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Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

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DOI :

10.3791/51518

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18 août 2014

 , 
1NYU Neuroscience Institute, New York University School of Medicine, 2Brain and Mind Research Institute, Weill Cornell Medical College

Dans cet article

Résumé

Cette procédure montre comment cibler les interneurones dans le cerveau antérieur de souris en développement au moyen de l’électroporation in utero. Cette technique s’est avérée particulièrement efficace pour obtenir une expression génique sélective dans des sous-types d’interneurones destinés aux couches superficielles du cortex.

Résumé

L'étude de système nerveux central (SNC) maturation repose sur le ciblage génétique des populations neuronales. Cependant, la tâche de restreindre l'expression de gènes d'intérêt à sous-types neuronaux spécifiques s'est avérée remarquablement difficile en raison de la rareté relative des éléments spécifiques de promoteurs. Interneurones GABAergiques constituent une population neuronale avec une grande diversité morphologique et génétique. En effet, plus de 11 sous-types différents d'interneurones GABAergiques ont été caractérisées dans le cortex de souris 1. Nous présentons ici un protocole adapté pour le ciblage sélectif des populations GABAergiques. Nous avons obtenu un ciblage sélectif de sous-type des interneurones GABAergiques en utilisant l'élément activateur de la transcription à homéoboîte facteurs Dlx5 et Dlx6, des homologues de la moins distale (Dll) gène Drosophila 2,3, pour entraîner l'expression de gènes spécifiques par le biais électroporation in utero.

Introduction

La majeure partie des interneurones GABAergiques corticaux proviennent de deux structures embryonnaires transitoires nommés les éminences ganglionnaires médianes et caudales (MGE et CGE respectivement) 4. Parvalbumine et la somatostatine exprimer interneurones proviennent de la MGE alors Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) et Reelin (Re) exprimant interneurones proviennent de la CGE. Ces sous-types interneurones peuvent être distingués par leur date de naissance. MGE sous-types dérivés sont nés entre le jour embryonnaire 9.5 (de E9.5) et E16,5 5,6. En revanche, les interneurones CGE dérivés sont nés de E12.5 par a 18,5 avec leur production culminant à E15.5 6. Le ciblage génétique de cette population née fin, cependant, reste insaisissable.

Les distale moins (Dlx) gènes murins sont exclusivement exprimés dans le cerveau antérieur ventral développement 3. Interneurones GABAergiques et les neurones de projection du striatum mais cellules pyramidales corticales pas exprimer Dlx1, 2,5, et 6 gènes à des stades de développement précoces 3. En effet, les gènes Dlx sont exprimés dans la zone sous-ventriculaire MGE et CGE (SVZ) dans tous les progéniteurs GABAergiques. L'expression de ces gènes se limite à sélectionner les sous-types de stades post-mitotiques 9.7. Preuves expérimentales antérieures ont montré que l'élément Dlx5 / 6 activateur permet le ciblage sélectif de lignées GABAergiques dans des modèles de souris transgéniques 2. Nous avons testé l'utilisation de l'un de ces éléments amplificateurs dans le contexte de l'expression épisomique dans le cerveau de souris en développement. Nous avons cloné sous l'élément Dlx5 / 6 amplificatrice avec un promoteur minimal et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) dans un bluescript (BS) squelette plasmidique (Figure 1). Nous avons introduit le plasmide au moyen d'électroporation in utero à E15.5 pour cibler sélectivement Cr, VIP et sous-types République 3,8,10. Notre technique permet clairsemée électroporation, ce qui facilitela reconstruction des caractéristiques morphologiques des cellules de singe. En outre, les niveaux exceptionnellement élevés d'expression de gènes dans les neurones corticaux GABAergiques permet pour des études fonctionnelles. Nous avons effectué la perte et le gain d'études de fonction à l'aide de plusieurs gènes de type sauvage et négatifs dominants 11.

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Protocole

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les règlements et les directives du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de la NYU School of Medicine.

Les souches de souris
Webster souris femelles suisses fournies par TACONIC ont été utilisés pour ces expériences. Afin de cibler spécifiquement les interneurones de la couche superficielle, embryons E15.5 ont été utilisés.

Remarque: Le plasmide utilisé dans ce travail (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 ug / ul) ont été générés en utilisant des techniques de clonage standard. L'ADNc de eGFP a été clone dans un Dlx5 / Pmin-6-polyA plasmide. Ce plasmide est disponible sur demande (demarn02@nyumc.org).

