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Article de méthode

Aip1p Dynamics sont modifiés par la R256H Mutation dans actine

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DOI :

10.3791/51551

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30 juillet 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Department of Biochemistry, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa

Dans cet article

Résumé

mutations qui causent des maladies dans actine peuvent altérer la fonction du cytosquelette. Dynamique du cytosquelette sont quantifiés grâce à l'imagerie des protéines marquées par fluorescence à l'aide totale microscopie de fluorescence interne. A titre d'exemple, la protéine du cytosquelette, Aip1p, a modifié la localisation et le déplacement dans des cellules exprimant l'isoforme mutante de l'actine, R256H.

Résumé

Des mutations dans actine provoquent une gamme de maladies humaines dues à des changements moléculaires spécifiques qui modifient souvent la fonction du cytosquelette. Dans cette étude, l'imagerie de fluorescence protéines marquées par fluorescence interne totale (FRBR) microscopie est utilisée pour visualiser et quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette. microscopie TIRF et l'utilisation de marqueurs fluorescents permet aussi de quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette causées par des mutations dans l'actine. En utilisant cette technique, la quantification de la fonction du cytosquelette dans les cellules vivantes complète utilement dans des études in vitro de la fonction des protéines. A titre d'exemple, des mutations faux-sens affectent le résidu R256 de l'actine ont été identifiés dans les trois isoformes d'actine humain suggère que cet acide aminé joue un rôle important dans les interactions régulatrices. Les effets de la mutation R256H actine du cytosquelette sur les mouvements ont été étudiés à l'aide du modèle de la levure. La protéine, AIP1, qui est connu pour aider à cofilin dépolymérisation de l'actine, étaitmarqués avec la protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité N-terminale et suivis in vivo en utilisant la microscopie TIRF. La vitesse de déplacement Aip1p à la fois de type sauvage et des souches mutantes a été quantifiée. Dans les cellules exprimant R256H actine mutant, le mouvement Aip1p est limitée et le taux de circulation est pratiquement la moitié de la vitesse mesurée dans des cellules de type sauvage (0,88 ± 0,30 um / sec dans les cellules R256H par rapport à 1,60 ± 0,42 um / sec dans les cellules de type sauvage, p <0,005).

Introduction

L'actine est la protéine dominante comprenant du cytosquelette et participe au processus cellulaires critiques, y compris la division cellulaire, le mouvement des organites, la motilité cellulaire, la contraction, et la signalisation. Au cours de la dernière décennie, les mutations pathogènes dans actine ont été découvertes dans chacun des six isoformes d'actine humaines menant à une série de troubles, de myopathies de maladie coronarienne 1-7. Les processus par lesquels les mutations conduisent à l'actine maladie continuent à être élucidée. Le modèle de levure reste l'étalon-or pour étudier les effets biochimiques des mutations sur la fonction de l'actine en raison des avantages de la seule isoforme d'actine essentiel, traçabilité génétique et grande conservation de séquence et la fonction de l'actine. Des études montrent que des mutations d'actine individuels conduisent à des dysfonctionnements spécifiques moléculaires avec des effets négatifs dominants 8. Par exemple, les mutations de la surdité causant à l'actine γ-non-musculaires qui affectent le résidu Lys-118 modifie la réglementation parla protéine de liaison de l'actine Arp2 / 3 9. Des études in vitro utilisent fréquemment des analyses des interactions protéine: protéine. Les investigations sur les effets des mutations actine sur la biologie cellulaire et, en particulier, la liaison d'actine localisation de la protéine dans la cellule est limité.

