrons comment la capacité de la 3D-SIM peut améliorer considérablement l'examen de l'espace minuscule (1diamètre um) des cellules rondes comme S. aureus qui divisent en trois plans perpendiculaires consécutives (x, y, z). études de time-lapse en utilisant ces techniques montrent que la structure de l'anneau Z est dynamique, avec des changements de l'organisation bruts dans l'anneau, plutôt que les molécules FtsZ entrant et sortant d'un échafaudage fixe ^24.

Protocole

Préparation de l'échantillon 1

1. B. Préparation d' Les cellules subtilis pour l'imagerie
   1. Inoculer 10 ml de bouillon Penassay (PAB, également connu sous le nom d'antibiotiques Medium 3) avec une seule colonie de B. subtilis souche SU570 (168 ftsZ-GFP-spec :: trpC2 ftsZ) ^16. Développer une nuit dans une faible vitesse (100 rpm) agitateur à 30 ° C.
   2. Diluer la culture de la nuit à 0,05 A ₆₀₀ (absorbance mesurée à 600 nm) dans PAB frais à 30 ° C avec une vitesse élevée (215 tpm) secouer et se développer jusqu'à la phase mi-exponentielle (A ₆₀₀ ~ 0,4).
   3. Ajouter 2 g d'agarose électrophorèse de qualité dans 100 ml 1x milieu de croissance (PAB) dans une bouteille en verre à bouchon à vis. Dissoudre la gélose à l'autoclave. Ceci peut être stocké à 4 ° C pendant quelques mois, et au micro-ondes pour faire fondre l'agarose en cas de besoin. Laisser reposer à la température ambiante.
   4. Fixer un cadre adhésif (65 capacité de pl; voir le tableau des matériaux) sur un gla normess lame de microscope. Pour ce faire, retirez la feuille de polyester mince (chaque trame adhésive est placée entre deux feuilles de polyester, un mince et un épais, et a le centre carré enlevé) et appliquer la surface adhésive exposée du cadre à la surface de la lame de microscope. Cela crée effectivement un bien place sur le dessus de la lame. Laisser la feuille de polyester d'une épaisseur fixée sur le châssis comme cela va empêcher la lamelle de collage dans les étapes ultérieures.
   5. Faire fondre la solution d'agarose dans un four micro-ondes jusqu'à l'ébullition et la pipette 67 ul dans le cadre de l'adhésif. Immédiatement placer une lamelle sur le dessus pour créer une surface plane et le laisser à température ambiante pendant 5-10 min. Retirer la lamelle pendant 1-2 min tandis que l'échantillon est récolté.
   6. Récolter une aliquote de 1 ml de l'échantillon et centrifuger à 5900 g pendant 30 s. Décanter le surnageant et remettre le culot dans 200 ul frais PAB.
   7. Prendre 2,5 ml de l'échantillon concentré et pipette sur une pré-prépapad agarose rouge. Étaler uniformément l'échantillon le long de la surface plane de la plaquette d'agarose. Retirez le cadre de l'adhésif de la lame de microscope en utilisant des pinces sans toucher le coussin d'agarose.
   8. Transférer le bloc d'agarose à partir de la lame de microscope pour une boîte de 35 mm de diamètre de Pétri avec un fond de la lamelle de verre. Inverser le tampon d'agarose de telle sorte que la suspension de cellules et la lamelle de la boîte de Pétri sont en contact direct les uns avec les autres. Le fond de la boîte de Petri a un indice de réfraction de 1,525 pour l'imagerie haute résolution.
2. Préparation de Live S. Les cellules aureus pour l'imagerie
   1. Inoculer 10 ml de bouillon L avec une seule colonie de S. aureus souche SA94 (SH1000 contenant charrue FtsZ-GFP et pGL485; Erm ^{r, r} cm) ^25. Croître pendant une nuit à basse vitesse (100 tours par minute) du secoueur rotatif à 37 ° C.
   2. Diluer la culture de la nuit à ₆₀₀ 0,05 A (absorbance mesurée à 600 nm) dans du bouillon L frais avec 0,05 mM d'IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) pour induire la production de la protéine de fusion.
   3. Incuber à 37 ° C à haute vitesse (215 rpm) à trembler et se développer jusqu'à la phase de mi-exponentielle (A ₆₀₀ ~ 0,4).
   4. Suivez les étapes 1.1.3 - 1.1.8 comme décrit pour B. subtilis préparation des cellules vivantes.
      Remarque: Ajouter la concentration appropriée de l'inducteur à la solution d'agarose à l'étape 1.1.3 pour les souches qui expriment une protéine de fusion fluorescente sous contrôle inductible.

2 Préparation du microscope

Cette méthode utilise un DeltaVision OMX (microscope optique, expérimental) 3D-SIM système d'imagerie équipé d'un module Blaze. Pour les essais décrits, un seul laser et une caméra sont utilisés. L'éclairage et le chemin de lumière sont décrites dans la figure 1. Cette méthode suppose que le microscope a calibrage approprié, la fonction de transfert optique (FTO)fichiers et l'entretien de collimation de la lumière effectués.

