Analyser le Mouvement de la Nauplios &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Par suivi optique de plasmons de surface de nanoparticules

Résumé

Nous utilisons suivi optique de nanoparticules plasmoniques à sonder et à caractériser les mouvements de fréquence d'organismes aquatiques.

Résumé

Nous montrons comment pinces optiques peuvent fournir un outil sensible pour analyser les vibrations fluidiques générées par le mouvement de petits organismes aquatiques. Une nanoparticule d'or unique détenu par une pince optique est utilisé comme un capteur de quantifier le mouvement rythmique d'une larve Nauplios (Artemia salina) dans un échantillon d'eau. Ceci est réalisé en surveillant le déplacement dépendant de la nanoparticule piégé de temps comme une conséquence de l'activité Nauplios. Une analyse de Fourier de la position de la nanoparticule obtient ainsi un spectre de fréquence qui est caractéristique pour le mouvement des espèces observées. Cette expérience démontre la capacité de cette méthode pour mesurer et caractériser l'activité des petites larves aquatiques sans l'obligation de les observer directement et à obtenir des informations sur la position des larves par rapport à la particule piégée. Dans l'ensemble, cette approche pourrait donner un aperçu de la vitalité de certaines espèces trouvées dans un e aquatiquecosystem et pourrait élargir l'éventail des méthodes classiques d'analyse des échantillons d'eau.

Introduction

évaluation de la qualité de l'eau basée sur des indicateurs chimiques et biologiques est d'une importance fondamentale pour mieux comprendre les conditions de l'Etat et de l'environnement d'un écosystème aquatique ^1-3. Les méthodes classiques d'analyse chimique de l'eau sont basées sur les propriétés organoleptiques ou la détermination des paramètres physico-chimiques. Les indicateurs biologiques, d'autre part, sont des espèces animales dont la présence et la viabilité donner un aperçu sur les conditions environnementales et l'effet des polluants pour un écosystème qui se produisent po exemples typiques de bio-indicateurs sont copépodes, un groupe de petits crustacés d'eau, qui peut être trouvé dans presque toutes les ^4,5 de l'habitat de l'eau. Observer l'activité et la viabilité de ces espèces à partir d'un échantillon d'eau peut ainsi être utilisée pour obtenir des informations sur les conditions générales de l'écosystème ^5. Les larves de copépodes, qui sont appelés Nauplii, utilisez coups rythmiques de leurs antennes (larve possède trois paires de appendages à leur région de la tête) de nager dans l'eau ^6. La fréquence et l'intensité de ces coups est ainsi un indicateur direct de l'âge, la condition physique, et les conditions environnementales de l'animal ^7-10. Toutes les enquêtes sur ces spécimens sont généralement effectués avec un microscope par l'observation et le comptage des coups d'antenne de l'Nauplii directement. En raison de leur taille (~ 100-500 um) ^11, cela nécessite souvent de faire des mesures soit un par un ou de fixer un seul Nauplios à un substrat.

Ici, nous démontrons une nouvelle approche pour observer l'activité de copépodes larves dans les échantillons d'eau à l'aide d'une nanoparticule d'or optiquement piégé comme un détecteur ultra-sensible. Pinces optiques sont généralement utilisés par de nombreux groupes comme un outil expérimental amende à appliquer ou mesurer des forces entre les molécules jusqu'à la plage de piconewton ^12-14. Plus récemment, la gamme d'applications pour les pinces optiques a été élargie pour observer les vibrations acoustiques et résoudrefluctuations nt en milieu liquide en surveillant le mouvement de nano-et microparticules qui sont confinés dans un piège optique ^15. Les particules qui sont immergés dans un liquide sont soumis à un mouvement brownien. L'intérieur d'un piège optique, cependant, cette motion est partiellement atténué par une forte, induite par laser, la force de gradient. Par conséquent, la rigidité du piège optique et la localisation de la particule dans le foyer du faisceau laser peuvent être réglées par la puissance du laser. Dans le même temps, il est possible de révéler des caractéristiques concernant le potentiel de piégeage et d'analyser les interactions des molécules avec la particule en surveillant le mouvement des particules en fonction du temps dans le piège. Cette approche rend possible de récupérer la fréquence, l'intensité et la direction du mouvement fluidique qui est généré par un objet en mouvement dans son environnement liquide. Nous montrons comment cette idée générale peut être appliquée pour obtenir un spectre de fréquence du mouvement d'un individu Nauplios sans l'exigenced'interférer directement avec le spécimen. Cette approche expérimentale introduit un nouveau concept général pour l'observation du comportement mobiles de spécimens aquatiques d'une manière très sensible. Pour les observations sur les espèces bio-indicatrices, ce qui pourrait élargir la méthodologie actuelle pour l'analyse de l'eau et pourrait être appliqué pour obtenir des informations sur la santé et l'intégrité des écosystèmes aquatiques.

