Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

Résumé

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean.

Résumé

Calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique bien décrite qui mesure la chaleur dégagée ou absorbée au cours d'une réaction chimique, en l'utilisant comme une sonde intrinsèque de caractériser pratiquement tous les processus chimiques. De nos jours, cette technique est largement utilisée pour déterminer des paramètres thermodynamiques des équilibres de liaison biomoléculaires. En outre, le CCI a été démontré pour être en mesure de mesurer directement la cinétique et les paramètres thermodynamiques (k _chat, K _M, AH) de réactions enzymatiques, même si cette application est encore sous-exploité. Comme les changements thermiques se produisent spontanément au cours de la catalyse enzymatique, le CCI ne nécessite aucune modification ou l'étiquetage du système en cours d'analyse et peut être réalisée en solution. En outre, le procédé a besoin de peu de quantité de matière. Ces propriétés font de l'ITC un outil précieux, unique et puissant pour étudier la cinétique enzymatique dans plusieurs applications, telles que, par exemple, la découverte de médicaments.

k _{cat M} et K de l'hydrolyse enzymatique de l'urée par Canavalia ensiformis (jack bean) uréase. Calcul de l'enthalpie molaire intrinsèque (AH _int) de la réaction est effectuée. Les valeurs ainsi obtenues sont en accord avec les données précédentes rapportés dans la littérature, ce qui démontre la fiabilité de la méthode.

Introduction

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme mét....

Protocole

Une. Préparation des échantillons

1. Préparer 2 ml de solution d'enzyme et 0,5 ml d'une solution de substrat pour chaque série expérimentale. Diluer les solutions mères concentrées de l'enzyme et du substrat dans des solutions tampons ayant une composition identique à minimiser la chaleur de dilution et de mélange au cours de l'addition du substrat.
   1. Choisissez les conditions de tampon qui sont adéquates pour prévenir les changements de pH pendant l'expérience. Par exemple, 20 mM HEPES pH 7 est adéquate pour des mesures à pH neutre.
      REMARQUE: si l'échange de proton est impliquée, les enthalpies de protonation de....

Résultats

Uréase (CE 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant du nickel unités multiples trouvée dans archées, les bactéries, eucaryotes unicellulaires et les plantes. Ceci agit de protéines dans la dernière étape de minéralisation de l'azote organique, catalysant l'hydrolyse de l'urée en ammoniac et de carbamate, qui se décompose spontanément pour donner une deuxième molécule d'ammoniac et de bicarbonate (Equation 6) ^12.

Discussion

L'importance de l'ITC pour étudier l'activité enzymatique par rapport aux méthodes existantes

En plus de ses applications classiques pour étudier les équilibres de liaison, calorimétrie de titration isotherme offre une méthode fiable et rapide pour caractériser les réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur de réaction comme une sonde, sans nécessiter de modification ou l'étiquetage système. Les paramètres cinétiques _{kcat et}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
HEPES	Sigma	H3375	se dissout dans l’eau et ajuste le pH avec le NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	se dissout dans l’eau et ajuste le pH avec le HCl
Dihydrogénophosphate de sodium	Riedel-de-Haen	4270	se dissout dans l’eau
Phosphate de sodium dibasique	Riedel-de-Haen	30427	se dissout dans l’eau
Urée	Sigma	U4128	se dissolvant dans l’eau à 40 ° ; C
Canavalia ensiformis uréase (type C-3)	Sigma	U0251	se dissolvant dans 20 mM HEPES pH 7 et stocké à -80 ° ; C
VP-ITC sur	l’instrument		MicroCal (GE Healthcare)
VPViewer2000 1.30.00 sur Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		logiciel d’acquisition de données fourni avec l’instrument

Origin 7.0 SYS13901