L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation. Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.
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Article de méthode
Comprendre organogenèse précoce aide d'un simplifié
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’organogenèse est l’étude de la façon dont les organes sont spécifiés et acquièrent ensuite leur forme et leurs fonctions spécifiques au cours du développement. L’embryon de Xenopuslaevis est très utile pour l’étude de l’organogenèse car sa grande taille le rend très approprié pour identifier les organes dès les premières étapes de l’organogenèse. À l’heure actuelle, la principale méthode utilisée pour identifier un organe ou un primordium spécifique est l’hybridation in situ sur monture entière avec des sondes d’ARN antisens marquées spécifiques à un gène exprimé dans l’organe d’intérêt. De plus, il est relativement facile de manipuler des gènes ou des voies de signalisation chez le xénope et l’hybridation in situ permet ensuite de rechercher des changements dans la présence ou la morphologie d’un organe cible. L’hybridation in situ de l’ensemble du mont est un protocole de plusieurs jours comportant de nombreuses étapes. Ici, nous fournissons un protocole simplifié avec un nombre réduit d’étapes et de réactifs utilisés qui fonctionne bien pour les tests de routine. Les robots d’hybridation in situ ont grandement facilité le processus et nous détaillons comment et quand nous utilisons cette technologie dans le processus. Une fois l’hybridation in situ terminée, capturer la meilleure image du résultat peut s’avérer frustrant. Nous fournissons des conseils sur la façon d’optimiser l’imagerie des résultats d’hybridation in situ. Bien que le protocole décrive l’évaluation de l’organogenèse chez Xenopus laevis, le même protocole de base peut presque certainement être adapté à Xenopus tropicalis et à d’autres systèmes modèles.
Introduction
Le profil d’expression d’un gène spécifique est une information importante pour déterminer le rôle potentiel de ce gène dans le développement d’un organe ou d’un type de cellule spécifique. En termes simples, s’il n’est pas exprimé au bon moment et au bon endroit, il est peu probable qu’il joue un rôle clé. Chez le xénope, comme chez la plupart des embryons précoces, le test le plus couramment utilisé pour détecter l’expression d’un gène est l’hybridation in situ en monticule entier à l’aide de sondes d’ARN antisens marquées. L’utilisation de la coloration des anticorps pour évaluer l’expression d’un gène chez le xénope devient de plus en plus courante à mesure que les chercheurs découvrent des anticorps, généralement élevés contre des protéines de mammifères, qui réagissent de manière croisée à l’homologue du xénope ou génèrent leur propre 1-3. Cependant, la grande majorité des études sur l’organogenèse du xénope utilisent encore des sondes d’ARN antisens. Lorsque des anticorps sont utilisés, chaque anticorps individuel nécessite souvent une optimisation pour la concentration ou les protocoles de fixation de l’anticorps primaire. En revanche, le protocole pour les hybridations in situ est essentiellement invariant pour différentes sondes. Le concept de base est relativement simple et un excellent protocole standard a été bien établi 4. Notre protocole est une version simplifiée du protocole original 4 qui offre toujours une excellente détection des modèles d’expression génique dans l’embryon précoce. Les embryons sont fixés puis préparés pour l’hybridation en modifiant les solutions et les températures de sorte qu’il permet une liaison à haute rigueur de la sonde d’ARN antisens marquée à son ARNm cible. La sonde non liée est emportée et les embryons sont ensuite préparés pour la liaison d’un anticorps contre l’étiquette sur les sondes d’ARN. L’excès d’anticorps est ensuite éliminé et une réaction enzymatique de couleur est utilisée pour localiser l’endroit où la sonde d’ARN est liée dans l’embryon. Il existe maintenant un certain nombre de lignées transgéniques de Xenopus qui déterminent l’expression de protéines fluorescentes dans des tissus spécifiques et celles-ci sont disponibles dans les centres de stockage de Xénope tels que la National Xenopus Resource à Woods Hole. Bien que très utile pour de nombreuses expériences nécessitant d’examiner l’organogenèse chez les embryons vivants, cette option nécessite un logement séparé pour les lignées transgéniques.
