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DOI :

10.3791/51480

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24 avril 2015

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1Department of Cell Stress Biology, Roswell Park Cancer Institute, 2Department of Pharmaceutical, Social and Administrative Sciences, School of Pharmacy, D'Youville College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article vidéo décrit une méthode in vitro modifiée pour examiner le rôle des hormones, des cytokines et/ou des facteurs de croissance dans l’invasion des cellules cancéreuses.

Résumé

Le sérum sanguin sert de chimioattractant vers laquelle les cellules cancéreuses migrent et envahissent, ce qui facilite leur intravasation en microvaisseaux. Cependant, les molécules réelles vers lequel les cellules migrent demeurent insaisissables. Ce test d'invasion modifié a été mis au point pour identifier les cibles qui entraînent la migration et l'invasion cellulaire. Cette technique compare l'indice d'invasion dans trois conditions pour déterminer si une hormone spécifique, le facteur de croissance ou cytokine joue un rôle dans la médiation le potentiel invasif d'une cellule cancéreuse. Ces conditions comprennent i) de sérum fœtal bovin normal (FBS), ii) charbon-FBS (CS-FBS), qui supprime les hormones, les facteurs de croissance et des cytokines et iii) molécule CS-FBS + (notée "X"). Un changement important dans l'invasion des cellules CS-FBS avec par rapport à FBS, indique l'implication des hormones, des cytokines ou des facteurs de croissance dans la médiation de la modification. Les molécules individuelles peuvent ensuite être ajoutés revenir à CS-FBS pour doser leur capacité à reverset ou sauver le phénotype d'invasion. En outre, deux ou plusieurs éléments peuvent être combinés pour évaluer l'effets additifs ou synergiques de plusieurs molécules dans la conduite ou l'inhibition de l'invasion. Dans l'ensemble, ce procédé permet au chercheur de déterminer si les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance / ou jouent un rôle dans l'invasion cellulaire en agissant comme agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de l'invasion d'un type particulier de cellule cancéreuse ou un mutant spécifique. En identifiant chimiotactiques et des inhibiteurs spécifiques, ce dosage d'invasion modifié peut aider à élucider les voies qui dirigent l'invasion des cellules du cancer de signalisation.

Introduction

Un nouveau dosage d'invasion a été développé dans le but d'identifier l'implication de certaines hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance chimiotactiques comme dans l'invasion des cellules cancéreuses. La capacité des cellules tumorales à envahir à travers la matrice extracellulaire (ECM) est une caractéristique du phénotype métastatique 3.1. chambres d'invasion ont été largement utilisés comme outils pour étudier in vitro l'invasion des cellules cancéreuses et la migration et peuvent fournir des connaissances sur les mécanismes de l'invasion et la métastase tumorales in vivo. Les chambres sont constituées d'inserts de culture de cellules cylindriques emboîtés dans les puits de plaques de culture de cellules. Le fond des inserts en polycarbonate ou polystyrène sont des membranes semi-perméables des tailles de pores définies.

Dans l'essai d'invasion standard, les cellules sont ensemencées sur la membrane de l'insert avec du milieu sans sérum et on les place dans des puits de culture de cellules qui sont remplis de sérum ou de sérum comme agents chimio-attractifs pour set jusqu'à un chimioattractives vigueur. Cela conduit de force cellules de se déplacer à travers la membrane semi-perméable (migration) ou encore, par un revêtement de la matrice extracellulaire (invasion), qui peut ensuite être teinté avec des colorants classiques pour détecter et quantifier le nombre de cellules. Le nombre de cellules est ensuite normalisée en fonction de l'étendue de la migration et de l'invasion dans une lignée cellulaire non invasive. Cette méthode permet à un chercheur d'évaluer le potentiel invasif de différents types de cellules dans une variété de conditions, y compris les manipulations génétiques.

Les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance sont des éléments essentiels de sérum et sont représentés plus en plus à être associé à l'entraînement du phénotype invasif 4. Cependant, la nature, le rôle et la spécificité de ces molécules sériques chimioattractives dans la médiation invasion encore demeurent insaisissables. Le défi reste à déterminer quels facteurs spécifiques dans le sérum ou de sérum comme chimioattractifs sont responsables de la conduiteinvasion des cellules cancéreuses ainsi que des molécules qui peuvent inhiber le processus d'invasion. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour évaluer l'implication potentielle des hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance présents dans le sérum, en tant que molécules de conduire l'chimioattraction et l'invasion des cellules cancéreuses.