1 Préparation de microinjection Pipettes

  1. Définir l'extracteur de chaleur # 2-860.
  2. Placer et fixer le capillaire de verre près du filament. Vérifiez que le diamètre extérieur (OD) de la pipette est d'environ 30 um.
  3. Appuyez sur le bouton "tirer".
  4. Retirez délicatement le capillaire. La partie inférieure est l'aiguille. Jeter la partie supérieure.

2. Procédure anesthésie

  1. Préparer une chambre d'isoflurane contenant. Remarque: L'isoflurane est l'anesthésique privilégié en raison de son action rapide et une faible incidence d'effets secondaires. Pentobarbital est une autre option; cependant, la tolérance de ce médicament est variable et peut conduire à un taux de mortalité supérieur à l'isoflurane.
  2. Régler le débit de l'isoflurane à 4-5% dans 0,5-1 L / min O 2.
  3. Assurez-vous que la valve de la chambre est ouverte alors que la vanne de l'adaptateur de tête est fermé.
  4. Placez la souris enceinte dans la chambre.
  5. Laissez la souris pour aller sous l'effet de l'anesthésie. Cela prendra environ 2-3 min. Vérifiez le taux de respiration. Si la souris commence hyperventilation, réduire la dose d'isoflurane.
  6. Après la souris est anesthésiée, retirez rapidement à partir de la chambre. Placez-le face ventrale sur le coussin chauffant et insert la tête dans le masque qui va continuer à fournir de l'isoflurane dans toute la chirurgie. Assurez-vous de passer le flux d'isoflurane de la chambre à la tubulure reliant le morceau d'adaptateur de tête. Mettre une goutte de lubrifiant oculaire dans chaque œil et fermez les yeux.
  7. Régler le coussin chauffant à 36 ° degrés C pour réduire au minimum l'hypothermie.
  8. Vérifier l'absence de réflexes du pied et de la queue en pinçant les pattes arrière et la queue.

3. chirurgie

  1. Nettoyer la peau qui recouvre l'abdomen avec 70% d'éthanol.
  2. Utilisez une pince pour tirer la peau vers le haut. Après chaque intervention, laver tous les instruments avec du détergent et de l'eau, et stérilisé à 72 ° CO / N.
  3. Faire une petite incision verticale (environ 2 cm) le long de la ligne médiane de départ à mi-chemin entre les troisième et quatrième paires de glandes mammaires. Utilisez des ciseaux fins de chirurgie. Prenez soin de ne pas endommager la paroi abdominale.
  4. Séparer la peau de la douceur péritoine.
  5. Visualiser les artèreset les veines sur la paroi abdominale. Faire une autre incision verticale de 2 cm à travers le péritoine (en évitant les vaisseaux) pour exposer la cavité abdominale.
  6. Serrer la peau et la paroi abdominale de chaque côté en évitant le serrage des artères. Remarque: Si les artères sont accidentellement percés, sacrifier immédiatement l'animal en effectuant dislocation cervicale ou surdosage d'isoflurane.
  7. Pré chauffer la PBS stérile à 37 ° C. Couvrir les colliers avec du PBS humides Kim lingettes.
  8. Hydrater la cavité abdominale exposée avec du PBS. Répétez cette étape plusieurs fois pendant la chirurgie.
  9. En utilisant des pinces rondes, tirez doucement sur la chaîne embryonnaire (E15.5) de la cavité. Laissez la chaîne reste sur les lingettes humides. Commencer par exposition de la moitié de la première utérus. Une fois que les embryons qui s'y trouvent sont électroporation, le ramener à l'intérieur, puis de travailler sur le second semestre.

