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Article de méthode

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la

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DOI :

10.3791/51506

⸱

31 août 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Résumé

L’effet protecteur de nombreux allèles HLA de classe I sur la pathogenèse du VIH-1 et la progression de la maladie est, en partie, attribué à leur capacité à cibler les parties conservées du génome du VIH-1 qui s’échappent difficilement. Les changements de séquence attribués à la pression immunitaire cellulaire se produisent dans tout le génome pendant l’infection et, s’ils sont trouvés dans des régions conservées du génome telles que Gag, peuvent affecter la capacité du virus à se répliquer in vitro. La transmission de polymorphismes liés à HLA chez Gag à des receveurs non appariés HLA a été associée à une réduction des charges virales de consigne. Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être dû à une capacité de réplication réduite du virus. Nous présentons ici une nouvelle méthode d’évaluation de la réplication in vitro du VIH-1 influencée par le gène gag isolé à partir de points temporels aigus chez des Zambiens infectés par le sous-type C. Cette méthode utilise le clonage basé sur l’enzyme de restriction pour insérer le gène gag dans un squelette proviral commun du VIH-1 de sous-type C, MJ4. Cela le rend plus approprié pour l’étude des séquences de sous-type C que les méthodes précédentes basées sur la recombinaison qui ont évalué la réplication in vitro de séquences gag-pro dérivées de manière chronique. Néanmoins, le protocole pourrait être facilement modifié pour l’étude de virus d’autres sous-types. De plus, ce protocole détaille une méthode robuste et reproductible pour évaluer la capacité de réplication des virus chimériques Gag-MJ4 sur une lignée de cellules T à base de CEM. Cette méthode a été utilisée pour l’étude des virus chimériques Gag-MJ4 dérivés de 149 Zambiens gravement infectés de sous-type C, et a permis d’identifier les résidus dans Gag qui affectent la réplication. Plus important encore, la mise en œuvre de cette technique a permis de mieux comprendre comment la réplication virale définit les paramètres de la pathogenèse précoce du VIH-1, tels que la charge virale au point de consigne et le déclin longitudinal des lymphocytes T CD4+.

Introduction

Déterminer à la fois l'hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l'hôte d'établir un état ​​stable (point de consigne) de la charge virale de 1,2. Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral 3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l'intérieur de s'échapper du génome viral qui renverser CTL reconnaissance des cellules infectées par des virus 9.5.

Certains allèles HLA ont été associés à une charge virale plus faibles et plus lente progression de la maladie, y compris 57 * B, B * et B * 27 81 10 à 15. Une partie de l'effet protecteur des allèles HLA de classe I peut être attribué au fait qu'ils ciblent les régions fonctionnellement limitées du génome tels que Gaget pour sélectionner des mutations d'échappement qui diminuent la capacité du virus à se répliquer in vitro de 16 à 21. Bien évasion du système immunitaire cellulaire est bénéfique pour le virus dans le contexte de la classe de sélection de l'allèle HLA I, l'effet de ces mutations peut avoir des conséquences différentielles de l'hôte lors de la transmission d'un individu HLA-incompatibles 22,23. Par conséquent, la compréhension des effets des mutations transmises évacuation de HLA-associé sur la capacité de réplication virale sera important d'approfondir notre compréhension de début de la pathogenèse du VIH-1.

Bien que beaucoup de progrès ont été faits pour identifier et caractériser les défauts de remise en forme de mutations d'échappement individuelles associées à HLA de classe spécifique je allèles 24-29, naturellement isolats VIH-1 ont des empreintes uniques et complexes de polymorphismes HLA-associé, probable découlant de l'HLA pression immunitaire médiée par des milieux différents immunogénétiques 30. En apanalyse revious, Goepfert et al. a montré que l'accumulation de mutations HLA-associés dans les séquences Gag transmissibles provenant de 88 Zambiens infection aiguë a été associée à une réduction de la valeur de consigne de la charge virale 31. Ceci suggère que la transmission de mutations délétères d'échappement, en particulier dans Gag, à des destinataires HLA-incompatibles fournit un bénéfice clinique, et peut être dû à la réplication virale atténuée. Aller de l'avant, il est impératif d'étudier la complexité des combinaisons de polymorphismes Gag dans les isolats naturels travaillent de concert pour définir les caractéristiques du virus transmissibles telles que la capacité de réplication et de la réplication précoce pourrait à son tour affecter le VIH-1 paramètres cliniques et à un stade avancé pathogenèse.

