L'évaluation de la fonction vasculaire chez les patients atteints de maladie rénale chronique

Résumé

Le degré de dysfonction vasculaire et contribuer mécanismes physiologiques peut être évaluée chez les patients atteints de maladie rénale chronique par la mesure de la dilatation de l'artère brachiale médiée par le flux, la vitesse des ondes de pulsation aortique et vasculaire endothéliale expression de la protéine de la cellule.

Résumé

Les patients atteints de maladie rénale chronique (IRC) ont augmenté de façon significative le risque de maladies cardiovasculaires (MCV) par rapport à la population générale, et ce n'est que partiellement expliqué par des facteurs de risque traditionnels de MCV. Dysfonction vasculaire est un important facteur de risque de non-traditionnelle, caractérisée par un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire (le plus souvent évaluée comme douteux endothélium-dépendante dilatation [EDD]) et le raidissement des grandes artères élastiques. Bien que diverses techniques existent pour évaluer EDD et grande rigidité de l'artère élastique, les plus couramment utilisés sont la dilatation de l'artère brachiale médiée par le flux (FMD _BA) et de la vitesse des ondes de pulsation aortique (aPWV), respectivement. Ces deux mesures non invasives de la dysfonction vasculaire sont des facteurs prédictifs indépendants de futurs événements cardiovasculaires chez les patients avec et sans maladie rénale. Les patients atteints de néphropathie chronique démontrent à la fois une altération de la fièvre aphteuse _BA, et augmenté aPWV. Bien que les mécanismes exacts par lesquels le dysfonctionnement vasculaire dévePI était en CKD sont encore mal compris, augmentation du stress oxydatif et une réduction subséquente de l'oxyde nitrique (NO) de biodisponibilité sont des contributeurs importants. Modifications cellulaires dans le stress oxydatif peuvent être évaluées par la collecte de cellules endotheliales vasculaires dans la veine du pli du coude et la mesure de l'expression des protéines de marqueurs de stress oxydatif par immunofluorescence. Nous fournissons ici une discussion de ces méthodes pour mesurer la fièvre aphteuse _BA, aPWV, et l'endothélium vasculaire expression de la protéine de la cellule.

Introduction

La maladie rénale chronique (IRC) est un problème majeur de santé publique qui a atteint des proportions épidémiques, touchant ~ 11,5% de la population aux États-Unis seulement ^1. Le risque de décès d'origine cardiovasculaire ou un événement cardiovasculaire chez les patients atteints de néphropathie chronique est significativement augmentée par rapport à la population générale ^2-4. Bien que les patients atteints de néphropathie chronique présentent une prévalence élevée de facteurs de risque cardiovasculaire traditionnels, ce que explique en partie l'incidence accrue de maladies cardiovasculaires (MCV) ^5. Dysfonction vasculaire est importante non traditionnel facteur de risque cardiovasculaire obtenir une reconnaissance accrue dans le domaine de la néphrologie ^6-9.

Alors que de nombreux changements susceptibles de contribuer au développement d'un dysfonctionnement artériel, parmi ceux les plus préoccupants sont le développement de la dysfonction endothéliale vasculaire, le plus souvent évaluée comme douteux dilatation endothélium-dépendante (EDD), et la rigidification de l'rge artères élastiques ^10. Différentes techniques existent pour évaluer EDD et grande rigidité de l'artère élastique, mais les plus couramment utilisés sont la dilatation médiée par le flux l'artère brachiale fièvre aphteuse _BA et de la vitesse des ondes de pulsation aortique (aPWV), respectivement. Une autre technique couramment utilisée pour évaluer EDD est la mesure de la réponse du flux sanguin de l'avant-bras à des agents pharmacologiques tels que l'acétylcholine utilisant occlusion veineuse pléthysmographie ^11,12. Cependant, cette méthode nécessite un cathétérisme de l'artère brachiale, qui est plus invasive que la fièvre aphteuse _BA et peut être contre-indiqué chez les patients atteints de néphropathie chronique. Une autre technique pour évaluer la rigidité artérielle est de mesurer la compliance artérielle locale (l'inverse de la raideur) de l'artère carotide, même si ce n'est pas aussi largement utilisé ou validée par des critères cliniques que aPWV ^13.

