Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Résumé

Profilage moléculaire des cellules laser microdissection et le stroma des modèles synthétiques, de l'ingénierie tissulaire du cancer colorectal représente une approche nouvelle et manipulable à caractériser et à disséquer la biologie particulière à l'interface entre les cellules tumorales à la cellules stromales associées au cancer invasif et avant.

Résumé

Envahir le cancer colorectal (CRC), les cellules ont acquis la capacité de se libérer de leurs cellules sœurs, s'infiltrer dans le stroma, et remodeler la matrice extracellulaire (MEC). La caractérisation de la biologie de ce groupe phénotypique distincte de cellules pourrait améliorer considérablement notre compréhension des événements précoces lors de la cascade métastatique.

invasion tumorale est un processus dynamique facilitée par des interactions bidirectionnelles entre épithélium malin et le stroma de cancer associé. Afin d'examiner les réponses spécifiques des cellules au stroma tumoral interface, nous avons combiné organotypique co-culture et des techniques de micro-dissection laser.

Modèles organotypiques, dans lesquels les mandants stromales clés telles que les fibroblastes sont 3 dimentioanally co-cultivées avec des cellules épithéliales cancéreuses, sont des outils expérimentaux très manipulables qui permettent invasion et interactions stroma-cancer à étudier dans un proche-phconditions ysiological.

Microdissection laser (LMD) est une technique qui implique la dissection chirurgicale et l'extraction des différentes couches au sein du tissu tumoral, avec une précision de l'ordre du micron.

En combinant ces techniques avec le profilage génomique, transcriptomique et épigénétique nous visons à développer une compréhension plus profonde des caractéristiques moléculaires des cellules tumorales envahissantes et tissu stromal environnante, et en faisant éventuellement révéler de nouveaux biomarqueurs et des opportunités pour le développement de médicaments dans CRC.

Introduction

Co-cultures organotypiques sont des modèles à partir de tissus qui aide à la reconstruction de la micro-vivo dans la tumeur en trois dimensions en juxtaposant les cellules épithéliales malignes et les cellules stromales dans un gel de collagène contenant des composants de la matrice extracellulaire essentiels ^3.1. Principalement conçu comme une méthode de mesure de l'invasion tumorale, organotypics réduire la dépendance in vivo dans des modèles animaux, et d'éviter les défauts des autres techniques in vitro tels que des dosages Transwell, dans lequel les cellules sont forcées artificiellement d'invasion dans un état ​....

Protocole

1. Mise en place des cultures de fibroblastes primaires de coliques explants

1. Obtenir des échantillons de tissu de colon humain muqueuse normale directement à partir de la salle d'opération chirurgicale, et suspendre à 7-10 ml de PBS supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, et 0,25 pg / ml de Fungizone.
2. Dans le laboratoire, placer les échantillons au centre d'une boîte de culture de tissu de 10 cm et laver 3 fois avec du PBS / Pen-angine / Fungizone. Ne pas aspirer après le lavage final.
3. Avec des pinces stériles et scalpel, couper le tissu en petits morceaux (environ 2 mm) et placer chaque pi....

Résultats

Nous avons appliqué le procédé ci-dessus pour de multiples combinaisons de lignées cellulaires de CRC et des cellules stromales. Un exemple présenté ici est des lignées de cellules épithéliales SW480 CRC ex vivo avec des fibroblastes humains primaires du côlon. Co-cultures en 3 dimensions sont construits (figure 1), soumis à la microscopie et la microdissection par capture laser (figure 2), et analysés par microARN (miARN) profilage (figure 3) pour la comparais.......

Discussion

Nous décrivons ici un procédé pour isoler et caractériser spécifiquement les cellules tumorales qui ont acquis la capacité d'envahir le stroma associé au cancer au cours des premiers stades de la progression métastatique dans un produit d'assemblage en 3 dimensions de co-culture de cellules épithéliales et stromales.

Modèles de co-culture comprenant des cellules épithéliales CRC juxtaposés avec un stroma synthétique contenant ex vivo des fibroblastes du côlon humain ont été .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignées cellulaires du cancer colorectal - exemple présenté SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Collagène	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Membrane en nylon	Merck Millipore	VVLP01300
Grille métallique	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Laser plateforme de microdissection	Leica Microsystems Leica	AS LMD
Lames montées sur membrane	Dispositifs
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025

moléculaires