L’hybridation in situ permet de délimiter clairement l’endroit où des organes ou des types de cellules spécifiques se formeront au début de l’embryon (Figure 1). La technique est remarquablement sensible étant donné que l’on peut détecter l’expression génique dans un petit nombre de cellules d’un seul embryon 5. Cependant, l’hybridation in situ en utilisant l’intensité de la coloration colorimétrique n’est pas considérée comme quantifiable car la réaction de couleur n’est pas linéaire. Malgré la difficulté de quantifier l’intensité de la coloration, les changements d’expression sont souvent assez perceptibles ; en particulier lorsque l’hybridation in situ montre des augmentations ou des diminutions quantifiables de la taille des domaines d’expression 6,7.
Les avantages évidents de l’hybridation in situ en monture entière en font un test essentiel dans l’étude du développement précoce. Cependant, il s’agit d’une tâche chronophage qui nécessite de nombreuses étapes sur plusieurs jours. Ce protocole est une version simplifiée du protocole standard qui élimine plusieurs étapes sans réduire la qualité du résultat in situ. La simplification élimine également les sources de variabilité, ce qui facilite le dépannage si une hybridation in situ n’est pas optimale. Plus précisément, nous avons éliminé l’utilisation des traitements à base de protéinase K et d’ARNASE de l’embryon, deux étapes qui peuvent dépendre de la qualité du réactif et peuvent également réduire l’intensité du signal en cas d’exagération. Le protocole permet également de réaliser une certaine économie en éliminant l’utilisation de plusieurs réactifs. Enfin, ce protocole fournit également quelques lignes directrices simples pour améliorer la capture d’images des résultats d’hybridation in situ. Bien que ce protocole soit optimisé pour le travail sur les embryons de xénope, il est probable qu’au moins certaines des simplifications seront applicables aux travaux d’hybridation in situ dans d’autres systèmes embryonnaires.
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Protocole
1. Préparation d'embryons
- Si pas fait régulièrement dans le cadre de la culture de l'embryon, de-gelée les embryons en utilisant 2,5% cystéine, pH 8,0 avant la fixation 8. Même se il ne est pas absolument nécessaire, il est utile de puis supprimer manuellement l'enveloppe de fertilisation avant la fixation à l'aide de pinces fines.
- Utilisez pipettes Pasteur en verre pour transférer les embryons. La pipette ne est pas assez large pour transférer les embryons afin d'utiliser un stylo de diamant pour couper la pipette en verre à un point assez large pour ramasser un embryon. Éliminer les bords tranchants des pipettes après la coupe en passant rapidement la pointe de coupe à travers la flamme d'un brûleur Bunsen pour faire fondre les bords tranchants.
NOTE: Des précautions doivent être prises, que le verre peut encore être assez chaud pour causer des brûlures, même si elle semble avoir refroidi par inspection visuelle.
- Utilisez pipettes Pasteur en verre pour transférer les embryons. La pipette ne est pas assez large pour transférer les embryons afin d'utiliser un stylo de diamant pour couper la pipette en verre à un point assez large pour ramasser un embryon. Éliminer les bords tranchants des pipettes après la coupe en passant rapidement la pointe de coupe à travers la flamme d'un brûleur Bunsen pour faire fondre les bords tranchants.
- Effectuer la fixation de l'embryon par étapes. Tout d'abord, préparer des flacons en verre pour une utilisation dans l'embryon fixation. Utilisez ces flacons pour toutes les étapes, y compris finalele stockage. Utilisez des flacons qui sont claires avec un bon joint en téflon dans le couvercle, permettant de surveiller les embryons durant toutes les étapes du processus. Étiqueter les flacons avec des informations expérimental approprié en utilisant un marqueur permanent, puis couvrir l'étiquette de ruban adhésif transparent, comme marqueur même permanente sera perdu au cours de la procédure en raison de l'utilisation d'alcools et d'autres solvants.
- Utilisez Mempfa de fixer les embryons. Faites un stock de 8% de paraformaldehyde dans des lots de 50 à 100 ml à la fois. Utiliser environ 75% de la H 2 O requis et de la chaleur à 50-60 ° C, qui est nécessaire pour obtenir le paraformaldéhyde en solution.