1. Pour vivants des expériences d'imagerie cellulaire, assurez-vous que l'étape de chauffage est fixé au stade céramique et le collier objectif de chauffage est fixé à l'objectif (60X 1,42 NA objectif de l'huile).
2. Tourner sur les objectifs et la scène de chauffage d'au moins 4 heures avant de l'imagerie et de la rampe lentement la température à la position désirée à un taux maximum de 5 ° C / h. Il est recommandé de commencer ce processus, le soir avant de l'imagerie et de la rampe à 3 ° C / 4 h. Pour les expériences de cellules vivantes avec B. subtilis, la plupart des expériences sont effectuées à 30 ° C. Pour S. aureus, toutes les expériences sont effectuées à 37 ° C.
3. Le jour de l'expérience, mettez le système sur au moins 1 heure avant de l'imagerie pour permettre au système et lasers stabilisation complète. Chargez le petit insert en scène de plat sur la scène chauffée à préchauffer.
   1. Allumez le poste de travail du contrôleur maître.
   2. Allumez le workstat de traitement d'imageion.
   3. Mettez le refroidisseur de la caméra située sur le sol à l'extérieur de l'enceinte du microscope.
   4. Allumez toutes les caméras sCMOS (même si elles ne seront pas toutes utilisées).
   5. Intérieur de l'enceinte de laser et de l'électronique, tournez sur:
      1. châssis de contrôleur de l'instrument.
      2. Châssis Nanomotion.
      3. Jena contrôleur de Z piézoélectrique.
      4. Tous les contrôleurs de moteur 4 galvanomètre.
      5. Primaire module de commande de laser.
      6. Secondaire module de commande de laser.
      7. Tous les postes de travail de la caméra.
      8. Poste de travail OMXIC.
   6. Sur le poste de contrôleur de maître, ouvrez le logiciel OMX en cliquant sur l'icône. Définissez le chemin de fichier pour l'enregistrement des données dans un dossier de données approprié.
   7. Pour initialiser le matériel, allez dans le menu Matériel, sélectionnez Matériel et cliquez sur le bouton Redémarrer matériel. Fermer la fenêtre.
   8. Lancer la Softworx software.Turn sur les lasers nécessaires pour les expériences (488 nm).
   9. Allumez l'interrupteur à clé pour le verrouillage de sécurité laser.
   10. S'assurer que le tiroir de filtre dichroïque correcte est insérée sous l'objectif. Pour la GFP, c'est l'étalon (ou fixe) tiroir.
   11. Dans OMX SF, allez dans le menu Fichier, choisissez Paramètres, puis sélectionnez le tiroir fixe dans le menu déroulant tiroir. Fermer la fenêtre.
   12. Procédez comme suit à partir de l'écran principal du logiciel, dans la section Paramètres de lumière:
       1. Activez l'appareil photo approprié pour le laser d'excitation et un filtre d'émission (FITC) caméra de la sélection du canal.
       2. Vérifiez le mode d'image est réglé sur séquentielle.
       3. Vérifiez le Chemin de Lumière est situé à SI.
       4. Vérifiez le mode est réglé à 95 MHz.
       5. Vérifiez le laser 488 est sélectionné dans l'excitation.
       6. Réglez le Taille de 512 x 512 pour la taille de la fenêtre et Binning de 1 x 1.
   13. Dans l'onglet de l'expérience, assurez-Type est défini à l'IS dans le menu déroulant.
   14. Assurez sectionnement est activé et que l'espacement de la section optique est placé à 0,125.
   15. Assurer le point de mise au point au moment où débute balayage est moyenne.

3. Image Acquisition

1. Appliquer une goutte d'huile à la partie supérieure de l'objectif. 37 ° C, l'huile de départ recommandée a un indice de réfraction de 1,518 pour correspondre au mieux l'indice de réfraction du coussin de gel utilisé pour monter les cellules bactériennes à 37 ° C (voir l'étape 1.1.3).
2. Placer le plat échantillon de Pétri contenant les cellules préparées dans l'encart de la scène et couvrir avec le couvercle de chauffage circulaire. Abaissez la scène jusqu'à ce que l'huile atteigne le fond dele plat échantillon Petri.
3. Laisser le plat à la chaleur s'équilibrer pendant 15 min dans le stade. Utilisation d'un réglage d'exposition faible de 5 ms ou moins (situé dans la section Paramètres de lumière), se concentrer sur l'échantillon en utilisant les contrôles de la scène de positionnement nanométrique (dZ, situé dans la section Nano positionnement). Concentrons de haut en bas à travers l'échantillon pour déterminer si la lumière est répartie uniformément au-dessus et en dessous du plan focal échantillon. Si la fonction d'étalement de point n'est pas encore (aberration sphérique), nettoyer le fond de la cuvette porte-échantillon et l'objectif avec du chloroforme. Changer l'huile et répétez cette étape jusqu'à ce qu'une correspondance n'est trouvée entre l'huile et l'indice de réfraction échantillon pour minimiser l'aberration sphérique.
4. Utilisation de 0,5 um dZ tailles de pas, marquer le haut et le bas de la pile d'images. Retour à la moyenne de l'échantillon. Cliquez sur le bouton Obtenir épaisseur dans l'onglet de l'expérience pour définir l'épaisseur de l'acquisition de l'échantillon. Keep la hauteur de la pile à un minimum tout en veillant à ne pas couper le haut et le bas des Z-anneaux. Les épaisseurs typiques pour B. les échantillons sont subtilis 2-3 um.
5. Déterminer la valeur maximale de l'intensité (Max) de l'image de l'échantillon avec les réglages d'exposition et T% actuels. Cette valeur se trouve en dessous de la fenêtre d'image. Pour l'imagerie time-lapse, ajuster l'exposition et% T pour obtenir une intensité maximale de 1,100-1,400 fond au-dessus de l'image. Un minimum d'intensité de fond au-dessus de 1000 est requise pour obtenir une reconstruction d'image. Pour une image unique, augmenter l'intensité maximale pour 4000-5000.
6. Activez la section Time-lapse dans l'onglet de l'expérience. Réglez le taux de trame requise et le temps total. Dans un fichier de données, entrez un nom de fichier approprié. Cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l'acquisition d'image.
   Remarque: L'acquisition des images est terminé lorsque le gbar reen Progrès est terminé et un fichier journal apparaît pour l'ensemble du dossier de données appropriée des données.