Brockman et al. D'abord démontré un lien entre la capacité de réplication des séquences gag-pro isolé lors de l'infection de stade chronique et la charge virale dans les deux sous-type C et les infections B32-35. L'approche expérimentale présentée dans ces études, bien approprié pour l'examen de la capacité de réplication in vitro de séquences provenant d'individus infectés de manière chronique, présente plusieurs réserves techniques et des limitations qui rendent l'étude du VIH-1 sous-type à capacité réplicative C individus infectés aiguë difficile. Cette méthode repose sur la recombinaison de séquences amplifiées par PCR basée sur la population dans le sous-type B NL4-3 provirus, qui a été dérivé en partie de VBL, un laboratoire adapté stock de virus 36. génération du virus a été réalisée par co-transfection d'une lignée de cellules T CEM à base 37 avec des amplicons PCR et digéré delta NL4-3 ADN de gag-pro. Cette méthode nécessite l'excroissance du virus au cours d'une période de plusieurs semaines à plusieurs mois, ce qui pourrait fausser la nature du stock de virus récupérée par rapport à la quasi-espèce virale in vivo, et en modifiant par conséquent la mesure de la capacité de réplication in vitro. Cette méthode is plus approprié pour étudier les individus infectés de manière chronique, où il sélectionne de manière efficace contre le virus de la capacité réplicative plus élevé, et où le clonage de nombreux différents variants viraux à partir d'un grand nombre d'individus infectés de manière chronique est très laborieuse et donc non réalisable. Cependant, au sein d'une personne gravement infectée, il ya généralement de un à deux variantes présent, et éliminant ainsi le risque de biaiser la nature du stock de virus récupéré, grâce à des pressions de sélection in vitro, permet une évaluation plus précise de vitro la capacité à la réplication. Deuxièmement, cette méthode nécessite recombiner sous-type C séquences gag-pro dans un squelette dérivé sous-type B, et pourrait introduire squelette biais d'incompatibilité dans l'analyse. En raison de ces limitations, un grand nombre de séquences doivent être analysés afin de surmonter les biais potentiels introduits.

Nous décrivons ici une appro expérimental alternatifhaque approprié pour étudier des séquences dérivées de sous-type C personnes infectées de façon aiguë. Nous utilisons une stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour introduire le gène gag provenant de points de VIH-1 sous-type C individus infectés temps de l'infection aiguë dans le proviral épine dorsale sous-type C, MJ4. L'utilisation de MJ4 comme une épine dorsale qui en commun pour cloner les gènes gag est crucial pour l'analyse de sous-type C de séquences dérivées. MJ4 est issu d'un isolat primaire 38, et seraient donc moins susceptibles d'introduire un biais en raison de sous-type incompatibilité entre la colonne vertébrale et le gène gag. De plus, l'approche de clonage en utilisant l'enzyme de restriction sur la base permet la proviral construit pour être directement transfectées dans des cellules 293T, et pour la récupération d'un stock de virus clonal identique à la séquence gag clone.

Le procédé présenté ci-dessous est un procédé à haut débit pour évaluer la capacité de réplication de sous-type C provenant Gag-MJ4les virus chimériques. La transfection dans des cellules 293T est simple et la récupération de virus ne prend que trois jours. In vitro la capacité de réplication est analysée sur la même lignée de cellules T à base de CEM-CCR5 créé par Brockman et al. 37, mais en utilisant des modifications du protocole importants nécessaires à la replication réussie des sous-types des virus chimériques C MJ4. L'utilisation d'une lignée de cellules T approprié plutôt que de PBMC permet à un grand nombre de virus de sous-type chimérique MJ4-C à tester avec une grande reproductibilité test. Enfin, en utilisant un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse pour la quantification du virus dans le surnageant est plus économique que l'utilisation des kits ELISA disponibles dans le commerce p24. Il donne également une gamme dynamique plus élevée, ce qui était important pour détecter les virus faiblement et hautement répliquant dans le même dosage et pour détecter des différences subtiles dans la réplication entre les isolats.

En conclusion, la méthode présentée ici a permis del'étude approfondie de la capacité de réplication des séquences gag dérivés du VIH-1 sous-type C infection aiguë individus de la Zambie, et comme il est écrit, pourrait aussi être élargie pour étudier d'autres sous-type C infecté populations. Un haut degré de variation dans les capacités de réplication entre les différents isolats Gag a été observée. En outre, nous avons pu montrer une association statistique entre la capacité de réplication du Gag transmis et la consigne de la charge virale ainsi que des CD4 + baisse sur une période de trois ans 39. Ces résultats soulignent l'importance d'étudier les caractéristiques virales faire transmis, tels que la capacité de réplication, interagissent avec le système immunitaire de l'hôte d'influencer la pathogenèse lors de l'infection précoce et feront partie intégrante de l'élaboration d'interventions efficaces de vaccination ainsi que le traitement.