NOTE: Cette solution est légèrement différente de la Memfa utilisé dans les anciennes versions de protocole publié en ce qu'il utilise paraformaldéhyde plutôt que le formaldéhyde. - Ajouter 2-3 gouttes de NaOH 10N ou jusqu'à ce que le pH est d'environ 7,5 (l'utilisation du papier pH pour vérifier pH). Paraformaldéhyde est très toxique, donc générer la solution mère dans une hotte. Une fois que le parale formaldéhyde est en solution, filtrer la solution à travers un papier Whatman dans un récipient frais et ajouter de H 2 O au volume final. Si nécessaire, stocker la solution de paraformaldehyde à 4 ° C pendant 1-2 semaines.
- Assembler les composants restants de la solution de fixation Mempfa (tableau 1). Assurez-vous que la concentration de travail finale de paraformaldéhyde est de 4%. Conservez tous les composants de la solution de fixation à 4 ° C que les stocks.
- En utilisant une pipette en verre taillé, fixer les embryons en ajoutant les embryons aux flacons en verre marquées qui ont été remplis avec les environ 3-4 ml de solution Mempfa (tableau 1). Évitez de fixer plus de 20 à 30 embryons par flacon. Ajouter les embryons avec un minimum de transfert de liquide à partir du milieu de l'embryon. Fixer embryons en solution Mempfa pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Pour les structures de l'endoderme effectuer la fin de situs sur isolées manuellement intestinale et endoderme dérivés 9,10, Ce qui permet une bonne pénétration de la sonde et évite aussi cavité coloration.
- Stocker une solution de 100% méthanol à -20 ° C. Après la fixation de paraformaldehyde, remplacer la solution Mempfa avec environ 4 ml de -20 ° C, 100% de méthanol pour le stockage des embryons.
- Agiter le flacon après l'addition du methanol pour empêcher les embryons de coller au verre ou à d'autres embryons. Aussi, assurez-vous que les flacons sont hermétiquement fermés parce que le méthanol peut se évaporer dans le congélateur le temps si lâche.
REMARQUE: Les embryons peut être stocké pendant au moins un an, et plus probablement, dans le methanol avant la coloration, sans perte de la qualité de l'hybridation in situ.
- Utilisez Mempfa de fixer les embryons. Faites un stock de 8% de paraformaldehyde dans des lots de 50 à 100 ml à la fois. Utiliser environ 75% de la H 2 O requis et de la chaleur à 50-60 ° C, qui est nécessaire pour obtenir le paraformaldéhyde en solution.
2. Préparation de la sonde
- Utilisation 1-2 ug d'ADN matrice pour rendre les sondes marquées à la digoxigénine. Couper le plasmide contenant la séquence d'ADN appropriée à l'extrémité 5 'du gène d'intérêt avec une enzyme de restriction appropriée pour that vecteur pour générer des sondes antisens.
NOTE: Le plasmide devrait avoir un site de liaison d'ARN polymerase approprié (par exemple T7, T3 ou SP6). - Permettre à l'ADN, de l'eau, mélanger et NTP tampon de polymerase se réchauffer à température ambiante avant l'assemblage de la réaction de synthèse de la sonde. Ajouter les composants de la réaction de synthèse d'ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml dans l'ordre indiqué dans le Tableau 2. Ajuster le volume de l'eau ajoutée pour amener le volume total de la réaction de synthèse de la sonde de 20 ul. Monter la réaction à la température ambiante car les composants du tampon de polymerase peuvent précipiter l'ADN de matrice lorsque des concentrations élevées et froid.
- Incuber la réaction de transcription pendant 2 heures à 37 ° C.
REMARQUE: Les incubations d'un peu plus de deux heures conduit à aucun effet indésirable, mais aussi montrent peu de rendement accru. Si incubé pendant une heure, le rendement sera réduit mais toujours suffisant pour faire une bonne sonde.- Dans l'attente de la réaction de transcription à la fin, faire un gel d'agarose qui sera utilisé pour tester la qualité de la sonde. Faire fondre 1 pg d'agarose dans 100 ml de tampon TAE 1X (voir tableau 1) en chauffant la solution au point d'ébullition. Retirer la solution de la chaleur lorsque la poudre d'agarose est complètement dissous.
- Ajouter 2 ul de bromure d'éthidium solution de réserve (10 mg / ml) à environ 100 ml de gel d'agarose où l'agarose a refroidi à environ 60 ° C pour permettre la visualisation de l'ARN sous rayonnement ultraviolet (UV).