4 Vérification de la qualité des données

1. Au début de l'acquisition de l'image, noter la valeur d'intensité maximum de l'image au début de l'acquisition de l'image de la première trame de la série chronologique. A la fin de l'acquisition de la première image, vérifier qu'il n'y a pas eu une baisse de plus de 10% de l'intensité du signal à travers le z-stack pour cette première image. S'il n'y a plus de ce niveau de photoblanchiment dans le premier point de temps, les données à travers les séries chronologiques seront de qualité insuffisante pour l'analyse et l'acquisition de séries temporelles peuvent être arrêtés.
2. A la fin de l'acquisition de la série de temps, ouvrir le fichier image brute résultante avec .dv suffixe et de vérifier la diminution de l'intensité de signal maximum depuis le début de la série temporelle de l'image finale. Jeter les points dans le temps où il a abeillen plus de 30% photoblanchiment.

5. images Reconstruction 3D-SIM

1. Dans le menu Processus, activer la fenêtre SI reconstruction. Utilisez les paramètres pré-existantes pour tous les paramètres.
2. Activez le bouton Utiliser la Manche de la FTO spécifique, et vers le jeu de filtre standard. Activez l'utilisation spécifique du canal KO angles bouton et sélectionnez le jeu de filtre standard.
3. Faites glisser et déposez le (.dv) fichier brut dans l'espace du fichier d'entrée. Cliquez sur Créer. Le fichier de sortie aura le même nom que le fichier d'entrée avec _SI ajouté à la fin.
   Remarque: Ce processus de reconstruction peut être exécuté comme une tâche en utilisant la fonction Générateur de tâches dans le menu du processus si plusieurs fichiers doivent être traitées.

6. exportation et l'analyse des données

1. Utilisez Imaris de visualiser des images en 3D en mode et ex dépasserdonnées d'image portuaires comme tiff (300 dpi) ou des fichiers avi (pas de compression). mesures de taille dans Imaris peuvent être effectuées à l'aide de l'outil de mesure en mode surpasser.
2. Génération parcelles d'intensité 3D de l'anneau Z de 3D-SIM données d'image:
   1. Examiner la répartition des FtsZ autour de l'anneau de Z et de créer des tracés d'intensité 3D
      1. Ouvrir un fichier d'image 3D pour afficher les z-tranches individuelles. Utilisez l'outil volume de téléspectateur, situé sous l'onglet Affichage du menu pour recadrer une région d'intérêt.
      2. Entrez le numéro de la fenêtre pour cette image 3D dans la fenêtre de saisie et entrer un nouveau et inutilisé nombre de fenêtre dans la fenêtre de sortie. Le bouton de sélection région deviendra disponible pour la culture d'un anneau Z individu d'intérêt de l'original 40 x 40 um champ de vision.
      3. Ajuster l'axe désiré et du degré de rotation de la patte de rotation. Cliquez sur le bouton Exécuter. Faites défiler le volume pour obtenir le point de vue désiré de l'anneau Z.
      4. Utilisez l'outil Inspecteur de données et d'ajuster til les dimensions de colonnes / lignes pour créer une nouvelle région d'intérêt autour d'un cycle individuel Z. Cliquer sur le centre de l'image à la position de cette nouvelle région d'intérêt. Les données d'image de texte est généré automatiquement un tableau qui montre l'intensité de fluorescence de chaque pixel à l'intérieur de la région d'intérêt.
      5. Cliquez sur le bouton 3D graphique pour afficher d'abord le tracé de l'intensité.
      6. Alternativement, les données d'image de texte peuvent être exportés en cliquant sur le bouton de sauvegarde de données de tableau dans le menu fichier.
      7. Copiez les données d'image à partir du fichier texte enregistré dans une nouvelle feuille de calcul. Sélectionnez toutes les cellules dans la feuille de calcul et de créer un nouveau graphique 3D-Surface. Formater la 3D graphique de terrain de l'intensité de la publication.
   2. Pour la lecture répétée de données time-lapse étapes 6.2.1.1 - 6.2.1.7 sur chacun des différents points dans le temps à partir du fichier d'image 3D.
3. Suivi Intensité de fluorescence moyenne au fil du temps
   1. Utilisez les données d'image de texte pour suivre les fluorescenCE intensité au fil du temps dans une région d'intérêt.
   2. Sélectionner les cellules qui correspondent à la région d'intérêt.
   3. Calculer l'intensité de fluorescence moyenne à chaque point de temps pour cette région d'intérêt.
   4. Utilisez les valeurs moyennes d'intensité de fluorescence pour générer un graphique distinct.

Résultats

Dans cette étude, nous avons visualisé la protéine bactérienne de la division cellulaire FtsZ, exprimé dans les cellules vivantes comme une fusion de FtsZ-GFP, pour illustrer les avantages puissants de F3d-SIM sur la microscopie à fluorescence conventionnelle pour l'étude de la localisation et de la dynamique des protéines bactériennes. FtsZ est une protéine du cytosquelette tubuline qui polymérise en une structure en anneau dynamique autour de la circonférence de la cellule. L'anneau Z a un rôle important dans la division cellulaire: son assemblée marque l'emplacement futur de la division, il recrute toutes les protéines de la division cellulaire de ce site, et l'anneau Z constriction apparaît pour fournir la force pour permettre déplacement vers l'intérieur de l'enveloppe cellulaire au cours de la cytokinèse ^{17 , 18.}