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Protocole

1 Amplification du VIH-1 gag Gene de Infected, le plasma congelé

  1. Extraire un ARN viral à partir de 140 ul décongelés VIH-1 plasmatique infecté en utilisant un kit d'extraction.
    1. Lorsque cela est possible, de procéder immédiatement à la synthèse d'ADNc, après extraction de l'ARN viral comme l'ARN non congelé, on obtient les meilleurs résultats d'amplification. Si possible, mettre en place PCR master mix pour la première ronde amplification de l'ADN et conserver à 4 ° C avant l'extraction de l'ARN viral.
  2. L'inversion de transcrire l'ADNc à partir d'ARN et d'ADN amplifier des produits du premier tour à l'aide de la transcriptase inverse et une ADN-polymérase thermostable en une seule étape de RT-PCR.
    1. Prenez ARN de -80 ° C congélateur (si le gel était nécessaire) et dégel brièvement à la température ambiante, puis placer dans le bloc froid. Transférer 5 pl d'ARN de chaque tube PCR contenant 45 ul de mélange maître pour obtenir un volume final de 50 ul. Placer immédiatement restant échantillons d'ARN en -80 ° C congélateur.
    2. Après enzyme est unedded au premier tour de PCR Master Mix (Tableau 1A), aliquot de 45 ul dans chaque tube d'amplification par PCR à paroi mince pour le nombre de réactions désirées. Assurez-vous d'utiliser des tubes PCR avec bouchons individuels et pas dépouiller bouchons pour assurer la contamination croisée minimale entre les échantillons. Placez les tubes PCR dans un bloc froid pour protéger le sensible et l'enzyme ARN modèle RT de température. Note: Les échantillons doivent être en triple afin d'échantillonner convenablement les quasi-espèces virales. Il est également important d'utiliser un produit avec une haute fidélité de l'ADN polymerase de l'enzyme de façon à minimiser une mauvaise incorporation par PCR introduit. S'il vous plaît se référer à la liste des réactifs pour le produit recommandé.
    3. Après matrice d'ARN a été ajouté à tous les tubes de réaction, à transférer des tubes de PCR pour l'amplification d'un thermocycleur en utilisant le programme de thermocycleur décrit dans le tableau 1B. Remarque: Le produit de cette amplification sera utilisé dans un second tour de PCR nichée.
  3. Effectuez une soi nichécond-tour d'amplification par PCR, en utilisant 1 pi de la première amplification par PCR circulaire (1.2) en tant que matrice d'ADN.
    1. Aliquote de 49 pi de deuxième ronde PCR Master Mix (tableau 2A) à chaque tube à paroi mince PCR pour le nombre de réactions souhaitées. Transfer 1 ul de l'amplification par PCR du premier tour de chaque tube de réaction pour donner un volume final de 50 ul. Remarque: Cela servira ADN comme matrice pour l'amplification du second tour. Il est également important d'utiliser une ADN polymérase avec des capacités très haute fidélité et de relecture afin de minimiser misincorporation PCR introduit. S'il vous plaît se référer à la liste des réactifs pour le produit recommandé.
    2. Transfert de deuxième ronde mélange réactionnel de PCR pour thermocycleur et démarrer le programme décrit dans le tableau 2B. Note: Après la fin du programme, les produits de cette réaction sont exécutés sur un gel d'agarose pour confirmer la production de ce produit.
  4. Ajouter 3 pi de 5x colorant de charge à 5 & #181; l de 50 pi volume de réaction de deuxième ronde et de fonctionner à 120 V sur un gel d'agarose-TAE 1% contenant un colorant ADN fluorescente sous rayonnement UV jusqu'à ce que les bandes sont résolus. Visualisez 1,6 kb bandes sur un illuminateur bleu (voir figure 1A).
  5. Exécutez le volume de réaction de 45 ul restant sur un gel d'agarose-TAE 1% contenant une tache d'ADN, et exciser les bandes appropriées avec une lame de rasoir propre.
    1. Extraire l'ADN de la tranche de gel en utilisant un kit de purification de gel, élution dans l'eau sans nucléase, combiner trois réactions positives par individu, et de geler produit à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. Préparation amplicons de bâillon pour le clonage par l'introduction des sites de restriction nécessaires

  1. Amplifier le Long Terminal Repeat (LTR) / 5 de partie 'UTR du plasmide MJ4 (voir le tableau 3).
  2. Visualisez les produits 1.3 ko PCR sur illuminateur, accises amplicons positifs, gel purifier et geler comme précédemmentdécrit (1.4,1.5; voir la figure 1B).
  3. Créer fusionné MJ4 LTR- amplicons gag par "épissure chevauchement-extension" PCR (voir tableau 4).
  4. Visualiser, d'accise, de purifier et de geler les amplicons 3.2 ko comme dans 1.4,1.5 (voir figure 1C).