NOTE: Cette solution de gel d'agarose peut être conservé dans un incubateur à 60 °, de sorte que les gels futurs peuvent être versés sans fusion répétée. Prenez soin de manipuler le bromure d'éthidium en raison de la toxicité potentielle.
- Ajouter 1 pi ADNase I (RNAse à niveau libre) à la réaction de transcription après l'incubation de 2 heures et incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 37 ° C pour éliminer la matrice d'ADN.
- Retirer 1 ul du mélange réactionnel devérifier sur le gel d'agarose-TAE à 1% et le reste (20 ul) ajouter 80 ul de SDS à 1% dans du tampon TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 pi de 5 M d'acétate de NH 4 et 220 ul de l'éthanol froid. Vortex vigoureusement le mélange et mettre de côté sur la glace jusqu'à ce que les résultats de la vérification de la qualité de l'ARN sont connus.
- Exécutez les 1 ul d'ARN retirés avant la précipitation sur le gel d'agarose-TAE 1%. Pour faciliter le chargement sur le gel, ajouter 5.4 ul d'eau et 1 pl de colorant de charge standard pour l'ARN. Voir l'ARN sur le gel en utilisant un transilluminateur lumière UV afin de vérifier la qualité de la sonde (voir la discussion).
- Précipiter l'ARN restant qui a été mis de côté sur la glace à l'étape 2.5 en faisant tourner dans une microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 10 à 15 min. Prélever le surnageant avec une pipette en verre étiré et laisser sécher brièvement.
- Remettre en suspension le sonde avec 1 ml de tampon d'hybridation d'ARN (tableau 1) dans le tube Eppendorf. Vortex et briefly chauffer de nouveau le tube à 37 ° C et vortex. Transférer la solution de sonde à un 15 ml vis tube en polystyrène de bouchon et remplir 7-10 ml avec un tampon d'hybridation d'ARN. Remarque: La sonde peut être diluée (à 10 fois dilution supplémentaire peut encore fonctionner) ce qui entraîne souvent faible bruit de fond mais les réactions de coloration seront également prendre plus de temps.
3. hybridation in situ
- Prendre les embryons qui ont été stockées à -20 ° C dans du méthanol et on laisse réchauffer à température ambiante. Effectuez toute la procédure dans les flacons de verre. Si les embryons différents d'un groupe vont être regardé par différentes sondes, gardez-les dans un seul flacon juste avant les sondes sont ajoutés pour réduire la variabilité et du travail le premier jour.
- Réhydrater les embryons à travers une série de méthanol comme indiqué dans le tableau 3 (voir le tableau 1 pour les recettes de lavage) en préparation pour l'addition de la sonde. Agitez doucement le embryos après chaque changement pour se assurer qu'ils ne sont pas collées sur les côtés ou l'autre, et le rock les embryons en montant les flacons sur une nutator. Lors du transfert des liquides, vérifier l'intérieur des bouchons pour assurer que les embryons ne ont pas été piégée.
- Une fois dans la solution de la sonde, les embryons se hybrider pendant une nuit comme décrit dans le tableau 3.
- Retirer la solution de la sonde. Enregistrer la sonde utilisée par le stockage dans un 15 ml vis tube en polystyrène de bouchon, marqué avec la date et le nombre de fois que la sonde a été utilisé, à -20 ° C.
REMARQUE: La même sonde peut être réutilisé plusieurs fois pour la suite des hybridations in situ jusqu'à ce que les réactions colorimétriques commencent à prendre un temps anormalement long pour atteindre l'intensité désirée.- Une fois la sonde est enlevée, préparer les embryons pour la coloration des anticorps contre la sonde à travers la série de lavages décrites dans le tableau 4. Changer la température selon les besoins (tableau 4) en déplaçant til nutator, avec des flacons d'embryons attachés, directement dans les fours d'hybridation qui sont mis à la température appropriée.
- Compléter le volume approprié de la MAB + HTSS + BR + anticorps anti-DIG (tableau 4) au moment où les embryons sont incubés dans le MAB + HTSS + BR solution de blocage de telle sorte que l'anticorps est bloqué avant d'ajouter à la embryons. Faire les solutions de blocage frais sur la journée d'utilisation.