Lorsque visualisée par microscopie par fluorescence classique à grand champ, le cycle Z apparaît sous la forme d'une seule bande transversale de fluorescence dans des bactéries en forme de bâtonnets, y compris les plus étudiés et les organismes tels que B. subtilis (figure 2A), E. coli et C. crescentus. Fait important, l'intensité de fluorescence tout au long de cette bande semble être plus ou moins uniforme, et le motif de localisation offre très peu d'informations sur l'organisation structurale et la distribution des polymères FtsZ à l'intérieur de l'anneau Z. Lorsque ces mêmes cellules sont examinés en utilisant la méthode F3D-SIM décrite ici (figure 2B), cependant, les avantages de cette technique sont immédiatement apparents. En premier lieu, la rotation de l'image 3D-SIM autour de l'axe z permet la visualisation de l'anneau de Z comme une véritable structure cyclique dans un espace tridimensionnel (figures 2C et 3A). Avec l'augmentation de la résolution, ce qui révèle la distribution de FtsZ dans le cycle Z est en fait très hétérogène (figure 3). L'amélioration de la résolution nous permet aussi de voir Z anneaux qui ont commencé le processus de constriction pour former un septum de division (indiqué par l'invagination de la membrane cellulaire dans Figure 2C et 2D).

D'autres exemples de B. subtilis anneaux Z visualisées par cette technique sont représentées sur la figure 3BI - 3Biv et illustrent la façon dont l'intensité de fluorescence dans le noyau Z n'est jamais la même. En outre, les régions de très faible intensité de fluorescence sont souvent observés. Nous nous référons à ces régions que les lacunes (flèches blanches). Nous observons ces lacunes dans 15% de tous les anneaux Z examinés (n = 84) et principalement dans Z anneaux ayant un diamètre de 800 à 900 nm (93%). Pour quantifier ces observations, les parcelles d'intensité 3D ont été créés de l'anneau Z et sont présentés dans la figure 3Ci et 3CII en utilisant les anneaux Z représentées dans les figures 3Biii et 3Biv. Les courbes d'intensité montrent que généralement la quantité de fluorescence dans le noyau de Z peut varier de 3 à 4 fois dans différentes régions du B. subtilis Z anneau. En outre, les parcelles d'intensité 3D montrent que la gaps de fluorescence à l'intérieur de l'anneau Z presque lire les niveaux de référence de la fluorescence de fond (flèche noire sur la figure 3Ci). Ces exemples ci-dessus illustrent bien les reconstructions de l'anneau de Z et dépendent de la lumière suffisante étant émis à partir de l'échantillon sans photoblanchiment significatif. Ceci est accompli grâce à la luminosité du fluorophore de la GFP fusionnée à FtsZ et son abondance dans la cellule dans ces conditions (rapport signal à bruit). En d'autres cellules dans lesquelles le rapport signal sur bruit est faible, la reconstruction de l'image est faible. Pour simuler cette occurrence avec FtsZ-GFP, la quantité de signal d'émission collectée à partir du B. cellules subtilis a été réduite en réduisant l'énergie d'excitation. Comme le montre la figure 3D une réduction d'un facteur 100 des résultats de l'énergie d'excitation dans une image de l'anneau Z-qui a des artefacts significatifs. Cela se produit comme une conséquence de contraste local insuffisant entre le signal FtsZ-GFP et du contexte qui a conduit à poor reconstruction de l'image.

Il est intéressant de B. subtilis anneaux Z ont montré écarts plus prononcés et une hétérogénéité dans les régions supérieure et inférieure de l'anneau, mais pas dans les côtés de l'anneau (figure 3B). Ceci se produit en raison de la différence de résolution atteint par cette variation de 3D-SIM dans le plan latéral par rapport au plan axial. Il en résulte dans les régions supérieure et inférieure de l'anneau de Z (plan latéral) étant imprimées avec une résolution optimale. Les lacunes dans l'anneau Z sont trop petits pour être détectés dans les côtés de l'anneau de Z comme visualisé dans le plan axial, qui a environ la moitié de la résolution de la surface latérale. Les bactéries qui ont une morphologie cocciforme, telles que S. aureus, ont des anneaux Z qui sont positionnés dans tous les plans. Donc, l'imagerie de la bague de Z quand il se trouve dans le plan latéral (ou presque) offre la possibilité à l'image de toutes les régions de l'anneau avec une résolution optimale. Profitant de cela, nous avons examiné la structure del'anneau Z en direct S. cellules aureus, en utilisant une souche qui contient un plasmide portant une fusion de ftsZ-GFP. La production de cette fusion est sous le contrôle d'un promoteur inductible de P _spac (voir l'étape 1.2.1). Lorsque imagé avec, dans le plan axial, S. aureus anneaux Z sont apparues identiques à B. subtilis anneaux de Z qui sont présents dans le même plan (figure 4AI). Cependant, l'imagerie Z anneaux dans le plan latéral confirmé que le cycle Z est apparu à la fois l'ensemble de bourrelet et hétérogène. Environ 26% de ces anneaux a également montré au moins une «lacune» visible de fluorescence (Figure 4Aii, 4B). Similaires à B. subtilis FtsZ, parcelles d'intensité de fluorescence montrent que l'intensité de la fluorescence dans l'anneau Z varie autant que 4-6 fois dans différents domaines de la S. aureus Z anneau (figure 4C).