Les patients atteints de néphropathie chronique démontrent à la fois une altération de la fièvre aphteuse _BA ^14-16 et augmentation de la vitesse des ondes de pulsation aortique aPWV ^13,17,18, avant même besoin de dialyse. Il est important d'un point de vue clinique, ces deux mesures non invasives de la dysfonction vasculaire sont des facteurs prédictifs indépendants de futurs événements cardiovasculaires et de mortalité tant chez les patients atteints d'IRC ^19-21, ainsi que dans d'autres populations ^22-26. Ces techniques peuvent être appliquées à l'étude de différentes populations à risque de maladies cardiovasculaires, y compris les patients atteints de néphropathie chronique.

Les mécanismes exacts par lesquels la dysfonction artérielle se développe en CKD sont encore mal compris; Toutefois, la réduction de l'oxyde nitrique (NO) biodisponibilité est un facteur critique ^27-30 et un mécanisme commun de deux EDD facultés affaiblies et l'augmentation de la rigidité artérielle ^10,31. Dans CKD, le stress oxydatif est augmenté et contribue à la réduction de la biodisponibilité du NO ^{de 32 à 34.} Le stress oxydatif est défini comme la biodisponibilité excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par rapport aux défenses antioxydantes. Stimuli physiologiques, including signalisation inflammatoire, de promouvoir des systèmes d'enzymes antioxydantes pour produire des ROS, y compris l'anion superoxyde (O ₂ ● ^-) (par exemple, l'oxydant enzyme NADPH oxydase.) ^35. La production de superoxyde conduit finalement à réduire la biodisponibilité de l'oxyde nitrique (NO).

Avec facultés affaiblies biodisponibilité du NO peut à son tour contribuer au développement de la MRC, comme la dysfonction endothéliale est un facteur prédictif indépendant de l'incident CKD ^36. Ceci est cohérent avec les données de l'animal indiquant que l'inhibition de la eNOS induit une hypertension (systémique et glomérulaire), l'ischémie glomérulaire, une glomérulosclérose, et tubulo-interstitielle blessure ^37. En effet, réduit la biodisponibilité du NO apparaît nécessaire pour le développement et la progression de la maladie rénale expérimentale qui imite la maladie humaine, suggérant un rôle clé pour la dysfonction endothéliale en CKD humain ^38,39.

Marqueurs de stress oxydatif vasculaire peuvent être évalués en vascular cellules endothéliales recueillies auprès de sujets humains de la recherche, en utilisant une technique développée à l'origine par Colombo et al. ⁴⁰ et modifié Sceaux et al ^41-43. Utilisation 2 J-fils stériles, les cellules sont prélevés dans la veine du pli du coude, récupéré, fixe, et, plus tard identifié comme étant des cellules endothéliales et analysés pour l'expression de protéines d'intérêt par immunofluorescence.

Nous fournissons ici une discussion de cette méthode qui peut être utilisée pour une) mesure la fièvre aphteuse _BA; b) mesurer aPWV; c) mesurer l'endothélium vasculaire expression de la protéine de la cellule de marqueurs de stress oxydatif. L'accent est mis sur les patients atteints de néphropathie chronique, ne nécessitant pas de dialyse chronique.

Protocole

Ce protocole est conforme aux directives de la Multiple Institutional Review Board Colorado (COMIRB).

1. Préparation pour la vérification session

1. Les participants doivent suivre ces restrictions pour des mesures plus précises: 12 h rapide de la nourriture et de la caféine, 12 h retenue de l'exercice, 12 h retenue de fumer, le cas échéant,> 4 demi-vie retenue de médicaments si possible (peut ne pas être réalisable dans un population tels que les patients CKD), et les femmes en pré-ménopause doivent être testés en jours 1-7 du cycle menstruel afin de minimiser les influences hormonales.
2. Préparer 500 ml du tampon de dissociation par addition de 2 ml de 0,5 M d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), 0,05 g d'héparine (180 unités USP / mg), et de 2,5 g d'albumine de sérum bovin à 476,8 ml de tampon phosphate salin (PBS) à pH de 7,4. Ceci peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois.
3. Tourner à l'échographie, l'ordinateur et l'hémodynamique non invasiveWorkstation (NIHem; équipement de la rigidité artérielle). Branchez les câbles délivrant des ultrasons à la boîte de déclenchement de l'onde R ordinateur.