Études du cytosquelette de la levure in vivo reposent classiquement sur ​​des images de cellules fixes à partir d'un microscope inversé à fluorescence 10. Ces expériences ont fourni des données fondamentales sur la morphologie du cytosquelette d'actine. Des enquêtes ont incorporé depuis trois dimensions imagerie confocale pour visualiser le réseau du cytosquelette complexe 11, 12. Cette imagerie permet la quantification de l'abondance et la position relative des patchs d'actine et les filaments. La tomographie d'électrons section mince a été utilisée pour l'image de la morphologie des réseaux filamenteux denses par rapport aux structures sous-cellulaires conservées 13. S cellulaires Crowdedépreuve avec une petite section peuvent être examinées dans les moindres détails avec cette technique. Les études d'imagerie ont été étendues à des cellules vivantes en utilisant laps de temps microscopie fluorescente. Lorsque photo blanchiment et la fluorescence de fond peuvent être modérés, laps de temps imagerie permet enquêtes à la dynamique des protéines du cytosquelette et la réponse aux conditions environnementales 11, 14. Par ailleurs, la visualisation de la dynamique des filaments d'actine in vitro a été avancée par l'introduction du total fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie. Par rapport à la microscopie à champ large, TIRF présente l'avantage d'une diminution de la fluorescence d'arrière-plan et de contraste amélioré pour surveiller filaments individuels 15, 16. Avec ces qualités, microscopie TIRF a été adaptée par les biologistes cellulaires pour surveiller les structures cellulaires à la membrane plasmique 17, 18. Événements cellulaires, y compris les changements dans le cytosquelette, peutêtre visualisées en temps réel avec une faible phototoxicité, contraste maximal et minimal fond floraison 19.

Pour mieux comprendre l'effet des mutations d'actine sur le mouvement, la localisation et le chiffre d'affaires de protéines du cytosquelette de la cellule, la microscopie TIRF et de protéines de marquage ont été utilisés. Ici, des méthodes pour étudier les effets d'une mutation cliniquement pertinente de l'actine sur la dynamique du cytosquelette dans Saccharomyces cerevisiae sont décrits. Plus précisément, la localisation et le déplacement de la protéine de liaison de l'actine, Aip1p, a été visualisés et quantifiés dans des cellules exprimant la mutation R256H dans actine. Ces techniques se complètent dans les études biochimiques in vitro et permettent une meilleure compréhension des interactions et des fonctions protéiques.

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Protocole

1. Clonage dans le PB1996 plasmide

  1. Conception et de commande des amorces d'ADN à partir d'une société de fabrication d'oligonucléotides qui flanquent la séquence cible et contient des sites de restriction uniques dans le plasmide parent sélectionné. REMARQUE: Dans ce cas, les amorces ont été conçues pour amplifier les 400 paires de bases à l'extrémité 5 'de la séquence AIP1. Le site de restriction XhoI a été incorporé dans l'amorce d'environ 20 pb avant que la séquence AIP1 et Xmal était inclus d'environ 20 pb après la séquence AIP1 cible. Le plasmide utilisé pour le clonage était PB1996, qui contient un mot-clé pour 3XGFP fluorescence, un gène URA pour la sélection des souches de levure, et un gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection bactérienne.
  2. Purifier l'ADN génomique à partir d'une souche haploïde de levure Ura-. Remarque: Se référer à la Figure 1 pour un diagramme de processus de clonage.
  3. Exécuter une réaction de PCR standard en utilisant les deux amorces et l'ADN génomique de levure pour amplifier le gène Aip1p avec les sites de restriction de part end. Digérer le produit de PCR et le plasmide d'PB1996 avec les enzymes de restriction dans des réactions séparées par fabricant protocoles recommandés. Dans ce cas Xmal et Xhol ont été utilisés avec le tampon d'accompagnement à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Exécuter un gel à 0,8% d'agarose à une électrophorèse pour séparer les fragments d'ADN digérés. Dans un puits, charger une faible échelle de masse de l'ADN et, dans des puits séparés, charger la totalité de la réaction de chaque digestion. Exécuter le gel à 100 V pendant environ 1 heure, jusqu'à ce que le front de colorant se trouve près de l'extrémité du gel. Visualiser le gel sous une lumière UV et on purifie le segment qui correspond au segment de protéine et le plasmide coupé.
  5. Ligaturer le segment AIP1 et PB1996 digéré le plasmide. Transformer le produit dans des cellules DH5a en utilisant les protocoles du fabricant (10 d'ADN ul avec 100 cellules de pi pendant 30 minutes sur la glace, le choc thermique à 42 ° C pendant 2 min, grandir en milieu SOC pendant 2 heures à 37 ° C) et la plaque sur des plaques de culture qui comprend l'antibiotique de sélection, dans ce cas, LB +plaques d'amplis. Sélectionner et développer une colonie en culture liquide. Purifier le plasmide nouvellement conçu.