La longueur et la largeur des bourrelets peuvent être mesurés (reportez-vous au schéma de la figure 4D). Ceci a montré que 80% des noyaux Z (n = 43) qui ont été examinés avaient une longueur de talon de 200 nm, pour atteindre une longueur maximale de 400 nm. La largeur de billes, d'autre part, mesurée à 200 nm. Il y avait en moyenne 12 ± 2 (SEM) perles de FtsZ par anneau Z. Des données similaires de localisation a été observée lorsque FtsZ natif a été visualisée avec ces méthodes en utilisant la microscopie d'immunofluorescence (IFM) montrent que ce modèle de localisation hétérogène et bourrelet était authentique et pas un artefact causé par l'expression de ftsZ-GFP en plus natif FtsZ (données non représenté). Cet avancement de 3D-SIM est en mesure de montrer que l'anneau de Z apparaît comme une structure hétérogène et est peut-être de nature discontinue.

Pour répondre à la question de savoir comment cette structure Z-anneau hétérogène subit constriction et facilite la division cellulaire, une analyse time-lapse de la dynamique des anneaux Z peut être effectuée. L'un des principaux défisétudes temps-lapse microscopie de fluorescence est dans la minimisation de photoblanchiment de l'échantillon et la phototoxicité lors de l'imagerie. 3D-SIM nécessite un grand nombre d'images brutes pour obtenir ce qui signifie que le photoblanchiment de l'échantillon au cours du temps se traduira par un rapport signal sur bruit médiocre conduisant à signal insuffisant pour permettre à des reconstructions d'images appropriées. L'application de la nouvelle technologie de minimiser la quantité d'énergie d'excitation utilisée pour chaque exposition, et donc une diminution de l'énergie d'entrer dans les cellules vivantes. Elle le fait en une combinaison de l'interférométrie de faisceau lumineux pour créer le motif structuré sur l'échantillon et l'utilisation de caméras CMOS scientifiques qui augmentent la sensibilité et le rendement quantique. Cette combinaison résulte en l'acquisition z-stack de 1 pm par seconde (512 × 512 pixels x 8 z tranches), comparativement à 1 um par 5-8 sec (512 x 512 pixels x 8 z tranches) obtenu avec notre itération précédente de 3D-SIM (décrit dans Riglar et al. ^26).Réduire le temps d'acquisition d'image et des réglages d'exposition peut également aider à réduire la phototoxicité de cellules vivantes qui est particulièrement importante dans les études time-lapse. La nouvelle technologie présentée ici aborde également un autre problème dans l'imagerie des cellules vivantes que nous appelons «flou de mouvement», qui dans ce contexte se réfère à la localisation des protéines évolution lors de l'acquisition de l'image. En diminuant le temps d'acquisition de l'image de la quantité de «flou de mouvement» est minimisée crée ainsi une reconstruction d'image plus précis.

Des études antérieures qui ont examiné la façon dont FtsZ est organisé dans le cycle Z n'ont pas été en mesure de montrer comment la structure de l'anneau Z change au fil du temps. Pour étudier cet aspect nous avons effectué time-lapse en utilisant F3d-SIM. Cette acquisition a permis d'une image 3D-SIM de l'anneau de Z à B. subtilis chaque 5-10 secondes sur une période de 50 secondes, ce qui n'était pas possible sur cette échelle de temps. Le montre la figure 5A est une example des changements rapides dans la distribution FtsZ dans l'anneau Z au fil du temps (diamètre de 890 nm). Autres anneaux Z qui étaient visiblement dans le processus de constriction ont également été montré pour avoir des dynamiques similaires qui ont affecté la distribution de FtsZ autour de l'anneau Z (non représenté). Parcelles d'intensité 3D peuvent également être générés pour chacun des points de temps à quantifier et apprécier les changements d'intensité de fluorescence continuelles et l'abondance donc relative de FtsZ dans les différentes régions de l'anneau Z sur une échelle de temps de quelques secondes (figure 5B). Régions d'intérêt peuvent être identifiés à partir de ces parcelles d'intensité de suivre les fluctuations de l'intensité de fluorescence (figure 5C). Le suivi de ces changements dans la structure de l'anneau Z dans ces conditions serait pratiquement impossible sans la technologie F3d-SIM de pointe. En outre, ce travail a révélé que dans S. aureus le mouvement dynamique de FtsZ est similaire à celle observée chez B. subtilis. S. cellules aureus RN4220 producing FtsZ-GFP a été visualisé 50 sec à 10 intervalles de temps sec. Les modifications apportées à l'hétérogénéité de l'anneau Z dans S. aureus F3d-SIM était également similaire à B. subtilis (voir flèches et des flèches dans la figure 6). Ces études de time lapse soutiennent un modèle de l'anneau de constriction Z (le modèle de pincement itératif) qui a été prédit par l'examen de C. fixe cellules crescentus, mais ne pouvaient pas être mises en évidence en raison de la nécessité d'examiner la dynamique Z-ring dans des cellules vivantes ^27.

Figure 1: Représentation schématique de la configuration optique de la F3d-SIM utilisé dans cette lumière laser à partir de la table de laser étude. Est dirigé à travers une fibre de SIM pour une lentille de collimation et fixé grille, puis dans le module de commande de phase qui crée à la fois la longueur d'onde spécifique optimale espacement of les poutres ± 1 ^er ordre de la poutre centrale d'ordre zéro et les étapes de la phase de collecte SIM. Les faisceaux pénètrent ensuite dans le module de commande de l'angle où les faisceaux sont réfléchis vers les différents pôles 3 pour créer les trois angles d'éclairage. Les faisceaux entrent alors dans le microscope et le chemin de lumière comme le montre (mise à jour avec la permission de Paul Goodwin, API).