2. Collecte et traitement des cellules endothéliales vasculaires

1. Une infirmière ou un médecin qualifié effectue la collecte (étapes 2.2 à 2.5, 2.7) et un chercheur recueille et traite les fils (étapes 2.6, 2.8 à 2.19)
2. Prep le site du coude avec un antiseptique topique, appliquer un garrot, localiser veine, et Cathétériser avec un 18 G cathéter. Placer un adaptateur heplock sur l'extrémité de la IV.
3. Mettez des gants stériles et de mettre des rideaux fenêtrées stériles sur le site.
4. Placez 2 J-fils sur les rideaux. Tirez l'arc du "J" pour dérouler la forme de "J" de deux fils.
5. Déboucher le heplock et nourrir J-fil dans la veine d'environ 8 cm. Repoussez-et-vient à plusieurs reprises avant de retirer le fil. Évitez sang brut sur le fil.
6. Utilisez un coupe-fil pour couper les fils pour qu'ils s'insèrent dans unTube conique de 50 ml contenant ~ 30 ml de tampon de dissociation
7. Répétez l'étape 2.5 pour deuxième fil.
8. Répétez l'étape 2.6 pour la deuxième fil. Tube de revenir à laboratoire humide.
9. Serrer les fils d'une paire de pinces et de maintenir les fils à l'intérieur du tube, mais au-dessus de la solution. Pour 10 min, utiliser un pipetage motorisé de recueillir plusieurs reprises le tampon de dissociation de la 50 ml tube conique et le relâcher pour qu'il fonctionne sur toute la longueur des fils de rincer et faire vibrer les fils, puis secouer l'excès de liquide de fils dans le tube.
10. Centrifuger pendant 7 min à 400 g et 4 ° C.
11. Préparer la solution de formaldéhyde dans le tube de feuille couverte en combinant 100 ml de solution de formaldéhyde + 900 ml PBS.
12. Retirer lentement le tube de la centrifugeuse, tourner sur la pompe à vide, placez un embout de pipette sur la fin de tuyau d'aspiration et de laisser ~ 400 ml dans le tube, passer l'aspirateur hors le reste sans perturber le culot.
13. Couvrir de papier aluminium et pipette solution de formaldéhyde de 1 ml dansle tube pour fixer l'échantillon. Ne pas remettre en suspension. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
14. Préparez 8 diapositives par un marquage avec l'objet et de l'information de la visite d'étude et l'élaboration d'un ovale sur chaque diapositive avec un stylo pap.
15. Ajouter 15 ml de PBS, remettre les, et centrifuger pendant 5 min à 400 g et 4 ° C.
16. Répétez l'étape 2.15, ajouter 12 ml de PBS, remettre les, et centrifuger pendant 6 min à 400 g et 4 ° C.
17. Retirer lentement le tube de la centrifugeuse, tourner sur la pompe à vide, placez un embout de pipette sur la fin de tuyau d'aspiration et de laisser ~ 2 ml dans le tube, passer l'aspirateur hors le reste sans perturber le culot.
18. Remettre en suspension et pipette de manière uniforme sur les 8 lames dans les zones ovales.
19. Place dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 heures puis conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse (échantillons seront bien depuis de nombreuses années).

3. Évaluation de la fièvre aphteuse _BA et aPWV

1. Avoir un sujet de recherche changement en short jetables et ont him / son mensonge couchée dans une pièce calme, sombre climat contrôlé.
2. Placer le nombre approprié de l'ECG pour l'échographie spécifique et le dispositif de la rigidité artérielle (cette procédure utilise l'hémodynamique non invasive Workstation [NIHem] pour mesurer la rigidité artérielle, ce qui nécessite 4 électrodes), et le brassard de pression artérielle sur le sujet.
3. Après 20 min, commencer des lectures de pression artérielle. Effectuer au moins 3, et répéter jusqu'à ce que les mesures sont à moins de 5 mmHg, au repos 2 min entre chaque lecture.
4. Commencer la tonométrie par la palpation de l'impulsion de l'artère brachiale et de placer le tonomètre d'enregistrer les formes d'onde brachial utilisant le programme de logiciel.
5. Répétez l'opération pour les artères radiales, fémorales et carotides.
6. Mesurer la distance de chacun de ces sites de l'encoche supersternal l'aide d'un ruban à mesurer (brachiale, radiale et la carotide) et de la règle de mesure / étrier (fémorale).
7. Calculer carotide-brachiale, radiale-carotidienne et la carotide-fémorale (aPWV) en utilisant le programme logiciel.
8. Lieusang de l'avant-bras la pression du brassard juste en aval de l'olécrâne et enregistrer au moins 10 cycles cardiaques de base artère brachiale images échographiques et des mesures de vitesse d'écoulement du sang, avec un logiciel vasculaire mis en mode déclencher. Un bras mécanique peut être utilisé pour stabiliser la sonde à ultrasons, si désiré.
9. Gonflez avant-bras brassard de pression artérielle à 250 mmHg et commencer minuterie. Demandez participant à rester immobile.
10. Commencez vitesses d'enregistrement avec un ensemble de logiciels vasculaire en mode déclencher lorsque la minuterie lit 04h45. Trigger libérer le brassard à 05h00 et de changer l'échographie pour enregistrer en mode B (diamètre) des images lorsque l'horloge indique 05h10.
11. L'enregistrement jusqu'à l'horloge indique 07h00.
12. Marquer au moins 10 cycles cardiaques de base brachial images échographiques de l'artère avec un logiciel vasculaire mis en mode déclencher.
13. Prendre la tension artérielle du sujet. Si la pression artérielle systolique> 100 mmHg, placer 0,4 mg de nitroglycérine sublinguale sous le thème &# 39; langue et commencer minuterie, sauf si le patient a une autre contre-indication.
14. Commencez l'enregistrement en mode B (images de diamètre) lorsque l'horloge indique 3h00 avec le logiciel vasculaire mis en mode déclencher.
15. Arrêter l'enregistrement lorsque l'horloge indique 08h00.
16. Surveillance de la pression artérielle jusqu'à ce qu'elle retourne à la ligne de base