Protocole

1. Installation expérimentale

1. Utiliser un microscope en haut à droite et un champ sombre condenseur d'huile avec une ouverture numérique (NA) = 1,2 pour l'éclairage de champ sombre. Utilisez un objectif à immersion d'eau avec un grossissement de 100X et un NA = 1,0 pour les observations de particules et le piégeage. Utilisez un objectif de l'air avec un grossissement de 10X et un NA = 0,2 pour suivre le mouvement de la Nauplios.
2. Utilisez une configuration de pinces optiques avec un laser nm 1064 à onde continue couplée dans le microscope en haut à droite. Régler la puissance de laser du piège optique à 100 mW (mesurée avec un appareil de mesure de puissance après l'objectif).
3. Utilisez un appareil photo à haute vitesse CMOS ou un reflex numérique unique objectif (DSLR) de la caméra pour détecter et l'image du mouvement de particules d'or dans le piège optique et le mouvement de la Nauplios.
4. Utiliser un filtre coupe-bande pour éviter que le laser de pénétrer dans l'appareil.
5. Utiliser un wattmètre pour mesurer la puissance du laser après l'objectif.

2. Préparation de l'échantillon

1. Pipeter une gouttelette d'eau (180 ul) sur une lame de verre de microscope et la position de l'échantillon sur le microscope à fond noir.
2. Pipeter une Nauplios à partir d'un petit réservoir d'eau de la goutte d'eau.
3. Utilisation d'un objectif 10X d'air pour observer le mouvement de la Nauplios dans la solution et d'enregistrer un flux vidéo.
4. Utilisation d'une nanoparticule d'or d'un diamètre de 60 nm en tant que détecteur d'observer le mouvement du fluide généré par l'Nauplios. Par conséquent, ajouter 5 ul d'une solution très diluée de particules dans la gouttelette d'eau, de sorte que d'environ une particule peut être vue dans le champ de vision avec un objectif à immersion dans l'eau de 100X.

3. Particules Suivi Expérience

1. Piège une nanoparticule d'or avec la pince optique. Par conséquent, amener le laser de piégeage de 1064 nm à proximité d'une nanoparticule d'or qui se diffuse dans la solution en déplaçant la platine du microscope. Les forces optiques intéressantes tirent la nanoparticule d'or vers le point focal du ee faisceau laser. La particule piégée est pas plus diffuse et plutôt maintient sa position. Prenez un flux vidéo de la nanoparticule piégé avec l'appareil photo reflex numérique à un taux de 50 Hz pour 30 sec de cadre.
2. Éteignez le laser de la pince optique et libérer la nanoparticule d'or du piège.
3. Utilisez un programme de suivi de particules à la lecture de la position de la particule d'or optiquement piégé à chaque trame du flux vidéo. Une transformation de Fourier rapide (FFT) de xy-position de la particule au cours du temps montre un spectre de fréquences.
   NOTE: Ici, un code de programme informatique 'IGOR PRO' auto-écrite a été utilisé pour analyser la position de centre de la particule dans le plan xy au fil du temps et de l'analyse FFT.
4. Comme une alternative à un code IGOR auto-écrite utiliser le programme gratuit "Vidéo spot Tracker» pour le suivi de la particule dans la vidéo. Utilisez le logiciel commercial «Origine» pour effectuer la transformation de Fourier des données de suivi:
   1. Faites glisser le fichier vidéo pour le programme ouvert »Vidéo spot Tracker.
   2. Clic de souris sur la particule vu dans la première image du flux vidéo et une région d'intérêt circulaire apparaît.
   3. Choisissez "symétrique" et "optimiser" dans le haut commandement fenêtre d'invite à optimiser le suivi de la particule.
   4. Clic de souris "exploitation forestière" dans le haut commandement fenêtre d'invite et choisir un dossier pour enregistrer les données. Les données de suivi seront enregistrés comme une feuille de données.
   5. Clic de souris "jeu vidéo" sur la fenêtre de commande gauche du programme de suivi et de patienter jusqu'à ce que tous les cadres de la vidéo sont analysés.
   6. Fermez le programme et ouvrir la feuille de calcul des données enregistrées avec «Origine». Définissez les valeurs de colonne comme "y _1" et _"2 y".
   7. Situé pas de temps pour chaque image vidéo comme "x" dans la feuille de calcul de données 'origine'.
   8. Mark xPosition colonne et effectuer une FFT en choisissant "Analyse des données" et "FFT" dans le haut commandement fenêtre d'invite. Répétez l'étape pour la colonne de la position y.
   9. Tracer les amplitudes du signal FFT calculé en x et la direction y par rapport à la fréquence.