Figure 2: Comparaison de la fluorescence à champ large conventionnelle et l'imagerie 3D-SIM de B. les cellules exprimant subtilis ftsZ-gfp. (A) conventionnelle à grand champ imagerie de fluorescence de B. les cellules exprimant subtilis ftsZ-gfp (SU570, vert) d'une seule copie ont été également colorées avec le colorant de membrane FM4-64 (rouge). Barre d'échelle = 5 um. L'image a été acquise à l'aide d'un microscope à fluorescence verticale.(B) d'imagerie 3D-SIM du même B. souche subtilis exprimant ftsZ-gfp, colorées avec FM4-64. Régions d'intérêt de l'image peuvent être sélectionnés (zone en pointillés) pour agrandir. L'image peut également être mis en rotation autour de l'axe z pour afficher anneaux 3D FtsZ dans le plan axial. (C, D) La suppression des out-of- lumière de mise au point et une meilleure résolution d'image fournie par 3D-SIM permet une visualisation claire de Z anneaux (y compris ceux qui sont limite-) et la membrane cellulaire interne lors de la division (indiqué par les flèches blanches). A noter que le texte du protocole décrit la visualisation d'un seul fluorophore. Cependant, le procédé peut être adapté pour l'acquisition d'un maximum de quatre longueurs d'onde différentes simultanément. Ce chiffre a été tiré à part de Strauss et al ^16.

Figure 3. Des images représentatives de l'anneau de Z dans les cellules vivantes de bactéries en forme de bâtonnet (B. subtilis) exprimant la GFP en utilisant FtsZ-3D-SIM. (Ai) le cycle Z est observée comme une bande de fluorescence perpendiculaire à l'axe longitudinal de la cellule qui se trouve dans le plan xy. (Aii) L'image a subi une rotation autour de l'axe z en utilisant un logiciel de visualisation Imaris 3D (voir protocole l'étape 6.1), de sorte que l'on regarde à travers la structure de l'anneau de voir clairement comment FtsZ est distribué dans l'anneau Z. Cette image, en maintenant le plan zx, indique que le noyau présente une répartition hétérogène de FtsZ avec des régions de pas ou très peu de fluorescence (têtes de flèches blanches). L'image doit être tourné pour observer ces régions présentant des lacunes de fluorescence. Bi-Biv montrent d'autres exemples de bagues en Z ayant subi une rotation qui se trouvent maintenant dans le plan zx. Z anneaux (Bi-iii) ont un diamètre d'environ 0,9 um (VIB). Montre un anneau de Z avec un diamètre de onl0,65 um y subir une constriction. (Ci) de ce profil d'intensité typique 3D illustre l'intensité de fluorescence (à savoir la concentration) des différences de FtsZ-GFP dans le noyau de Z ayant un diamètre de 0,85 um (voir protocole d'étapes 6.1 à 6.3). Le niveau de fluorescence dans ces lacunes est faible et se rapproche de niveaux de fluorescence d'arrière-plan (flèche noire). (Cii) Un profil d'un anneau de Z dans le processus de rétrécissement de l'intensité 3D similaire. Concentration FtsZ-GFP est également non-uniforme; de diamètre, 0,65 um. Panneaux A, B, CI et CII ont été tiré à part de Strauss et al ^16.

Figure 4 images représentant 3D-SIM de S. cellules aureus produisant FtsZ-GFP. Comme ces cellules sont rondes (coques), l'anneau de Z VHAe diverses orientations. Les cellules qui présentent une bande de fluorescence dans l'orientation d'affichage normal (c'est-à-dire dans le plan xy) comme indiqué dans (Ai), sont très similaires à celles des cellules en forme de tige lors de la rotation autour de l'axe Z, comme pour la figure 1AI. En (Aii) le cycle Z est déjà dans le plan xy; orientation latérale et la résolution est maximal sur la totalité de l'anneau qui donne maintenant une structure en forme de bourrelet (B). (C) Une parcelle d'intensité 3D de l'abondance relative de FtsZ-GFP dans l'anneau Z. (D) Représentation schématique de la S . aureus Z anneau. Les flèches rouges indiquent la longueur du cordon et la largeur (voir le protocole de l'étape 6.1). Ce chiffre a été modifié depuis Strauss et al ^16.

Figure 5 F3d-SIM permet une analyse rapide de FtsZ localisation au fil du temps en 3D-SIM. (A) Changements dans la distribution FtsZ-GFP dans l'anneau Z en forme de tige B. subtilis cellules peuvent être visualisées à indiquer la dynamique de l'anneau. Temps (sec) est indiqué dans le coin supérieur gauche de chaque image. (B) parcelles d'intensité de fluorescence 3D montrent la non-distribution uniforme et dynamique de FtsZ dans l'anneau Z. (C) la dynamique de FtsZ (fluorescence changements FtsZ-GFP dans le anneau) peut également être examinée plus en détail par la quantification de l'intensité de fluorescence au cours du temps dans deux régions d'intérêt. Ce chiffre a été tiré à part de Strauss et al ^16.

Figure 6 F3d-SIM images en accéléré montrent des changements dans FtsZ localisation au sein de la bague au fil du temps en S. unuréus. Une flèche blanche indique un écart quand il est d'abord détecté dans l'anneau Z. L'apparition et la disparition de lacunes dans la même position (indiqué par la flèche blanche) au cours du temps montre comment FtsZ est redistribué vers le Z-anneau. Les flèches blanches indiquent la formation de lacunes dans l'anneau Z des points de temps plus tard. Temps (s) est affiché sur le côté supérieur gauche de l'image. Ce chiffre a été modifié depuis Strauss et al ^16.