Dans ce protocole modifié proposé, le charbon de décapage est utilisé pour éliminer les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance de 2% de sérum bovin fœtal (FBS) pour générer 2% FBS charbon de bois (CS-FBS). Les deux 2% de FBS et 2% CS-FBS sont utilisés comme agents de mettre en place la force chimioattractives à conduire l'invasion des cellules cancéreuses. Utilisation de 2% de CS-FBS comme agent chimio-attractifs par rapport à la normale 2% de FBS offre plusieurs avantages, y compris d'une part, et le plus en évidence, la possibilité d'étudier le phénotype d'invasion du cancer en l'absence réduit / relative des hormones, des cytokines et des facteurs de croissance. Il permet également à l'enquêteur de déterminer si l'élimination collective des hormones, facteurs de croissance, et CYtokines entraîne une augmentation ou diminution de l'indice invasive. Le dosage est alors conçue pour déterminer si l'addition d'un composant individuel, désignée comme «X» peut inhiber, diminuer, augmenter ou rétablir l'indice invasive à sa valeur initiale (voir les figures 2 et 3). Bien que cette méthodologie est spécifique pour atteindre les niveaux physiologiques de l'élément qui est éliminée à partir du sérum au cours de charbon décapage, il convient également de noter que le charbon de décapage peut aussi affecter les voies de transduction du signal. Par exemple, il a été rapporté que le charbon de décapage peut diminuer l'activité de la phosphatase alcaline de cellules ostéoprogénitrices et induire l'adipogenèse par la réduction des activateurs de 5 MAPK. Charcoal médias dénudées sont commercialement disponibles et sont basés sur le protocole décrit qui combine charbon dextran et incubées avec du sérum fœtal bovin O / N 6.

Cet essai a été développé en Response à un résultat rapporté par Zucker et al. 7 Les auteurs ont démontré que le phénotype mutant affectant une communication écart de jonction fait preuve d'une augmentation de l'indice d'invasion lors de la migration vers la normale médias avec 2% de FBS. Cette augmentation a été éliminée avec le remplacement de sérum de charbon-dépouillé. De ce fait, les auteurs ont conclu que ce mutant affecté migration vers une molécule lipophile (plus spécifiquement, une hormone, un facteur de croissance ou cytokines) 7. Il est bien connu que les hormones, facteurs de croissance, cytokines et médiateurs voies impliquées dans la promotion de la tumeur et invasion quatre signalisation. Ainsi, il est important pour les chercheurs scientifiques pour déterminer quel facteur (s) sont le moteur de l'invasion tumorale des cellules cancéreuses ou des mutants particulier à l'étude. L'essai est conçu pour examiner le rôle des composants individuels lors de leur concentration physiologique telle que déterminée en fonction de la différence entre la concentration du composant et# 8220; X "dans FBS normale et le CS-FBS. Grâce au développement de ce test, les enquêteurs peuvent gagner plus de perspicacité dans la voie invasive spécifique régissant leur système.

Des hormones, des facteurs de croissance, cytokines et ont souvent été considérés comme des promoteurs de tumeurs 8. Certains de ces facteurs tels que EGF sont utilisés comme sources directes pour chimioattractifs dans des chambres d'invasion neuf. Ainsi, il semble probable que ceux-ci représentent les principales composantes du sérum qui invasion tumorale directe. Ce protocole propose un moyen simple, mais significative, de la modification de l'essai in vitro classique dans d'invasion qui permet à un chercheur pour évaluer l'implication des hormones, des facteurs de croissance, des cytokines dans la médiation et le potentiel invasif des cellules cancéreuses. Cependant, le test est conçu pour fournir à l'enquêteur une réponse quant à savoir si la procédure sera efficace pour leur étude à une étape précoce dans l'analyse, afin de ne pas utiliser un temps précieux et ressources si jugées inutiles. Cette méthode utilise CS-FBS et se appuie sur la discrétion des enquêteurs à laquelle les molécules de poursuivre en tant que candidats de plomb qui interviennent potentiellement invasion des cellules cancéreuses. Les résultats de ces analyses devraient se avérer utiles dans l'identification des composants du sérum qui servent d'agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de la lignée cellulaire particulière ou un mutant de l'étude. En outre, cette approche peut aider l'enquêteur d'identifier les voies de signalisation clés soit favoriser ou inhiber l'invasion des cellules cancéreuses; dirigeant ainsi l'avenir la conception de médicaments.