3. Clonage amplifiés gag gènes dans le MJ4, sous-type C, clone moléculaire infectieux

  1. Digérer 1,5 pg de plasmide MJ4 et 1,5 pg de produit PCR purifié LTR- gag avec le Bell (sensible à la méthylation) endonucléase de restriction pendant 1,5 heure à 50 ° C (voir tableau 5A).
  2. Ajouter 1 pi de NgoMIV de la réaction de digestion et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  3. Ajouter 5x colorant de charge de digestion de restriction des réactions et l'électrophorèse lentement le volume total sur un gel d'agarose-TAE 1% contenant une tache d'ADN sur gel pendant 1-2 heures à 100 V. Visualiser, d'accise, et purifier bandes indiquées pour le clonage comme précédemment described (voir Figure 2).
  4. Préparer les réactions de ligature en utilisant LTR- gag insert purifié et ADN vecteur MJ4 à 3: 1 insert rapport de vecteur. Incuber les réactions de ligature durant la nuit à 4 ° C (voir Tableau 5B).
  5. Transformer les bactéries JM109 compétentes chimiquement avec les produits de ligation et étalées sur des plaques de gélose LB avec 100 ug / ml d'ampicilline et de croître à 30 ° C pendant 22 + heures.
    1. Décongeler JM109 cellules compétentes sur la glace pendant 15 min. Étiqueter 1,5 ml microtubes et froid sur la glace.
    2. Aliquote 50-100 ul de cellules JM109 de pré-réfrigéré 1,5 ml microtubes. Ajouter 2,5-5 ul de la réaction de ligature à JM109 cellules, effleurant légèrement le tube pour mélanger et retourner immédiatement à la glace. Incuber les cellules compétentes avec le produit de ligature sur de la glace pendant 30 min.
    3. Le choc thermique 1,5 ml microtubes contenant des cellules compétentes JM109 et réaction de ligature dans un bloc chauffant à 42 ° pendant 45 secondes et revenir à la glace pendant au moins 3 min.
    4. Ajouter 50 ul de milieu SOC à chaque microtube et plaquer la réaction de transformation sur l'ensemble de la température ambiante des plaques d'agar-LB complété avec 100 pg / ml d'ampicilline.
    5. plaques de transfert à un incubateur à 30 ° et laisser pendant 20 heures, ou jusqu'à ce que les colonies sont bien formés.
  6. Prélever des colonies isolées et de grandir dans 4 ml de LB avec 100 pg / ml d'ampicilline à 30 ° C pendant 22 + heures.
  7. Isoler cultures à 3200 g pendant 15 min, verser le bouillon, et extraire l'ADN plasmidique.
  8. Pour confirmer le clonage fidélité, couper l'ADN miniprep avec NgoMIV et Hpal enzymes de restriction dans une double digestion à 37 ° C pendant 2 heures. Analyser le gel à 1% d'agarose-TAE (voir le tableau 5C).
  9. Séquence de la région d'insertion LTR-gag de chaque plasmide en utilisant les amorces suivantes: GagInnerF1, GagF2, Rév1, Rev3, et GagR6 (tableau 6) pour confirmer l'identité de séquence.
  10. Comparer les séquences clonées obtenues avec les séquences de la population derIved de l'amplicon purifié initial de 1.5.1. Remarque: il est important de déterminer en fin de compte la capacité de réplication de deux clones indépendants afin de s'assurer que tous les phénotypes in vitro de la réplication ne sont pas dues à des erreurs de squelette introduites au cours du processus de clonage.

