Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

Steven J. Deimling; Rami R. Halabi; Stephanie A. Grover; Jean H. Wang; Thomas A. Drysdale

doi:10.3791/51526

Article de méthode

Comprendre organogenèse précoce aide d'un simplifié

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DOI :

10.3791/51526

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12 janvier 2015

Steven J. Deimling¹ , Rami R. Halabi²^,³ , Stephanie A. Grover⁴ , Jean H. Wang²^,⁵ , Thomas A. Drysdale²^,⁴^,⁵

¹Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, ²Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, ⁴Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, ⁵Department of Paediatrics, University of Western Ontario

Dans cet article

Résumé

L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation. Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.

Résumé

L’organogenèse est l’étude de la façon dont les organes sont spécifiés et acquièrent ensuite leur forme et leurs fonctions spécifiques au cours du développement. L’embryon de Xenopuslaevis est très utile pour l’étude de l’organogenèse car sa grande taille le rend très approprié pour identifier les organes dès les premières étapes de l’organogenèse. À l’heure actuelle, la principale méthode utilisée pour identifier un organe ou un primordium spécifique est l’hybridation in situ sur monture entière avec des sondes d’ARN antisens marquées spécifiques à un gène exprimé dans l’organe d’intérêt. De plus, il est relativement facile de manipuler des gènes ou des voies de signalisation chez le xénope et l’hybridation in situ permet ensuite de rechercher des changements dans la présence ou la morphologie d’un organe cible. L’hybridation in situ de l’ensemble du mont est un protocole de plusieurs jours comportant de nombreuses étapes. Ici, nous fournissons un protocole simplifié avec un nombre réduit d’étapes et de réactifs utilisés qui fonctionne bien pour les tests de routine. Les robots d’hybridation in situ ont grandement facilité le processus et nous détaillons comment et quand nous utilisons cette technologie dans le processus. Une fois l’hybridation in situ terminée, capturer la meilleure image du résultat peut s’avérer frustrant. Nous fournissons des conseils sur la façon d’optimiser l’imagerie des résultats d’hybridation in situ. Bien que le protocole décrive l’évaluation de l’organogenèse chez Xenopus laevis, le même protocole de base peut presque certainement être adapté à Xenopus tropicalis et à d’autres systèmes modèles.

Introduction

Le profil d’expression d’un gène spécifique est une information importante pour déterminer le rôle potentiel de ce gène dans le développement d’un organe ou d’un type de cellule spécifique. En termes simples, s’il n’est pas exprimé au bon moment et au bon endroit, il est peu probable qu’il joue un rôle clé. Chez le xénope, comme chez la plupart des embryons précoces, le test le plus couramment utilisé pour détecter l’expression d’un gène est l’hybridation in situ en monticule entier à l’aide de sondes d’ARN antisens marquées. L’utilisation de la coloration des anticorps pour évaluer l’expression d’un gène chez le xénope devient de plus e....