- Retirer la solution d'anticorps et de commencer lavages comme indiqué dans le tableau 5 qui suit une nuit d'incubation avec l'anticorps. Effectuer au moins douze lavages 30 min afin de préparer pour la coloration avec le substrat de la phosphatase alcaline et réduire l'arrière-plan le plus possible. Utilisez soit MAB tampon ou une solution OTC (tableau 1) pour les étapes de lavage.
REMARQUE: solution de TBT est TTW qui a 2 mg / ml de BSA ajouté.- Remplacer la dernière solution de lavage avec le substrat Violet de phosphatase alcaline BM. Effectuez les réac de colorationtion, soit à température ambiante ou à 37 ° C.
NOTE: La coloration est plus rapide à 37 ° C, mais si on les laisse pendant la nuit, fond inacceptable coloration peut souvent être le résultat. Les réactions de coloration souvent exigent coloration pendant la nuit et la température ambiante est plus sûr pour cela. - Si de plus amples coloration est nécessaire et la solution de pourpre BM prend une couleur bleue, remplacer la solution de coloration avec des produits frais BM Violet et mettre les tubes dans 37 ° C. Si l'ARNm cible est très abondante, mettre les embryons dans la solution de coloration à 4 ° C pendant une nuit, puis déplacer les embryons à température ambiante ou à 37 ° C pour permettre un meilleur contrôle de la réaction de coloration.
- Surveiller les nouvelles réactions attentivement, car le temps de résultat final varie considérablement entre les différents ARN cibles. Par souci de cohérence, arrêter la réaction de coloration (voir 3.4) quand il n'y a pas de nouveaux sites d'expression résultant d'incubation plus longue. Surtout, si l'hybridation in situ est utilisée comme un testpour des expériences qui cherchent à différents groupes de traitement, utiliser en même temps pour les réactions de couleur entre traitement et de contrôle des embryons.
- Remplacer la dernière solution de lavage avec le substrat Violet de phosphatase alcaline BM. Effectuez les réac de colorationtion, soit à température ambiante ou à 37 ° C.
- Arrêter la réaction de coloration et de préparer les embryons pour le stockage et l'enregistrement de l'image en changeant les liquides comme indiqué dans le tableau 6. Ne pas secouer les embryons à ce stade car la suppression de la tache peut être visualisé comme coloration pourpre du méthanol autour des embryons.
NOTE: Souvent embryons ont une coloration bleu clair de la solution de coloration et le méthanol froid peut éliminer au moins partiellement que, bien que ce ne est pas suffisante pour éliminer fond lourde ou de la cavité coloration. Methanol froid se réfère à du methanol qui est maintenu dans un congélateur à -20 ° C.- Réhydrater les embryons et fixer la tache avec Mempfa (tableau 6). Une fois fixé, retirez le Mempfa et laver les embryons avec 25% de méthanol.
- Enlever le 25% de methanol et ajouter la solution de blanchiment si la suppression de pigment endogèneest requis. Prenez soin dans le traitement de la solution de blanchiment car il peut causer des brûlures. Observer le blanchiment de près comme cela se produit relativement rapidement et le degré de blanchiment peut être modifiée pour des effets différents (figure 2).
- Déshydrater embryons à travers une série de méthanol à 100% de méthanol pour le stockage à long terme après blanchiment, ou à transférer à PBS pour le stockage à court terme et ensuite imagerie (voir tableau 6).
4. imagerie embryons
- Une fois un embryon a terminé le processus de coloration, l'image de l'embryon afin que les informations sur l'endroit où le gène d'intérêt est exprimé est capturé pour un public plus large. Utilisez 1% agarose comme un fond pour voir embryons non dégagées.
NOTE: L'agarose donne un fond bleu / gris qui contraste bien avec l'embryon et la couleur bleue de la réaction de coloration. Il contribue également à diffuser les ombres et les réflexions qui détournent l'attention de l'embryon de distraction.- Ajouter agarose à l'eau, puis porter à ébullition jusqu'à ce que l'agarose est en solution, puis laisser refroidir à 50 avant de verser dans la boîte de Pétri. Comme avec la solution de gel TAE, stocker la solution d'agarose à 55 ° C incubateur pour des usages multiples. Verser de l'agarose à une profondeur d'environ 2 mm dans la boîte de Pétri. Si nécessaire, ajuster la profondeur d'agarose pour donner une teinte légèrement différente du fond.