4. génération et de titrage de réplication compétentes Gag-MJ4 chimériques virus

  1. Générer la réplication du virus compétent par transfection de 1,5 pg de l'ADN miniprep MJ4 plasmide chimère dans des cellules 293T en utilisant un ratio de 4: 1 de Fugene HD tel que décrit par le Prince et al 39.
  2. Titre récolté stocks de virus sur les cellules TZM-bl comme décrit ci-dessous et à Prince et al 39.
    1. Plate cellules TZM-bl 24 h avant l'infection par le virus afin d'avoir une monocouche de cellules confluentes de 30-40% le jour suivant. Ceci peut être réalisé en ajoutant 5 x 10 4 cellules dans un volume total de 800 ul par puits dans une plaque à 24 puits.
    2. Après l'ajout de cellules pour le bien, déplacez doucement la plaque de 24 puits en avant et en arrière, puis côté à l'autre afin de répartir efficacement les cellules. Ne pas agiter - cela se traduira par des cellules qui s'accumulent dans le milieu de la plaque.
    3. Le lendemain, préparer 1% de FBS dans DMEM; il sera utilisé pour diluer le DEAE-Dextran et dilué à des stocks de virus. DEAE-Dextran Image est de 10 mg / ml ou 125x, et une concentration finale de 80 pg / ml ou 1 x est souhaité.
    4. Sortez stock de virus à tester de -80 ° C congélateur et le lieu sur un agitateur à décongeler à température ambiante.
    5. En utilisant une pipette multicanaux, diluer en série stocks de virus dans une culture de tissu à fond rond à traiter plaque à 96 puits avec couvercle. Il s'agit d'un protocole de dilution de 3 fois. Voir le tableau 7 pour le schéma de dilution.
    6. Retirez le support de plaques à 24 puits TZM-bl ensemencées en utilisant un aspirateur à vide veillant à ne pas perturber la monocouche cellulaire. Ne retirez le support d'une plaque de 24 puits à la fois pour que les cellules fontne se dessèche pas.
    7. Ajouter 150 ul de la DEAE-Dextran 1x + 1% de FBS dans du DMEM mélange à chaque puits en utilisant une pipette de 1000 ul. Ne pas utiliser la répétition pipette car cela perturbe la monocouche.
    8. Ajouter 150 ul de chaque dilution du virus au puits approprié. Ajouter virus au centre du puits et agiter doucement afin de répartir virus à travers la monocouche cellulaire. Incuber les cellules infectées pendant 2 heures dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C et 5% de CO 2.
    9. Après l'incubation de 2 heures, ajouter 0,5 ml de 10% de FBS dans du DMEM à chaque puits et les plaques revenir à un incubateur à 48 h supplémentaires.
    10. Après 48 h, les cellules doivent être à 100% de confluence. Parce MJ4 est un virus compétent pour la replication, il y aura une certaine mort cellulaire, mais ce doit être prévu.
    11. Retirez le support de chaque puits et ajouter 400 pl / puits de solution (voir le tableau 8A pour la recette) de fixation. Fixer une seule plaque à la fois. Ajouter la solution de fixation à l'aide d'une pipette de 1000 pi, et laisser reposer pendant 5 minutes àla température ambiante.
    12. Enlever la solution de fixation et laver 3 fois avec du PBS avec Ca2 + / Mg 2 +. Utilisez un vaporisateur d'ajouter doucement PBS sur le côté du puits pour éviter de perturber la monocouche. Après le troisième lavage, effacer plaque sèche sur du papier absorbant.
    13. Ajouter 400 pl / puits de solution de coloration (voir le tableau 8B pour la recette) à chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber à 37 ° C pendant au moins 2 h. De plus longues durées d'incubation sont acceptables, mais les temps d'incubation doivent être conservés cohérente entre les expériences de titrage.
    14. Laver 2 fois avec du PBS avec Ca2 + / Mg 2 + et le score de l'infection, ou ajouter du PBS et conserver à 4 ° C pour marquer plus tard. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant jusqu'à quatre jours, à condition que la monocouche est maintenu hydraté.
    15. Pour marquer l'infection, utiliser un marqueur permanent pour diviser les puits de la plaque de 24 puits en quadrants. Compter toutes les cellules bleues dans un champ de vue, en utilisant un grossissement total de 200X, une fois danschacun des quatre quadrants d'un puits.
    16. Calculer unités infectieuses par ml comme suit: [(# cellules bleues / 4) x 67] / (pi virus ajouté) = UI / ul. Reportez-vous au tableau 8C pour volume ul de virus ajoutée à chaque puits. Moyenne plusieurs puits ensemble; les chiffres devraient être relativement similaire pour un titrage précis.

5 Préparation de milieux de culture et la propagation des cellules GXR25 pour test in vitro de la réplication dans

  1. Préparer RPMI complet (cRPMI) pour la propagation des cellules GXR25. NOTE: Il est extrêmement important pour la culture de cellules GXR25 au moins 4 mois avant les expériences de réplication prévues (voir le tableau 9).
  2. Fractionnement de cellules 01h10 deux fois par semaine et de maintenir la densité des cellules entre 1 x 10 5 à 2 x 10 6 cellules / ml.