2. Mutant Generation levure de souche

  1. Utilisation d'une souche de levure haploïde dans lequel l'allèle de l'actine a été supprimée pour construire une souche de levure mutante. Remarque: Dans ce cas, la souche mère était un don généreux de M. Peter Rubenstein (Université de l'Iowa) et la construction a été décrite par Cook et al 20 Cette souche dépourvue du gène de l'actine chromosomique et contient un plasmide codant levure de type sauvage. actine et de l'uracile.
  2. Utilisez le pRS plasmide codant levure de type sauvage actine avec un Trp + sélection comme le plasmide de base pour la mutagenèse 21.
  3. Effectuer une mutagenèse dirigée sur le plasmide pRS de concevoir la mutation faux-sens dans l'actine.
    1. Pour la mutation R256H dans actine, faire l'amorce 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' pour changer la Arg 256 à son 256. Exécuter une mutagenèse normeRéaction de PCR avec le plasmide de l'étape 2.2.
    2. Transformer le plasmide d'actine mutant de la PCR dans des cellules DH5a. Isoler l'ADN plasmidique et le séquençage du gène de l'actine pour vérifier la mutation.
  4. Transformer la levure mutante plasmide codant l'actine dans la souche de levure haploïde dans l'étape 2.1.
  5. Culture des cellules transformées sur TRP-plaques pour sélectionner la levure contenant le Trp + contenant le plasmide mutant de levure actine.
  6. Sélectionner les cellules manquant du plasmide d'origine qui code type sauvage actine et l'uracile (décrit à la section 2.1) par sous-culture de cellules par le TRP-plaques sur des plaques qui contiennent 5-fluoro-acide (5-FOA). 5-FOA est converti en une forme toxique, le 5-fluorouracile, en voix contre des souches exprimant le gène URA3 fonctionnel. Les cellules qui se développent après la sélection pas à pas ne contiendront que le plasmide d'actine mutante.
  7. Purifier l'ADN plasmidique à partir de la nouvelle souche de levure. Séquencer le plasmide pour assurer le gène de l'actine mutante est présente. Utilisez ce sformer dans d'autres études. Ce processus est schématisé sur la figure 2.