- À la suite de la réhydratation de stockage dans du methanol à une solution aqueuse (PBS ou TTW), en utilisant une série de methanol, placer les embryons dans une boîte de Pétri avec la base d'agarose (voir tableau 6). Conserver la solution propre et si nécessaire, utiliser un simple filtrage pour éliminer les matières particulaires petite qui peut perturber le fond propre de bonnes images.
- À l'image des embryons de vue alternatifs, tels que de la face ventrale, coupés canaux minces dans le agarose pour se adapter à l'embryon en utilisant une pince fine et placer les embryons dans ces canaux pour l'orientation (Figure 3 ). Prenez soin de manipuler les embryons car ils sont facilement endommagés.
REMARQUE: La plupart des stades ont une position caractéristique qu'ils assument lorsqu'il est placé dans une solution. Par exemple, les embryons au stade blastula tendance à se asseoir animale vers le haut. Une fois les embryons commencent à se allonger, ils pondent de leur côté.
- Utiliser la source de lumière à fibre optique pour éclairer l'embryon à partir d'un angle faible, en créant des ombres sur l'embryon qui fournissent profondeur à l'image et aider discerner des structures de surface. Parce que le blanchiment peut éliminer pigment qui fournit des repères utiles, recourir à l'observation pour les embryons fortement blanchis.
- Effacer les embryons à l'image coloration qui est au plus profond de l'embryon, comme dans les notochorde, des poumons ou des régions du cerveau, (Figure 4). Pour ce faire, mettre les embryons à travers une série de methanol jusqu'à ce que dans 100% de methanol.
- Après une immersion complète dans du methanol, transférer les embryons à une solution d'une partie de l'alcool benzylique et benzylique deux parties soitnzoate (BABB). Les embryons seront initialement flotter à la surface, mais comme le méthanol se mélange avec le BABB, ils vont se enfoncer dans le BABB. Effectuez chaque étape traiter avec BABB dans des flacons de verre ou de plats; BABB va fondre toute matière plastique ou de la peinture.
- Une fois autorisé, voir les embryons avec la lumière transmise venant d'en bas l'embryon. Ajuster l'intensité de la lumière ainsi que l'angle de dessous pour améliorer le contraste et fournir la meilleure couleur.
- Lors de l'affichage des embryons compensés soulèvent la boîte de Pétri en verre hors de la base. Pour ce faire, en utilisant simplement deux autres couvercles de boîte de Pétri pour l'élever de telle sorte que la région de l'assiette avec des embryons est élevée.
NOTE: Ceci a l'avantage de prendre la base de mise au point et l'élimination des effets gênants de imperfections ou des taches sur la base de microscope qui peut interférer avec l'image.
5. Double hybridation in situ
- Afin de visualiser simultanément le profil d'expression des two différents gènes dans un seul embryon, synthétiser deux sondes, l'une pour chacun des différents gènes. Synthétiser une sonde en utilisant DIG-UTP-11 en tant que marqueur de la manière décrite ci-dessus. On dilue le produit de la réaction de transcription de l'ARN dans un tampon d'hybridation pour obtenir une sonde 3x plus concentrée que seul utilisé pour les hybridations in situ.
- Synthétiser l'autre sonde d'intérêt en utilisant le même protocole que pour étiqueté sondé DIG, sauf que la fluorescéine-12-UTP doit être substitué à DIG-11-UTP. On dilue le produit de la réaction de transcription de l'ARN dans un tampon d'hybridation pour obtenir une sonde 3x plus concentrée que seul utilisé pour les hybridations in situ.
- Mélanger les deux sondes concentrées dans un rapport de 1: 1. Pour de meilleurs résultats, utilisez la sonde marquée à la fluorescéine pour le gène qui montre la plus forte expression dans le seul protocole d'hybridation in situ.
- Utiliser le même protocole d'hybridation in situ décrites pour unique in situ </ Em> hybridations, sauf utiliser la double sonde (sonde contenant l'1,5x mélange concentré de sondes marquées à la digoxigénine et marqués à la fluorescéine) à la fin de la première journée au lieu d'une seule sonde d'hybridation in situ.