Discussion

Imagerie des cellules vivantes fluorescent est un outil puissant qui permet l'observation de changements dynamiques dans les cellules au cours du temps. Imagerie en temps réel de la biologie de la cellule bactérienne a été difficile en raison de la petite taille de cellule et la capacité des cellules bactériennes pour résister à une exposition répétée à la lumière d'excitation réduite. F3d-SIM a élargi les outils disponibles pour interroger toute la biologie cellulaire, mais il est nécessaire d'effectuer attentivement cette technique comme des artefacts peuvent être introduites si elles sont mal mises en œuvre. Il ya un certain nombre de considérations importantes pour la bonne utilisation de cette technique. Comme il s'agit d'une méthode d'imagerie de fluorescence à champ large qui repose sur l'utilisation de la fonction d'étalement de point de lumière émis l', l'indice de réfraction inadéquation et l'aberration sphérique de la lumière émise doit être évité afin de permettre la reconstruction d'image précise. L'utilisation de lamelles de 0,17 mm d'épaisseur d'une haute qualité pour éviter les variations de l'intensité du signal en raison de la variabilité de l'épaisseur du verre les couvertureslèvre est fortement recommandé. Il est extrêmement important d'évaluer soigneusement l'aberration sphérique de la lumière émise pendant les étapes initiales de toutes les expériences et ajuster l'immersion indice de réfraction de l'huile au besoin. Cela peut varier de jour en jour car il dépend à la fois la température et le milieu de montage / substrat de l'échantillon. L'utilisation de l'huile incorrect entraînera inférieur reconstruction des images avec des artefacts, tels que des halos et des signaux d'écho.

A la fin du processus de reconstruction d'image, pour chaque phase, une mesure de la qualité de la reconstruction peut être obtenue par le "meilleur ajustement pour l'angle kO" pour chaque phase / angle de l'illumination. Si cette valeur est inférieure à 1 pour chaque angle, la qualité de la reconstruction sera probablement élevé. Si cette valeur est supérieure à 6, il est plus probable que l'image reconstruite contiendra des artefacts. Artefacts communs comprennent i) l'apparition de bandes dans l'image qui correspondà l'un des angles de la grille. Cela peut entraîner à partir du signal de plus faible que l'angle de la grille; ii) nimbe autour de structures. Cela peut résulter de niveaux très inégaux de signaux de structures lumineuses par rapport aux structures environnantes, un décalage de l'indice de réfraction de l'huile et de l'échantillon ou peut être due à des structures dans l'image de trop amorphe et ne contenant pas assez de «structure» d'être reconnu par l'algorithme; iii) «rayon de miel» qui résulte d'un faible rapport signal bruit dans l'image, généralement due à un signal de fond élevé; iv) les structures qui sont étirées / allongés dans xy qui peuvent être dues à indice de réfraction non-concordance de l'huile et de l'échantillon. Cet artefact est difficile de discerner pour un utilisateur inexpérimenté. Il est recommandé que les nouveaux utilisateurs consultent un chercheur expérimenté SIM pour obtenir des conseils sur l'interprétation des images et l'analyse quand on commence à utiliser cette technique.

Comme avec toutes les expériences d'imagerie des cellules vivantes fluorescentes, il est l'importationant à équilibrer soigneusement l'entrée de l'énergie d'excitation afin de minimiser le degré de photoblanchiment et la phototoxicité des cellules avec signal d'émission suffisante nécessaire pour reconstruire des images avec artefact minime. Photoblanchiment excessive (supérieure à 30% sur une acquisition z-stack) aboutit à un modèle de segmentation dans l'image reconstruite. Avec l'utilisation de caméras sCMOS, images super-résolution peuvent être reconstruites avec succès à partir d'images brutes avec le signal aussi faible que 1 000 chefs-dessus du fond de l'émission. Cela peut permettre à de très courtes durées d'exposition réduisant ainsi photoblanchiment et permettant la capture rapide pour chaque trame. Il augmente également la quantité de temps entre les trames pour les cellules de se remettre de l'apport d'énergie d'excitation. En outre, comme le temps de capture pour chaque image individuelle peut être très court, le degré de l'artefact introduit par "flou de mouvement" lors d'une saisie individuelle est réduit par l'utilisation de cette méthode.

Cette variation de la 3D-SIM offre un certain nombre d'autres avantages par rapport aux autres technologies disponibles de supermarchés et l'imagerie haute résolution pour l'imagerie en direct par les biologistes cellulaires bactériennes. L'augmentation de 2 fois de la résolution dans toutes les trois dimensions et la capacité de l'image allant jusqu'à 30 um dans un échantillon permet l'imagerie de cellules bactériennes (et de mammifères) ensemble au cours d'une expérience. Des techniques telles que la localisation de molécules simples qui sont couramment effectuées dans l'onde évanescente peut pas atteindre la profondeur de pénétration dans un échantillon, et ne proposent pas de renseignements sur des cellules entières. Les progrès récents qui permettent plus élevés des profondeurs d'échantillonnage pour cette technique peut entraîner une meilleure résolution axiale de cellules entières. En outre, les techniques de localisation de molécule unique qui nécessitent des milliers d'images brutes à acquérir sont également limitées dans le taux de trame qui peut être capturé et peut exiger compromis entre le taux de trame de capture et la résolution spatiale atteint ultime, comme la résolution spatiale dépend de la nombre de veillents enregistrées dans un espace défini. La diminution du nombre d'images capturées se traduira par une résolution spatiale inférieure mais peut être suffisante pour atteindre la résolution temporelle nécessaire pour le processus biologique d'intérêt. La quantité de temps entre les trames de recouvrement peuvent aussi devoir être augmentée pour réduire au minimum la phototoxicité des cellules vivantes en limitant ainsi la durée et la fréquence à laquelle la série peut être obtenu. Des techniques à haute résolution telles que la microscopie électronique (EM) ou électronique cryotomography (ECT) qui offre une meilleure résolution sur 3D-SIM (et d'autres techniques de microscopie optique de super-résolution), mais doivent être effectuées sur des échantillons fixés. La fixation et le traitement peuvent introduire des artefacts et l'absence d'étiquetage peuvent rendre l'interprétation difficile. ECT sans étiquette manque de contraste et peut atteindre des profondeurs de pénétration de l'échantillon de l'ordre de 500-200 nm ^24, même si la protéine d'intérêt peut être identifié, la structure de la protéine dans une cellule entière bactérienne ne peut être observée.Même lorsque l'étiquetage peut être utilisé dans EM, comme avec immunologique, la formation d'image est effectué uniquement en 2D. 3D est seulement réalisable avec sectionnement mince et la reconstruction de calcul des sections. Le sectionnement mince nécessite un technicien expérimenté mais peut être problématique et conduire à l'artefact. Avec des cellules vivantes ou fixées, 3D-SIM n'a pas besoin d'être incorporé de manière spécifique et les cellules peuvent être rapidement préparés pour l'imagerie dans un état proche natif.