6. Dans réplication in vitro de Gag-MJ4 chimères dans GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Cellules

  1. La veille de l'infection, fractionner les cellules à une concentration comprise entre 3.2 x 10 5 cellules / ml, de sorte qu'ils sont en croissance logarithmique, le jour de l'infection.
  2. Le jour de l'infection, enlever des stocks de virus à partir de -80 ° C et décongélation congélateur. Calculer le volume nécessaire de virus à partir de chaque valeur sur la base de la UI / ul titre de test sur ​​des cellules TZM-bl pour infecter 5 x 10 5 cellules GXR25 à une multiplicité d'infection de 0,05, en utilisant la formule:
    Volume du virus de l'infection (pi) = 1 pl / X UI x 0,05 x 500000
    NOTE: Nous avons choisi une MOI de 0,05 comme cela se traduit par une phase de croissance logarithmique pour tous les virus que nous avons testées. Il est important de procéder à des expériences initiales afin de déterminer la MOI optimale de croissance logarithmique pour capturer le virus à tester.
  3. Diluer virus dans cRPMI à un volume de 100 ul (pour parvenir à une MOI de 0,05) et ajouter dans un puits de culture de tissu à fond en V traités plaque à 96 puits. Note: Inclure la fois une positive contrôle (MJ4 WT infecté) et un négatif (cellules infectées simulées) dans chaque série d'expériences de réplication. Mettre en place la plaque de telle sorte que chaque autre colonne est vide afin de limiter la contamination croisée entre les puits. Le contrôle positif est impératif, car il sera utilisé plus tard comme un standard pour normaliser les réplication de ski, qui sont une mesure du taux de répétitions expérimentales de réplication.
  4. Compter les cellules GXR25 l'aide d'un compteur de cellules automatisé. Calculer le nombre de cellules nécessaires au total pour toutes les infections (5 x 10 x 5 # infections). Aliquoter le volume requis dans un 50 ml de tubes et centrifuger pour sédimenter les cellules coniques. Toujours calculer pour 25% des infections plus que nécessaire.
  5. Aspirer le milieu soigneusement et remettre en suspension dans cRPMI à une concentration de 5 x 10 5 cellules / 100 pi.
  6. cellules de pipette dans un bac stérile et bien mélanger. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 pi de cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le virus dilué. Mix soigneusement.
  7. Ajouter 2 pl de 5 mg / ml (100 x) de solution de polybrène à chaque puits et les cellules bien mélanger.
  8. Incuber à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec 5% de CO2 pendant 3 heures.
  9. Afin de laver les cellules infectées, centrifugeuse plaque de 96 puits fond en V à culot cellules. Puis retirez délicatement 150 pi du milieu et les remplacer par de nouvelles 150 pi de cRPMI sans perturber le culot cellulaire. Répétez 2 fois (y compris centrifugation) pour laver suffisamment cellules.
  10. Après la dernière centrifugation et l'addition de 150 ul cRPMI, remettre en suspension le culot de cellules avec une pipette à canaux multiples et ajouter le mélange de cellules / virus entier (environ 200 ul) de chaque puits de manière indépendante à 800 ul de cRPMI dans un puits d'un tissu à 24 puits plaque de culture.
  11. Placer la plaque dans 5% de CO 2 de culture de tissus incubateur à 37 ° C.
  12. Tous les deux jours, supprimer 100 pi de surnageant de la surface de culture bien et transférer dans un puits 96 Uplaque -Fond et magasin congelées à -80 ° C jusqu'à ce que l'exécution de sensibilité du dosage du virus. REMARQUE: agencement attentive des surnageants dans des plaques à 96 puits va permettre le transfert de la pipette à canaux multiples de surnageants de culture au cours de virion quantification par un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse (RT). Chaque plaque doit contenir des échantillons à partir d'une norme de l'infection afin de normaliser la variation inter-plaque dans le test de lecture RT.
  13. Après avoir retiré l'échantillon de 100 pi de cellules, par division de 1: 2 par les cellules à fond remet en suspension et l'élimination de la moitié du volume restant (450 pi). Restaurer le volume original (1 ml) en ajoutant 550 pi de frais cRPMI à chaque puits.

7 Analyse de la transcriptase inverse (RT) en culture cellulaire surnageants

Protocole adapté d'Ostrowski et al 40.