- Suivez le protocole d'hybridation seule le deuxième jour de la double protocole d'hybridation in situ, à l'exception des fragments utilisation d'anti-fluorescéine AP Fab à une dilution de 1: 4000 à la place de fragments anti-DIG-AP Fab. Laver l'excès d'anticorps à partir de l'embryon comme dans le seul protocole in situ et effectuer la première réaction de couleur en utilisant le substrat BM-Violet AP.
- Après la première réaction de couleur, inactiver l'anticorps fluorescéine dans 0,1 M de glycine pH 2,0 pendant 40 minutes, suivi par cinq lavages de dix minutes dans du MAB. Bloquer les embryons dans MAB + HTSS + BR pendant 90 min. Ajouter l'anticorps anti-DIG à une dilution de 1: 2000 dans du MAB + BR + HTSS et incuber à 4 ° C pendant une nuit.
- Le lendemain, laver les embryons eoroughly dans MAB (12 lavages de 30 min) pour éliminer l'excès d'anticorps.
- Laver les embryons pendant 10 min dans du tampon AP (tableau 1), puis tache avec BCIP (0,5 mg / ml dans le tampon AP).
NOTE: La combinaison in situ devrait donner une coloration au bleu-violet foncé pour la première réaction de la couleur et une réaction de couleur bleu clair pour le second (figure 5). - Arrêter la réaction de couleur finale en enlevant le tampon AP et rincer trois fois avec MAB. Fixer les embryons avec Mempfa pendant 10 min. Laver les embryons avec 5 lavages rapides dans MAB ou OTC.
- Avec cette combinaison de couleurs, l'utilisation de méthanol dans les traitements post de coloration ne est plus possible, car il permettra d'éliminer la couleur seule BCIP. Stocker les embryons après coloration et la fixation dans PBS avec l'azoture de sodium à 0,02%. L'intensité de coloration peut être faible avec double dans situs. Si ce est un problème, de réduire les lavages à quatre, chacun des deux durée h.
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Résultats
L'utilisation de sondes spécifiques de tissus peut fournir des informations en circulation en ce qui concerne l'état de développement des organes spécifiques. Dans les exemples suivants, l'étape de l'embryon est basée sur la table de transfert Nieuwkoop et Faber 11. Si l'on utilise des sondes de gènes exprimés forme après différenciation, la troponine I cardiaque au stade 28-30, par exemple (figure 1C), la présence ou la taille d'un organe différencié peut êtr...
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Discussion
La possibilité d'utiliser l'hybridation in situ de visualiser le profil d'expression de gènes spécifiques reste le procédé le plus couramment utilisé pour identifier des organes spécifiques ou des types de cellules dans l'embryon de Xenopus. Ce est en raison de plusieurs avantages offerts par cette technique. L'expression d'un gène peut identifier des structures spécifiques bien avant tout signe histologique de différenciation comme le cas pour l'expression de Nkx2.5
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les IRSC pour le soutien de Steve Deimling dans le cadre de leur bourse, ainsi que le Département de pédiatrie de l’Université Western Ontario pour son soutien à Steve Deimling, Rami Halabi et Stephanie Grover. Ces travaux ont été financés par le R2654A11 de subventions du CRSNG et un supplément d’accélération à la découverte du CRSNG
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| Flacons VWR | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucléoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigénine-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Inhibiteur de la Rnase (Rnase OUT) | Invitrogen ; | 10777-019 | |
| ARN polymérase T7 | Fermentas | EPO111 | |
| ARN polymérase T3 | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 ARN polymérase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen ; | 18047-019 | |
| Sérum de mouton | Wisent | 31150 | |
| Réactif bloquant | Roche | 11096176001 | |
| BM violet Ap Substrat | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigénine-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Méthanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM ; | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM ; | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Vadrouilles | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldéhyde | BioShop | PAR070.500 ; | |
| Formamide | ; VWR ; ; ; ; | CAFX0420-4 ; | |
| ARN | Roche | 10109223001 | |
| Acide Maléique | ; VWR ; ; ; ; | CAMX0100-3 | |
| Citrate tri-sodique | BioShop | CIT001 | |
| Peroxyde d’hydrogène (solution à 30 %) | EM ; | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Alcool benzylique | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Agarose ultrapure ; | Invitrogen ; | Référence 16500-500 |
Références
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
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