Amplification linéaire d'une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

Résumé

Linéaire amplification médiée (LAM)-PCR est une méthode mise au point pour identifier la position exacte de l'intégration des vecteurs viraux dans le génome. La technique a évolué pour devenir la meilleure méthode pour étudier la dynamique clonale chez les patients de thérapie génique, de la biosécurité de nouvelles technologies de vecteur, la diversité des lymphocytes T, des modèles de cellules souches du cancer, etc

Résumé

La PCR médiée par amplification linéaire (LAM-PCR) a été développée pour étudier l’hématopoïèse dans les cellules corrigées de gènes de patients traités par thérapie génique avec des systèmes vectoriels intégrateurs. En raison de l’intégration stable des vecteurs rétroviraux, les sites d’intégration peuvent être utilisés pour étudier le devenir clonal des cellules individuelles et de leur descendance. Pour la première fois, la LAM-PCR a fourni des preuves que la leucémie chez les patients traités par thérapie génique provenait d’une surexpression induite par le provirus d’un proto-oncogène voisin. La sensibilité et la spécificité élevées de la LAM-PCR par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR inverse et la PCR médiée par ligature (LM) sont obtenues par une étape de préamplification initiale (PCR linéaire de 100 cycles) à l’aide d’amorces spécifiques de vecteurs biotinylés qui permettent d’effectuer des étapes de réaction ultérieures sur la phase solide (billes magnétiques). La LAM-PCR est actuellement la méthode la plus sensible disponible pour identifier l’ADN inconnu qui se trouve à proximité d’ADN connu. Récemment, une variante de la LAM-PCR a été mise au point qui contourne la digestion de restriction, abrogeant ainsi le biais de récupération des sites d’intégration et permettant une analyse complète de l’emplacement des provirus dans les génomes de l’hôte. Le protocole suivant explique étape par étape l’amplification des séquences 3'- et 5'- adjacentes au vecteur lentiviral intégré.

Introduction

Linéaire d'amplification médiée par PCR (LAM-PCR) permet d'identifier et de caractériser inconnu ADN flanquant adjacente à ADN connu de toute origine. Plus précisément, LAM-PCR a été développée pour localiser les sites d'intégration de vecteurs viraux (IS) dans le génome hôte ^1,2. Les éléments génétiques comme les rétrovirus ou transposons intégrer leur génome dans le génome de l'hôte dans un (semi-) de manière aléatoire ^3-6. Dans de nombreux cas, il est décisif de savoir exactement l'endroit où ces vecteurs intégrés. LAM-PCR a été prouvé pour être supérieur à d'autres techniques comme la ligature et d'une PCR ^7<....

Protocole

1. Préparation de l'éditeur de liens Cassettes (LC)

1. Mélanger 40 ul de LC1 oligonucléotide (Tableau 1), 40 pl de LC2 oligonucléotide (Tableau 1, avec l'enzyme appropriée de restriction saillie), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), et 10 ul de 250 mM de MgCl _2.
2. Incuber à 95 ° C pendant 5 minutes et laisser la réaction refroidir lentement à température ambiante. Ajouter 300 ul de H ₂ O et on concentre dsLinker-ADN sur un filtre de centrifugation. Ajouter 80 ul H ₂ O à l'éluat et aliquote de 10 ul de la cassette de liaison préparés dans des tubes PCR de 0,2.

Résultats

Résultats de LAM-PCR dans l'amplification de génome vecteur jonctions avec une taille de fragment défini pour chaque jonction. La taille des fragments de PCR individuels dépend de la distance entre l'emplacement de l'ADN connues dans le génome et le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction le plus proche. Ceci permet la visualisation de la diversité des jonctions amplifiées dans les échantillons analysés par électrophorèse sur gel, par exemple., Si ce n'est que seule (monoclonaux), .......

Discussion

La technique LAM-PCR permet d'identifier des séquences d'ADN inconnues qui flanquent une région d'ADN connue. En raison de la sensibilité élevée résultant de pré-amplification de la jonction avec l'hybridation des amorces spécifiques de la séquence d'ADN connue, il est possible d'amplifier et de détecter même des jonctions rares jusqu'au niveau de la cellule unique. A l'inverse, dans une situation polyclonal LAM-PCR est capable d'amplifier les milliers de différentes jonctions dans un.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Taq DNA polymérase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	D’autres polymérases Taq peuvent être utilisées
Tampon PCR	Qiagen	201203	L’utilisation de ce tampon est recommandée
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	ou tout autre dNTP
Oligonucléotides (amorces)	MWG Biotech		HPLC purifié
Dynabeads M-280 Streptavidine  ;	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1 % poids/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation  ;	22637	ou tout autre fournisseur
EDTA	Applichem	A1103,0250	ou tout autre fournisseur
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Mélange d’hexanucléotides	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonucléase	NEB		ou tout autre fournisseur
Kit	de ligature d’ADN Fast-LinkEpicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	ou tout autre fournisseur
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	ou tout autre fournisseur
Tampon TBE	Amresco	0658	ou tout autre fournisseur
Bromure d’éthidium	Applichem	A2273,0005	Le bromure d’éthidium est mutagène
100 pb Échelle d’ADN	Invitrogen	15628-050	ou toute autre échelle d’ADN
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	ou tout autre fournisseur
Séparateur de particules magnétiques Magna-Sep  ;	Life Technologies	K158501	pour une utilisation avec des tubes de 1,5 ml
séparateur de particules magnétique Magna-Sep		K158696	pour une utilisation avec des plaques à 96 puits
Amicon Ultra-0.5, une membrane Ultracel-30,	Millipore	UFC503096
PerfectBlue, Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	ou un autre système d’électrophorèse.
TProfessional 96	Biometra	050-551	ou autre Thermocycleur pour plaques à 96 puits
Agitateur orbital KS 260 basic	IKA	2980200	ou autre agitateur horizontal
Tubes souples PCR 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	ou autres tubes PCR de 0,2
ml Tubes de 1,5 ml	Eppendorf	12682	ou autres tubes de 1,5 ml
Système de documentation sur gel	PeqLab		ou tout autre système de documentation sur gel
Spectrophotomètre Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 gel préfabriqué	Elchrom Scientific	3497
Appareil d’électrophorèse sur gel submergé SEA 2000  ;	Elchrom Scientific	2001E
2100 Bioanalyseur d’électrophorèse	Agilent Technologies	G2939AA

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