  1. Mettre en place le capot de sécurité biologique dans une installation BSL-3 pour une utilisation avec des matières radioactives.
    1. Placez du papier absorbant dans hood et remplacer aspirateur pour aspirateur destiné à être utilisé désigné radioactif. Remarque: Tous les déchets radioactifs doit être correctement mis au rebut avec conformément à la réglementation en matière de sécurité.
  2. Ajouter 1-2 ul de 10 mCi / ml de [α- 33 P] dTTP et 4 pi de 1 M dithiothréitol (DTT) à chaque aliquote de 1 ml RT master mix (voir le tableau 10 et Ostrowski et al. 40).
  3. Mélanger soigneusement chaque tube de 1,5 ml de RT mélange maître, TNT, et [α- 33 P] dTTP avec une pipette de 1000 pi et le transfert à un creux stérile.
  4. Distribuer 25 l de marqué RT mélangent dans chaque puits de la plaque PCR à paroi mince 96 puits. Note: Inclure un espace pour un contrôle positif (MJ4 d'infection WT) et du contrôle négatif (infection Mock).
  5. Ajouter 5 pi de chaque surnageant à la plaque PCR contenant le mélange maître RT.
  6. Sceller plaque PCR avec la couverture de feuille adhésive et incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans un thermocycleur. Pour des raisons de sécurité, rinsoi embouts de pipette avec Amphyl et disposer de conseils en petit récipient contenant des déchets Amphyl, qui sera plus tard être éliminés avec les déchets radioactifs.
  7. Après incubation, faire des petits trous dans le couvercle de la feuille à l'aide d'une pipette multi-canaux de 200 pi. Remarque: Si des embouts de pipette toucher le liquide dans le puits, remplacer des conseils avant de passer à la colonne ou la ligne suivante.
  8. Mix échantillons 5x et transfert 5 pl de chaque échantillon sur le papier DE-81. Air sécher 10 min.
  9. Laver les blots avec 5x SSC 1x (chlorure de sodium, le citrate de sodium), puis 2 fois avec 90% d'éthanol à 5 ​​min par lavage. Laisser sécher à l'air.
    1. Placez chaque tache dans un récipient de lavage séparée, comme une boîte de rangement en sandwich, ajouter suffisamment de tampon de lavage (1x SSC ou 90% EtOH) pour couvrir blot, et agiter pendant 5 min.
    2. Verser le tampon de lavage dans le récipient et répétez séparé. Remarque: Les 3 premiers lavages sont considérés comme radioactifs et doivent être éliminés de façon appropriée. Les deux derniers lavages peuvent être éliminés régulièrement.
  10. Une fois sec, voitureefully envelopper blot à Saran wrap et exposer à un phosphoscreen dans une cassette étanche nuit à température ambiante.
  11. Analyser phosphoscreens avec un phosphorimager et quantifier les transcriptions radioactives.
  12. Tracez un cercle autour de chaque signal radioactif en utilisant un logiciel OptiQuant. Représenter les valeurs Unité numérique de la lumière (DLU) pour générer des courbes de réplication.
  13. Afin de générer réplication scores de capacité, les valeurs DLU étaient journal 10 -transformed et les pentes ont été calculées en utilisant le jour 2, 4, et 6 points dans le temps. pentes de réplication sont ensuite divisés par la pente de WT MJ4 en ordre générer réplication scores de capacité. Il est important de normaliser sur la base des valeurs MJ4 WT obtenus à partir de la même plaque RT à réduire la variabilité intra-essai.

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Résultats

Pour exécuter correctement ce protocole, ce qui crée un plasmide proviral capable d'assembler entièrement fonctionnels, infectieuses chimères Gag-MJ4, un grand soin doit être pris pour générer des amplicons PCR appropriées. Déterminer si le PCR a généré l'amplicon gag de taille appropriée est cruciale. Les produits doivent être à moins de 100 paires de bases (pb) de l'amplicon d'environ 1700 pb représenté sur la figure 1A. La longueur exacte de ce fragment sera variable en fonct...

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Discussion

En raison de la longueur et de la nature technique de ce protocole, il ya plusieurs étapes qui sont essentielles à la fois pour la construction réussie de chimères plasmides Gag-MJ4 ainsi que pour la quantification de la capacité de réplication virale. Bien que la stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour l'introduction de gènes gag étranger dans MJ4 décrite dans le présent protocole a de nombreux avantages par rapport aux méthodes basées sur la recombinaison utilisées précédemment, le p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les chercheurs remercient tous les volontaires en Zambie qui ont participé à cette étude et tout le personnel du projet de recherche sur le VIH Zambia Emory à Lusaka qui a rendu cette étude possible. Les chercheurs tiennent à remercier Jon Allen, Smita Chavan et Mackenzie Hurlston pour leur assistance technique et la gestion des échantillons. Nous tenons également à remercier le Dr Mark Brockman pour ses discussions et son généreux don des cellules GXR25.