3. Transformer le plasmide dans des cellules de levure

  1. Digérer le plasmide Aip1p-GFP avec une enzyme de restriction pour permettre l'intégration dans le chromosome de la levure. NOTE: Le site de restriction doit être à l'extérieur du bloc de séquence qui contient le marqueur fluorescent, un gène d'intérêt et le marqueur de sélection. Dans ce cas, utiliser 1 pl de l'enzyme de restriction Hpal avec 8 ADN pi et 1 pi du tampon 10x accompagnant pendant 1 heure à 37 ° C.
  2. Culture S. cerevisiae (cellules de l'étape 2.5), qui sont incapables de synthétiser l'uracile (Ura-déformation) pendant une nuit dans 5 ml dans des milieux YPD (1% d'extrait de levure, 2% de peptone et 2% de dextrose) sur une roue à 30 ° C. Centrifuger 1 ml des cellules pendant 5 min à 1000 x g.
  3. Assurez mélange PLAQUE. Faire 10XTE par addition de 5 ml de Tris 1 M pH 7,5 et 2 ml de 250 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 43 ml de trou DDH 2 O. Ajouter 00,204 g d'acétate de lithium à 20 ml de 1XTE, puis 8 g de polyéthylène glycol (PEG) (MW ~ 3300) et stériliser par filtration.
  4. Décanter le liquide surnageant à partir des cellules filées à l'étape 3.2 et de remettre en suspension les cellules dans le liquide restant. Pour les cellules en suspension, ajouter 2 pi de ml d'ADN de 10 mg / testicules de saumon transporteur. Ajouter 10 ul de l'ADN de plasmide digéré de l'étape 3.1 et de vortex. Ajouter 0,5 ml de la plaque et vortex. Ajouter 20 pi de 1 M DTT et vortex.
  5. Incuber le mélange pendant 6-8 heures à 25 ° C. Choc thermique des cellules dans un bain d'eau à 42 ° C pendant 10 min. Plate 100 ul de cellules à partir du fond du tube à centrifuger où ils sont installés sur une plaque-Ura. Incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours ou jusqu'à ce que les colonies forme.
  6. Sélectionner des colonies individuelles et série sur une plaque-Ura. REMARQUE: Ces cellules contiennent le plasmide avec le gène GFP-AIP1 et Ura intégré dans le chromosome, ce qui permet à la croissance. Ces cellules seront ensuite utilisés dans microscopy.

4. Visualisation du Mouvement des protéines Aip1p aide de la réflexion interne totale microscopie de fluorescence

  1. Cultiver une culture de cellules de levure avec le Aip1p-GFP constituée en YPD nuit sur une roue à 30 ° C. Subculture 1 ml de la culture d'une nuit dans 9 ml de-Ura médias. Cultiver les cellules pendant 3 à 4 h de plus un sur un agitateur à 30 ° C afin de s'assurer qu'elles sont en phase de croissance logarithmique.
  2. Ajouter 3 pi de cellules sur une lame de microscope en verre et ajouter une lamelle. Laisser les cellules se déposer sur la lame pendant 5 min. Placer la lame dans le support de la plaque de platine.
  3. Observez la protéine Aip1p-GFP avec une réflexion interne totale fluorescence (FRBR) de microscope (488 nm) en utilisant une huile à immersion 100X FRBR objectif et une caméra CCD numérique. En utilisant le logiciel SlideBook 5.0, d'obtenir des images de 20 secondes à une vitesse de 5 images / s (images individuelles d'images acquises sont présentés dans la figure 2A).
    1. Pour se concentrer sur le caunes, logiciel libre SlideBook 5.0 et cliquez sur le bouton Mise au point Fenêtre dans la barre d'outils pour accéder aux commandes de discussion. Sélectionnez l'onglet Champ d'application et sélectionnez l'objectif 100X-FRBR. Allumer la lampe et faire glisser la barre de la lampe à 15%. Changez le réglage Bin à 2 x 2. Changer le filtre à champ lumineux.
    2. Sur le microscope, utilisez la molette de mise au point bien d'amener les cellules dans le foyer comme on le voit sur l'écran d'ordinateur.
    3. Utilisation des commandes dans la fenêtre Focus, éteindre la lampe, changer le filtre à vivre, et cliquez sur le bouton TIRFM.
    4. Sur l'illuminateur TIRFM attaché à l'orifice latéral droit du microscope, tourner l'émission laser à Sur.
    5. Sélectionnez l'onglet Stream dans la fenêtre Focus, cochez la case pour démarrer l'enregistrement, puis cliquez sur le bouton de champ lumineux.
    6. Sur l'illuminateur TIRFM, tourner le micromètre pour ajuster l'angle d'incidence du laser. Ceci permet d'optimiser l'émission de fluorescence à partir des foyers AIP1-GFP et de minimiser la fluorescence de fond à partir de lacellules et toboggan.
    7. Lorsque l'image souhaitée est affichée, appuyez sur Start. Après 20 secondes, appuyez sur Stop. Enregistrer les images. Sous l'onglet Fichier dans la barre de menu principal, sélectionnez Enregistrer le diaporama sous et entrez l'emplacement du fichier et le nom.
  4. Utilisez le logiciel ImageJ pour analyser les images. Utilisez la macro plugin "Tracker Manuel" pour suivre le mouvement et la vitesse de la Aip1p foyers fluorescents. Modifier le paramètre intervalle de temps de 0,2 sec.
    1. Utilisation de la sélection de la piste de complément, sélectionnez et suivre une protéine fluorescente individu à travers quatre à huit cadres conjonctifs. Utilisez la commande de la piste de fin et la vitesse de déplacement de la protéine entre chaque image s'affiche dans une fenêtre de résultats.
    2. Déterminer le taux moyen entre chaque trame en utilisant une feuille de calcul Microsoft Excel. Utiliser les valeurs pour calculer la vitesse moyenne du mouvement Aip1p pour chaque souche de cellules d'intérêt. REMARQUE: Un diagramme de dispersion de la vitesse de déplacement et la vitesse Aip1p non-linéaire moyenne est représentée dans Figure 2B.