Cette méthode est relativement facile à mettre en œuvre par les chercheurs ayant une expérience minimale en microscopie à fluorescence. Expériences peuvent être réalisées dans les médias qui soutiennent la fonction des cellules saines tant qu'il n'a pas fluorescent ou générer excessive signal de fond. Pour les cellules bactériennes, ce qui peut permettre l'utilisation de nombreux types de complexes et des milieux minimaux ou l'utilisation de supports solides ou semi-solides à contrôler la motilité des cellules bactériennes. De nombreux biologistes qui ont déjà modifiés protéine fluorescente (FP) fusions et testé la fonctionnalité deces fusions peuvent prendre jusqu'à cette technologie rapidement sans génie et la validation de nouvelles fusions PF photo-activables. Nous avons trouvé, à titre d'observation générale, que S. aureus était plus sensible à photoblanchiment lors de l'imagerie avec des fusions de PF que B. subtilis. Grâce à nos méthodes 3D-SIM d'origine, où le motif de la grille a été généré par un réseau physique, nous n'avons pas pu réaliser une imagerie des cellules vivantes avec un certain nombre de S. fusions aureus PF. Cependant, avec cette méthode F3D-SIM de pointe, nous avons réussi à l'image de ces fusions de PF et de réaliser des séries courtes de temps pour capturer la dynamique de ces protéines marquées. C'est probablement en raison des temps d'exposition réduits nécessaires pour l'imagerie et le temps entre les cadres a augmenté pour la récupération des cellules.

OMX Blaze 3D-SIM est une technologie disponible sur le marché qui peuvent être assez facilement mis en œuvre dans un seul laboratoire ou un centre d'imagerie de base. Des précautions doivent être prises pour effectuer la technique pour éviter les artifaits en raison de la préparation des échantillons pauvres ou pauvres capture d'image. Une fois que la technique est maîtrisée, les études de la structure des protéines et de la dynamique de petits organismes tels que les bactéries peuvent être effectuées en fluorescence à une ou plusieurs couleurs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose I (qualité biotechnologique)	AMRESCO	0710-500G	Utilisé pour la construction de tampons d’agarose à 2 %. Utilisez le micro-ondes pour dissoudre l’agarose dans le milieu de croissance.
N-(3-triéthylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diéthylamino) phényl) hexatriényle) dibromure de pyridinium (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Colorant lipophile utilisé pour la coloration des membranes cellulaires.
Microtube de 1,5 ml, diplômé Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Fabriqué à partir de polypropylène homopolymère, utilisé pour récolter les cellules bactériennes avant de les placer sur des coussinets d’agarose pour la visualisation.
Base de bouillon Luria, Miller	BD	241420	Préparé selon les instructions du fabricant. Ajouter 2 % d’agarose après autoclavage.
BBL Bouillon d’essai d’antibiotique, Milieu d’antibiotique 3	BD	210932	Préparé selon les instructions du fabricant.
Cadre adhésif	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Connu sous le nom de Gene Frame avec cette société. Utilisé pour préparer des tampons d’agarose à 2 % (Dimensions : 15 x 16 mm).
Verre de protection de microscope	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 n° 1 Épaisseur
35 mm de diamètre Boîte de Pétri avec fond en verre	Instruments de précision mondiaux	FD35-100	Connu sous le nom de FluoroDish avec cette société. Plat : Ø ; 35 mm, Verre : & Oslash ; 23 mm, épaisseur du verre : 0,17 mm, non pyrogène
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Réaliser un stock de 10 mg/ml dans de l’éthanol à 95 %.
Chlorhydrate de lincomycine	Sigma  ;	L6004-5MU	Fabriquer un stock de 25 mg/ml dans de l’éthanol à 50 %.
Érythromycine	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Produire un stock de 10 mg/ml dans de l’éthanol à 95 %.
Bain d’eau à agitation orbitale/linéaire combinée	Grant scientific Instruments	OLS-200	Vitesse d’agitation utilisée pour les cultures : 215 tr/min
Spectrophotomètre UV visible	Shimadzu	UV-1601	La longueur d’onde de 600 nm a été utilisée pour mesurer la densité optique des cultures bactériennes.
Centrifugeuse	Eppendorf	5415R	Des granulés de culture bactérienne ont été obtenus en faisant tourner des cultures à croissance exponentielle à 8 000 tr/min pendant 30 secondes.
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	15502-10G	Préparer 1 M de stock et filtrer la stérilisation avant utilisation.
Logiciel softWoRx	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	version 5.0
Logiciel d’analyse de données Imaris	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	version 7.0.0	Matlab XTensions inclus
Système d’imagerie 3D-SIM DeltaVision OMX équipé d’un module Blaze.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Module Blaze monté sur
microscope à fluorescence vertical	Zeiss Axioplan 2