4. Préparation de veine ombilicale humaine des cellules endothéliales (HUVEC) lames de contrôle

1. Cultivez HUVECs au passage 5-6 et ~ 80% de confluence.
2. Trypsiniser avec 3 ml de trypsine ou tout ce qui est nécessaire pour le plat / flacon.
3. Neutraliser la trypsine en utilisant un volume égal de solution de neutralisation de la trypsine.
4. Centrifuger à 200 g pendant 5 min ~ et enlever la trypsine et la solution de neutralisation par le vide.
5. Reprendre dans ~ 10 ml de PBS à laver.
6. Centrifuger à 200 xg ~ 5 min. Retirer du PBS.
7. Retirer du PBS et fixer en 1800 pl de PBS + 200 pi formaldéhyde.
8. Remettre en suspension dans du PBS (~ 10 ml).
9. Centrifuger à 200 xg ~5 min. Retirer du PBS, remettre en suspension dans un volume approprié d'ajouter ~ 200 pi par diapositive.
10. Stocker les lames à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse (échantillons seront bien depuis de nombreuses années).

5. Coloration des cellules endothéliales vasculaires

1. Prenez diapositives de -80 ° C congélateur et attendre 5 min à température ambiante (cette procédure est pour un lot de 10 échantillons, dont un tiroir de commande HUVEC).
2. Essuyez l'excès d'eau avec une tâche délicate essuyer (ne pas toucher le centre de la lame).
3. Réhydrater les lames en ajoutant modifié PBS à chaque diapositive et les laisser pendant 10 min.
4. Alors que les diapositives sont debout, préparer 5% de sérum d'âne et d'autres solutions.
   1. Préparer un sérum d'âne de 5% par addition de 300 pi de sérum d'âne de 5700 pi de PBS modifié (à un pH de 7,4) pour un maximum de 10 diapositives (augmenter ce montant pour plus).
   2. Diluer l'anticorps primaire d'intérêt en 1000 ul de 5% de sérum. Par exemple, la nitrotyrosine et NADPHoxydase (1:300 et 1:1500) pourraient être utilisés comme marqueurs de stress oxydatif.
   3. Préparer AF568 secondaire en diluant 5 ul de AF568 1500 μll de 5% de sérum.
   4. Préparer VE cadhérine en diluant 2 pi de VE cadhérine à 1000 pi de 5% de sérum.
   5. Préparer AF488 en diluant 5 ul de VE cadhérine à 1000 pi de 5% de sérum.
   6. Gardez AF568, VE cadhérine et AF488 sous plastique à travers tout le processus, puis placer sur bascule en 4 ° C réfrigérateur pendant la préparation de diapositives.
5. Après 10 minutes de réhydratation, des diapositives secs avec une tâche délicate essuyer.
6. Ajouter sérum d'âne de 5% pendant 60 min et placer un morceau de film de paraffine en plastique sur la zone encerclée à assurer une couverture complète de la substance chimique.
7. Jeter le film de paraffine plastique et sécher les lames avec une tâche délicate essuyer. Ne pas laver. Ajouter anticorps primaire pendant 60 min et placer un morceau de film de paraffine en plastique sur la zone encerclée à assurerune couverture complète de la substance chimique.
8. Jeter le film de paraffine plastique, rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille et laisser tremper dans les colonnes de diapositives pendant 5 min. Alors que les diapositives sont trempage, les déplacer dans une pièce sombre. Travailler dans l'obscurité pour toutes les étapes restantes.
9. Diapositives sec avec Kimwipes, ajouter AF568 (anticorps anti secondaire) pendant 45 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
10. Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
11. Diapositives sec avec Kimwipes, puis ajouter VE cadhérine pendant 60 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
12. Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
13. Diapositives sec avecune tâche délicate essuyer, ajouter AF488 pendant 30 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
14. Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
15. Diapositives sec avec une tâche délicate et essuyez permettent lames sécher pendant 20 min. Couvrir de la lumière.
16. Ajouter une goutte seulement fluoroshield milieu de montage avec 4 ', le chlorhydrate de 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à chaque diapositive et couvrir chacune avec une lamelle.
17. Placez les diapositives dans le 4 ° C réfrigérateur recouvert d'une feuille. Imagerie doit être complété dans les 48 heures.