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Résultats

Procédé pour imager la dynamique de protéines du cytosquelette de la cellule est présentée. La protéine liant l'actine, Aip1p, a été marqué à la GFP. La conception pour le plasmide codant pour le produit marqué est représenté sur la figure 1. Le plasmide a été ensuite transformé dans des cellules de levure. L'expression de la fluorescence étiquetée Aip1p permis de visualiser le comportement de la protéine dans la cellule. Aip1p localise généralement à des taches d'actine dans les sites d'...

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Discussion

Une stratégie efficace de visualiser la dynamique du cytosquelette et l'utilité dans les enquêtes sur les mutations pathogènes a été décrit ici. Avancées techniques d'imagerie ont créé de nouvelles opportunités pour comprendre le mouvement intracellulaire des protéines près de la membrane cellulaire. Totale microscopie de fluorescence à réflexion interne (FRBR) est une technique sensible pour des études fonctionnelles dans les cellules vivantes. TIRF utilise un laser d'excitation est inclinée et qui crée un ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient Peter Rubenstein pour des discussions utiles et des conseils techniques et David Pellman pour le clone de PB1996 originale. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Mars of Dimes et le financement de la tour pour les enfants.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agaroserpi9012-36-6
Bleu de bromophénolAmresco115-39-9
BSANEBB9001S
Change-IT Kit de mutagénèse dirigée à sites de mutations multiplesUSB Corporation4166059
CutSmart BufferNEBB7204S
ADN, simple brin à partir de testiculesde saumonSigma9007-49-2
EDTA pH 7.4Sigma93302
Bromure d’éthidiumInvitrogen15585-011Avertissement ! Irritation nocive
Kit d’ADN fongique/bactérienSymo ResearchD6005
HpaINEBR0105S
Acétate de lithiumAlfaAesar6108-17-4
Échelle de faible masse d’ADNInvitrogen10068-013
NE Buffer #4NEBB7004S
Platinum PCR SuperMix High FidelityInvitrogen12532-016
Miniprep KitQiagen27106N’importe quel kit fonctionnera
Kit de ligature rapideNEBM2200S
Azoture de sodiumSigma26628-22-8
PBSInvitrogen10010-023
PEGAmresco25322-68-3
Tris Base Ultrapurerpi77-86-1
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromega06/01/2015
XhoINEBR0146S
XmaINEBR0180S
YPD mediaLabExpress3011-URA
MediaLabExpress3010
PCR MachineInvitrogen4359659 N’importequelle machine PCR fonctionnera
Microscope TIRFOlympus IX81
Hamamatsu Caméra ORCA-RHamamatsu

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Mutation R256H de l actinemicroscopie TIRFmarquage par prot ine fluorescentedynamique du cytosquelettemod le levured polym risation de l actinequantification du mouvement des prot inesimagerie sur cellules vivantessuivi de la GFP
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