Cette étude a été financée par R01 AI64060 et R37 AI51231 (EH) et l’Initiative internationale pour un vaccin contre le sida. Ce travail a été rendu possible en partie grâce au généreux soutien du peuple américain par l’intermédiaire de l’Agence des États-Unis pour le développement international (USAID). Le contenu relève de la responsabilité des auteurs de l’étude et ne reflète pas nécessairement les opinions de l’USAID ou du gouvernement des États-Unis. Ce travail a également été soutenu, en partie, par le centre de virologie du Centre Emory pour la recherche sur le sida (subvention P30 AI050409). DC et JP ont été soutenus en partie par Action Cycling Fellowships. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de base du Centre national de recherche sur les primates de Yerkes (2P51RR000165-51). Ce projet a également été financé en partie par le National Center for Research Resources P51RR165 et est actuellement soutenu par l’Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs PCR
GOF : 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNA Custom Oligo25 nmol, dessalé standard
VifOR : 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNA Custom Oligo25 nmol, dessalage standard
GagInnerF1 : 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalé standard
BclIDegRev2 : 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
MJ4For1b : 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
MJ4Rev : 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
BclIRev : 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
GagF2 : 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
For3 : 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
GagR6 : 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
Rev3 : 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNA Custom Oligo25 nmol, dessalage standard
Rev1 : 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalage standard
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Eau sans nucléaseFisherSH30538FSFabriqué par Hyclone
QIAamp Mini Kit d’ARN viralQiagen52906
Simport PCR 8 Tubes de bandelettes, bleu (capuchon plat)DaiggerEF3647BX
SuperScript III système RT-PCR en une étapeLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II ADN polyméraseFisherF-549L
PCR Nucléotide MixRoche 4638956001
Agarose, haute résistance au gelFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb Échelle d’ADNFisherPRG5711Fabriqué par Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel et Système de nettoyage PCRPromegaA9282
Lames de rasoir, à simple tranchantFisher12-640Fabriqué par Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Réactifs de clonage
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Broth, LennoxFisherBP1427-2
Stérile 100 x 15 mm polystyrène Boîtes de PétriFisher08-757-12
Ampicilline sel sodiqueSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Tubes à fond rond en polypropylèneBD Biosciences
endonucléase de restriction NgoMIVNew England BioLabsR0564L
Endonucléase de restriction BclINew England BioLabsR0160L
Endonucléase de restriction HpaINew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/&mu ; lRoche10799009001
JM109 cellules compétentes, >108 cfu/&mu ; gPromegaL2001
PureYield plasmidique miniprep systemPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Blue Light TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrifugeBeckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl cleaner/disinfectantFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Fabriqué par Promega
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Plaques Costar, 6 puits, platesFisher07-200-83Fabriqué par Corning Life
Plaques Costar, 24 puits, platesFisher07-200-84Fabriqué par Corning Life
Plaques Costar, 96 puits, rondesFisher07-200-95Fabriqué par Corning Life
Flasks, Dessus du filtre Corning/col incliné, 75 cm2Fisher 10-126-37
Fioles, Dessus du filtre Corning/col incliné, 150 cm2Fisher10-126-34Fabriqué par Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, bouchon bleuFisher14-432-22Fabriqué par BD Biosciences
Tubes coniques, 15 ml, bouchon bleuFisher14-959-70CFabriqué par BD Biosciences
Trypsine-EDTAFisherMT25052CIFabriqué par Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Pénicilline/ Streptomycine/Glutamine, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS avec magnésium et calcium, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS sans magnésium et calciumLife Technologies/Invitrogen20012-050
Tubes Sarstedt, couleurs assortiesSarstedt72.694.996
Plateaux de réservoir pour Multicanaux, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 microplaque à fond en V bien transparent traité pour culture tissulaireFisher07-200-96Fabriqué par Corning Life
HEPES, tampon de 1 m SolutionLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, défini, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Fabriqué par Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25 % en H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Solution de chlorure de magnésiumSigma-AldrichM1028-100ML
Solution de formaldéhyde, pour la biologie moléculaire, 36,5 %Sigma-AldrichF8775-500ML
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydratéSigma-AldrichP9387-100G
Hexacyanoferrate(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Centrifugeuse Allegra X15-RBeckman Coulter
TC10 Microscope inverséBio-Rad1450001
VistaVisionVWR
Réactifs de dosage de la de la transcriptase inverse
dTTP, [&alpha ;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8,0Life Technologies/Invitrogen15568025Doit être ajusté à pH 7,8 avec KOH
2 M Chlorure de potassium (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust à 1 M solution
0,5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Acide polyadénylique (Poly rA) sel de potassium  ;Midland Reagent Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, écran phosphorescent super résolution, petitPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plaque modèle (M) PolycarbonateFisher07-200-245Fabriqué par Corning Life
Corning Ruban d’étanchéité en aluminium à microplaques à 96 puits, non stérileFisher07-200-684Fabriqué par Corning Life
Papier d’échange d’anions DE-81Whatman3658-915
Citrate trisodique dihydratéSigma-AldrichS1804-1KG
Chlorure de sodiumFisherS671-3
Cassette d’autoradiographieFisherFB-CA-810
Cyclone stockage phoshpor écranPackard
352059 Compteur de cellules automatisé 392932

Références

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