4. électroporation

  1. Continuer à utiliser des forceps rondes de manipuler les embryons.
  2. Visualize les ventricules latéraux. Les ventricules latéraux courent le long de la ligne médiane (figure 1b).
  3. Ajouter vert Fast (stock: 10% p / v) de la solution d'ADN pour un mélange 01:20 de visualiser pendant l'injection. Préparer la solution d'ADN par dissolution du culot obtenu à partir d'un protocole de purification maxi-prep standard dans de l'eau distillée.
  4. Utilisation micropipettes pré tirés avec un piston pour injecter 1 ml de solution d'ADN (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) avec Fast Green. Couper l'extrémité de la micropipette avec une pince amende # 5 (Dumont) de laisser 6 mm de longueur à partir du début de l'épaule à l'extrémité de la pointe de l'aiguille avant de charger la pipette. Maintenir la tête de l'embryon avec des pincettes rondes. Entrez le cerveau avec la pipette à un angle de 45 ° en visant le ventricule latéral situé à proximité de la ligne médiane. Si l'aiguille pénètre dans le ventricule, se rétracter lentement la pipette que vous utilisez le piston pour injecter l'ADN. Le ventricule doit devenir vert lorsque lesolution commence à le remplir. À ce stade, arrêter de bouger la pipette et injecter 1 ml d'ADN. Doucement, retirer la pipette.
  5. Réglez le électroporateur de CUY21 cinq 45V impulsions de 50 ms espacées de 950 ms.
  6. Utilisez 5 mm électrodes des palettes pour les embryons de E15.5. Plonger les électrodes dans du PBS pour assurer une transmission efficace du courant.
  7. Placer les palettes d'électrodes autour de la tête de l'embryon de la palette sur le ventricule positif contenant la solution d'ADN. Baisser légèrement la palette positif en ce qui concerne la négative à créer un courant ventral par les éminences ganglionnaires. Cette manipulation permet de minimiser l'expression ectopique dans les cellules pyramidales.
  8. Après avoir placé les électrodes, délivrer une impulsion en appuyant sur la pédale de fois.
  9. Retirez les électrodes et essuyez-les. Répéter les étapes 4.6 à 4.9 de chaque embryon.
  10. Après électroporation tous les embryons, verser 3 ml de PBS dans la cavité abdominale et les retourner à la cavité abdominale.
  11. Première suture la paroi abdominale avec une aiguille courbe et 5-0 suture de soie et la peau. Appliquer la lidocaïne (4%) sur la plaie. Administrer 120 mg / kg de l'aspirine péritoine intra pour l'analgésie.
    Remarque: L'ensemble de la procédure doit être effectuée en 20 minutes ou moins. Il est recommandé que les débutants ne électroporer quelques embryons de garder le temps de fonctionnement court. Chirurgies prolongé diminue le taux de survie des embryons.
  12. Retirer l'animal de la tubulure d'anesthésie et permet la récupération sur le coussin chauffant sur un papier chiffon.
  13. Animaux Retour à la cage, le garder sur le coussin chauffant à 37 ° C et de surveiller l'état de santé. Les animaux tolèrent généralement la chirurgie bien et commencent à se déplacer lentement peu de temps après leur retrait de la tubulure de l'anesthésie. Si le saignement excessif ou de la léthargie est observé, sacrifier l'animal immédiatement en effectuant IACUC approuvé les procédures d'euthanasie tels que la dislocation cervicale ou surdosage d'anesthésie.
  14. Cage Retour à la soutenancerium. Les femelles donnent naissance naturellement.

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Résultats

Nous avons adapté la technique d'électroporation in utero pour atteindre type de cellule ciblage spécifique des neurones échéance. Pour conduire l'expression de eGFP dans les interneurones CGE dérivés, nous avons utilisé l'élément amplificateur de Dlx5 / 6 et limité nos injections à E15.5, la scène où la majorité des interneurones CGE dérivés sont générés. Nous avons effectué l'analyse à P8 et P15 11 (figures 1 et 2). Nous avons confirmé l...

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Discussion

Limites de la technique

Bien que cette technique permet l'analyse de cellule autonome de processus cellulaires, il n'est pas adapté à l'analyse de la population. Les électroporations sont très rares avec moins d'un millier de cellules par électroporation par le cerveau. En conséquence, la technique ne peut pas être utilisé pour évaluer les conséquences sur le comportement résultant de la manipulation génétique des interneurones CGE dérivés.

Bien é...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Lihong Yin pour l'assistance technique. NVD est récipiendaire d'un Prix du jeune chercheur NARSAD et est également soutenu par des subventions du NIH (5 K99 MH095825-02). La recherche dans le laboratoire Fishell est soutenu par l'Institut national de la santé, Institut national de santé mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) et la Fondation Simons.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Électroporteur avec pédaleProtech InternationalCUY21
5 mm palettes électrodes  ;Protech InternationalCUY650P5
Coussin chauffantKent ScientificDCT-15
Sutter Instruments P30 Extracteur  ;Sutter Instruments3282322
Fluovac Systèmes d’anesthésieHarvard Appareil726425
Ciseaux opératoires délicats 4.75 » Straight Sharp/SharpRobozRS-6702
5-0 Silk Black Braid 18 » C-1 Box 36  ;RobozSUT-1073-21
Micro Clip Pince d’Application 5.5"RobozRS-5410
2 Ciseaux à pinceRobozRC-4894
Pince de maintien  ;Fine Science Tools11031-15
Tube capillaire en verre  ;FHC27-30-0Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID
Fast GreenSigma-AldrichF7258  ;
Stérile PBSLife Technologies20012-027

Références

  1. Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
  2. Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
  3. Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
  4. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
  5. Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
  7. Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
  8. Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
  9. Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
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  11. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
  12. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
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Mots-clés

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