6. D'imagerie et d'analyse de cellules endothéliales vasculaires

1. Préparer microscope pour l'imagerie des cellules endothéliales colorées selon les spécifications du microscope spécifique. Un technicien simple aveugle doit analyser toute protéine particulière pour une chauve-sourisch des cellules.
2. Numériser des diapositives systématiquement. Identifier les cellules endothéliales par coloration positive pour VE cadhérine et confirmer l'intégrité nucléaire par coloration positive pour DAPI.
3. Image 30 cellules par lame pour une analyse ultérieure. Répétez l'opération pour chaque diapositive dans le lot souillé, y compris la HUVEC.
4. Analyser l'intensité de la coloration de l'anticorps primaire d'intérêt en utilisant un logiciel qualitative.
5. Pour réduire au minimum possible l'effet de confusion des différences de coloration d'intensité entre les différentes sessions de coloration, des valeurs de rapport comme le rapport de l'expression des protéines dans les cellules endotheliales collectées à la même expression de la protéine dans l'HUVEC.

Résultats

FA _BA est quantifiée comme la variation maximale de diamètre de l'artère brachiale suivante hyperémie réactive. Ainsi, le diamètre au repos est inférieur au diamètre de la suite de la fin d'une période de 5 min brassard de pression artérielle d'occlusion (figure 1). Le panneau A montre une image échographique représentant de l'artère brachiale, et Groupe B affiche un graphique de l'onde R changement fermée de diamètre de presse brassard à 2 min après, obtenue en utilisant un logiciel disponib...

Discussion

L'obtention de résultats précis pour la fièvre aphteuse _BA et aPWV nécessite l'acquisition d'images ultrasonores de haute qualité et des formes d'ondes de pression, respectivement. Au centre de cette formation est et l'utilisation appropriée et continue de chaque technique par l'opérateur ^44. En outre, il est essentiel de contrôler autant de variables externes qui peuvent influer sur les résultats que possible par la standardisation de la session de test (par exemple,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
J-wire	St. Jude	404584	2 par collection
Short jetable (MediShorts)	Quick Medical	4507
Station de travail hémodynamique non invasive (NIHem)	Cardiovascualr Engineering	N/A	Comprend une règle personnalisée.  ; Un système alternatif est le Sphygmocor
Ultrasound	G.E.	Modèle : Vivid7 Dimension	Nous utilisons un G.E., mais il existe de nombreuses entreprises et modèles
Logiciel vasculaire (Vascular Imager)  ;	Applications d’imagerie médicale	N/A
Boîte de déclenchement à onde R	Applications d’imagerie médicale	N/A
Système de gonflage rapide de brassard	Modèle Hokanson	: Hokanson E20
Brassard de tension artérielle d’avant-bras	Hokanson	N/A	brassard personnalisé avec vessie de 6,5 x 34 cm  ;
HUVECs	Invitrogren	C-015-5C
Sérum d’âne	Jackson	017-000-121
Pap pen	Research Products International	195505
VE Cadherin	Abcam	ab33168
AF568 Life	Technologies	A11011	dépend des spécifications de microscpe  ;
AF488	Life Technologies	A11034	dépend des spécifications de microscpe  ;
Anticorps anti-nitrotyrosine  ;	Abcam	ab7048
Anticorps contre la NADPH oxydase	Upstate	07-001
DAPI  ;	Vector	H-1200
Lingette de travail délicat (Kimwipe)  ;	Fisher Scientific	06-666-A
Film de paraffine en plastique (parafilm)  ;	Fisher Scientific	13-374-10
Microscope confocal.	Olympus	: FV1000 FCS/RICS	de nombreuses options existent.