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Protocole

1. Préparer les différents médias et Composants supplémentaires

  1. Avant l'expérience, préparer des milieux consistant en DMEM ou un autre support spécifiés avec l'addition de FBS soit normale, FBS charbon de bois, charbon ou FBS plus le composant à tester. Notez que plusieurs composants peuvent être testés dans chaque expérience.
  2. Peser et diluer les hormones, les facteurs de croissance, cytokines ou de façon appropriée pour être dissous dans le sérum dépouillé de charbon de bois à la concentration physiologique.

2. Préparer la Matrice Collagène on Ice

  1. Préparation 2 ml collagène I matrice, à 2,2 mg / ml en ajoutant les composants suivants stérilisées par filtration sur de la glace: 10 x 200 pi de PBS (pH 7,4), 5,4 pi de NaOH 1 N, 600 pi d'eau distillée deux fois 2 O, et 1,2 ml de collagène de type I (à 3,63 mg / ml).
  2. Conserver la solution de collagène I sur la glace jusqu'au moment de l'assiette.

3. Préparer la migration / invasion Plaques pour le dosage

  1. Pour chaque lignée cellulaire à tester, en utilisant une plaque de chambre de 24 puits à puits qui 12 contiennent des inserts. Utilisez les 12 puits supplémentaires qui ne contiennent pas inserts pour ajouter les médias chimioattractives et le transfert des inserts pour la mise en place expérimentale.
    REMARQUE: une matrice de collagène sur des plaques avec un polyéthylène téréphtalate (PET) et la membrane 8 um de taille de pore est optimale pour les lignées cellulaires utilisent ici. Cependant, une matrice de matrigel dans des plaques pré-revêtues peut également être substitué par la taille des pores en fonction de la diminution de la lignée cellulaire à l'étude.
  2. Identifiez clairement la plaque, en utilisant trois puits par condition étant analysés (migration FBS, migration CS-FBS, invasion FBS, et d'invasion CS-FBS ainsi que FBS-migration pour un contrôle, la lignée cellulaire non invasive). Dosage par déplacement migration à travers les pores d'une membrane en PET, et l'invasion de dosage par circulation à travers une matrice de collagène ou de matrigel et ensuite à travers les pores dans la membrane. Utiliser différents marqueurs de couleur pour chaque état de la cellule à unid dans le processus de placage.

4. Verser l'invasion Matrice

  1. Pipetter prudemment 75 ul de la solution de matrice de collagène dans les inserts à être utilisés pour des essais d'invasion. Faites preuve de prudence pour éviter les bulles. Disperser les bulles par l'application d'une pointe de pipette à la surface inversée.
  2. Transférer la plaque avec les inserts revêtus de collagène à un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5% pendant 30 minutes pour permettre au gel de se solidifier.

5. Plaque les cellules sur la membrane ou d'invasion Matrice

  1. Pendant ce temps, Trypsiniser cellules et ajouter du contenu multimédia avec 10% de FBS. Spin cellules à 200 g pendant 5 min sur une centrifugeuse de table et rincer 3x dans un milieu sans sérum.
  2. Remettre en suspension dans un milieu sans sérum. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou un comptoir de diaporama automatique. Ajouter un milieu sans sérum à une concentration finale de 5 x 10 4 cellules / ml.
  3. Lorsque la matrice de collagène est solidifié (après 30 minutes), ajouter 700 ul de milieu avec soit2% de FBS ou définis charbon-FBS à chaque puits. Sur les 12 inserts par plaque:
    • 3 inserts ont collagène et les puits avec les médias + 2% de FBS
    • 3 inserts ont collagène et les puits avec les médias + 2% CS-FBS
    • 3 inserts ne ont pas le collagène et les puits avec les médias + 2% de FBS
    • 3 inserts ne ont pas le collagène et les puits avec les médias + 2% CS-FBS
    1. Utilisation des plaques supplémentaires en fonction du nombre de facteurs à tester et d'une commande pas de collagène correspondant à chaque condition.
  4. Ajouter suspension cellulaire aux inserts à 5 x 10 4 cellules / ml, le placage 500 cellules par ul insert dans tous les inserts de migration et d'invasion.
  5. Incuber les cellules pendant 22 heures à 37 ° C.