4. Simulation numérique

1. Calculer les α de polarisabilité de la particule 60 nm d'or en utilisant le programme informatique «Mathematica».
   1. Utiliser l'équation (1) pour le calcul de la polarisabilité selon Kuwata et al ^16.:
      (1)
   2. Définir les trois paramètres suivants dans le code de programme: la fonction diélectrique complexe dépendant de la longueur d'onde de la particule d'or, le rayon de la nanoparticule, et l'indice de réfraction du milieu environnant.
2. Utiliser la description des élecdistribution du champ trique d'un faisceau gaussien focalisé selon Agayan et al ¹⁷ pour le calcul des forces optiques agissant sur ​​une particule d'or de 60 nm.:
   (2)
   1. . Utilisation des équations (3) - (6) à partir de Agayan et al ¹⁷ pour calculer à la fois, et le gradient de diffusion des forces agissant sur ​​la particule:
      (3)
      (4)
      (5)
      (6)
   2. Dans le code de programme, de définir les paramètres de la puissance du laser, l'ouverture numérique de l'objectif, et la polarisabilité complexe de la nanoparticule.
   3. Résumer la force de gradient et la force de diffusion pour calculer la force optique totale agissant sur la particule d'or dans un piège optique.
3. Lancer la simulation en appuyant simultanément sur "Control" et "Enter".

Résultats

Une illustration schématique du dispositif expérimental est représenté sur la Figure 1A. Une configuration de champ foncé est nécessaire pour détecter optiquement le déplacement d'une particule d'or de 60 nm dans un piège optique ^15. La longueur d'onde de 1064 nm pour le laser de piégeage est choisie pour garantir un confinement stable du ^12,14 de particules d'or de détecteur. Un diviseur de faisceau dans le microscope est utilisé pour focaliser le faisceau de piége...

Discussion

Microscopie en champ sombre est un outil puissant pour la visualisation de nanoparticules d'or avec des dimensions inférieures à la limite de diffraction optique, depuis la section efficace de diffusion des nanoparticules métalliques dépasse leur section géométrique (cf. figure 2A) ^18. Dans une configuration de type brucelles, cette approche permet de distinguer même si seulement un seul ou plusieurs des nanoparticules d'or sont piégés par le faisceau laser, car le couplage plasmoniqu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope Zeiss Axio Scope.A1	Carl Zeiss	490035-0012-000	Éclairage en fond noir
Objectif à eau Achroplan	Carl Zeiss	440087	Grossissement 100X, NA = 1,0
Objectif à air Epiplan	Carl Zeiss	442934	Grossissement 10X, NA = 0,2
Condenseur à huile en champ noir	Carl Zeiss	445323	NA = 1,2
Cobolt Rumba CW 1 064 nm DPSSL	Cobolt	1064-05-01-2000-500	1 064 nm, CW, &lambda ; = 1 064 nm, 2 Watt, TEM00
Expanseur de faisceau	Edmund Optics		Réf. 1064 2-8X 64414
Caméra haute vitesse Dimax HD	PCO. Allemagne
Appareil photo couleur Canon EOS 500 D  ;			Canon FAQ-ID : 8201395700
Filtre coupe-bande StopLine 532/1064	Semrock	A11149-711265	Réf. NF01-532U
Eau  ;
Nauplius Artemia salina
Gold colloïde	BBInternational	Batch 13741  ;	Diamètre 60 nm
MQMie version 3.2  ;	Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0	Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0  ;	COMSOL, Inc.