6. quantifier le nombre de Migration et invasion des cellules

  1. Mettre en place la coloration des puits en utilisant du méthanol fixateur, l'éosine, et hématoxyline, dans des puits séparés.
  2. Utilisez des cotons-tiges pour éliminer les cellules et la matrice de chaque puits.Rrepeat avec deuxième application de l'écouvillon pour chaque puits.
  3. Avec une pince, tremper chaque insert 5 fois pendant 1 seconde dans chacune des trois solutions de suite.
  4. Laisser sécher inserts O / N.
  5. Soit i) supprimer des filtres avec un scalpel, couper soigneusement autour des bords et monter sur une lame avec lamelle et l'immersion d'huile, ou ii) les inserts permettent de sécher O / N inversé et utilisent les inserts directement pour la microscopie.
  6. Le lendemain, voir des diapositives ou des inserts sous un microscope avec un objectif 20X et prendre cinq images de différentes régions du filtre. Pour améliorer la cohérence, de prendre quatre champs extérieurs et un centre.
  7. Compter les cellules pour toutes les conditions en utilisant le logiciel ImageJ et appliquer les formules ci-dessous.
  8. Déterminer l'invasion de pour cent comme suit:
    # Moyenne des cellules envahissantes travers collagène je insère = a
    Moyenne # des cellules migrant à travers insert de commande = b
    Invasion% = (a / b) * 100
  9. Déterminer l'indice Invasion de 2% de FBS comme suit:
    % Invasion des cellules en cours d'analyse (à 2% de FBS) = c
    % Invasion de cellules de contrôle non invasifs en (2% de FBS) = d
    Invasion Index (FBS) = (c / d)
  10. Déterminer l'indice Invasion 2% CS-FBS comme suit:
    % Invasion des cellules en cours d'analyse (dans 2% CS-FBS) = e
    % Invasion des cellules non invasives de contrôle dans (2% CS-FBS) = f
    Indice Invasion (CS-FBS) = (e / f)

7. Répétez Protocole expérimentale visant à comparer charbon-FBS FBS charbon-dénudés + X n avec de multiples facteurs combinés

  1. Répéter la procédure plusieurs fois que nécessaire en utilisant différents composants de "X" ou une combinaison de composants.
  2. Appliquer les calculs pour déterminer la contribution de chaque facteur "X" pour les effets de la migration et d'invasion.

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Résultats

L'indice d'invasion est calculé pour chaque condition de normalisation selon l'une lignée cellulaire non invasive. Pour les expériences, on utilise la ligne 1205Lu cellulaire de mélanome et les lignées cellulaires stables variantes établi comme nos lignes envahissantes ainsi que la variante non invasive prémalignes, WM793 partir duquel les cellules ont été dérivées 1205Lu 10 qui sert de contrôle logique. Nous utilisons également collagène I que la matrice d'invasion parce que ce est le composa...

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Discussion

Tumeur métastase est un processus en plusieurs étapes. Les cellules doivent franchir la membrane basale, intravasate soit dans le système lymphatique ou le sang microvaisseaux, dans lesquels ils sont transportés à des sites distants. Les cellules tumorales puis extravasent et colonisent dans un macrométastase 12. La progression à travers la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), l'invasion tumorale et la métastase a été renforcée par des hormones stéroïdes 13,14, les facteurs de croissance...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs mentionnent les sources de financement de la D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Inserts de contrôle BioCoat avec 8.0 & micro ; m membrane PETCorning35457812 dans chacune des deux plaques de 24 puits. PET = polyéthylène téréphtalate
Collagène I, queuede rat Corning354236Source = tendon de queue de rat, pureté = 90 %
Fixateur ; Diff-QuickThermo Fisher ScientificNC9844047Fixateur à base de méthanol, hématoxyline/éosine
Sérum fœtalbovin Life Technologies16000Désigné comme FBS
Sérum fœtal bovin dépouillé de charbon de boisLife Technologies12676Désigné comme CS-FBS
Sérum fœtal bovinThermo Scientific HycloneSH30070Désigné comme FBS
Sérum fœtal bovin dénué de charbon de boisThermo Scientific HycloneSH30068Désigné CS-FBS

Références

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