Ce protocole décrit la détection par qPCR du cytomégalovirus dans le tissu de biopsie fixé au formol et inclus dans la paraffine, qui est rapide, sensible, spécifique et utile pour interpréter les modèles équivoques d’hématoxyline et d’éosine ou de coloration immunohistochimique.
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Article de méthode
qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l'ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il est essentiel d'identifier le cytomégalovirus (CMV) dans le tractus gastro-intestinal (GI) chez les patients immunodéprimés, compte tenu de leur plus grand risque de développer une infection grave. Beaucoup de méthodes de laboratoire pour la détection de l'infection à CMV ont été développés, notamment la sérologie, culture virale, et des méthodes moléculaires. Souvent, ces méthodes reflètent une atteinte systémique par le CMV et ne permettent pas d'identifier précisément l'implication du tissu local. Par conséquent, la détection de l'infection par le CMV dans le tractus gastro-intestinal est souvent fait en histologie classique de tissu de biopsie. Hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration en conjonction avec l'immunohistochimie (IHC) sont restés les piliers de l'examen de ces biopsies. H & E et IHC entraînent parfois des atypiques (équivoques) motifs de coloration, ce qui rend l'interprétation difficile. Il a été montré que la polymerase chain reaction quantitative (qPCR) pour le CMV peut être exécutée avec succès sur, les tissus de biopsie inclus dans la paraffine (FFPE) fixés au formol pour les trèshaute sensibilité et spécificité. L'objectif de ce protocole est de démontrer comment effectuer les essais qPCR pour la détection du CMV dans FFPE tissu de biopsie dans un laboratoire clinique. Cette méthode est susceptible d'être d'une grande utilité pour les patients en cas de coloration équivoque pour le CMV dans des biopsies de GI.
Introduction
Interprétation du cytomégalovirus (CMV) dans les échantillons cliniques est très important. Le CMV est un membre de la sous-famille des herpesvirus Betaherpesvirinae. Semblable à d'autres virus de l'herpès, le CMV a la capacité d'établir une infection persistante ou latente caractérisé par un manque de réplication virale active 1. Réactivation du virus peut se produire pendant les périodes de stress ou autre immunosuppression, conduisant à une réplication virale active caractérisée par virion de presse, qui peut être accompagné par des manifestations de la maladie 2-4. Gastro-intestinal (GI) symptômes de la maladie à CMV comprennent souvent des douleurs abdominales et / ou des selles sanglantes 1.
Le diagnostic de la gastro-entérite à CMV par histologie utilise de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) pour identifier CMV inclusions virales. Dans les cas où la suspicion clinique est forte pour l'instant aucun inclusions évidentes sont observées, l'immunohistochimie (IHC) est fréquemment utilisé comme une méthode de test complémentaire. Cependant, IHCpeut également être entravée par apparaissant motifs de coloration cellulaire non-classiques rares (équivoques), ce qui rend l'interprétation difficile (figure 2) 5. Il a cherché à utiliser l'ADN extrait d'fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu GI de biopsie et quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) pour détecter le CMV dans des biopsies de GI. Cette technique s'est révélée être utile dans la détection de CMV dans des biopsies de GI, et est particulièrement utile dans les cas ambigus de coloration IHC 5,6. En outre, qPCR a également été montré une bonne corrélation avec les données de test de CMV clinique supplémentaire quand il est disponible 6. L'utilisation de qPCR dans la détection de CMV peut conduire à un diagnostic plus précoce et le traitement dans les cas où la suspicion clinique pour le CMV est élevé, mais H & E et le CMV IHC sont négatifs.
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Protocole
Avec l'approbation de l'Institutional Review Board, une recherche de la base de données de laboratoire électronique a été effectuée pour identifier fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) blocs représentant cas de cytomégalovirus (CMV) en gastro-intestinal (GI) biopsies diagnostiqués par histopathologie (hématoxyline et l'éosine (H & E) et / ou immuno-histochimie (IHC)).
1. Traitement des tissus de biopsie tissulaire FFPE GI
- Recueillir FFPE GI des blocs de tissus de biopsie pour le cytomégalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitative (qPCR). Ces blocs sont stockés à température ambiante.
- Tubes pré-étiquette 1,7 ml microfuges avec numéro d'identification unique du bloc.
- Bloquer le volant de microtome.
- Asseoir le bloc de tissu dans la pince de la cassette.
- En utilisant une lame utilisé frais, aligner le bloc à l'angle de couteau sur le microtome.
- Réglez le microtome de couper 10 sections um d'épaisseur.
- Débloquez ee volant et avance le bloc vers la lame.
- Couper 5 sections du bloc à 10 um d'épaisseur intervalles, permettant à chaque coupe à rouler dans un rouleau de tissu. Assurez-vous que chaque rouleau contient une représentation adéquate des tissus de biopsie souhaités.
- Bloquer le volant de microtome.
- Avec des pinces, placer tous les 5 rouleaux de tissu dans le tube de centrifugeuse pré-étiqueté, en faisant attention à ne manipuler le défilement par la paraffine afin de réduire les risques de contamination croisée. Enclenchez le bouchon sur le tube et le replacer sur la grille.
- Retirer le bloc de tissu à partir de la microtome.
- Retirer et jeter la lame.
- Décontaminer les surfaces ou les instruments qui ont pu entrer en contact avec le tissu précédent.
- Placez une lame utilisé frais dans le porte-couteau.
- Répéter les étapes 1.4 à 1.14 pour chaque bloc supplémentaire doit être traitée. Les tubes à centrifuger contenant les rouleaux de tissus peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à ce que le time de l'extraction d'ADN.
2. Extraction d'ADN à partir de manuscrits de la FFPE GI biopsie tissulaire
NOTE: Ce protocole est adapté de la notice du kit FFPE des tissus de l'ADN d'extraction (ATTENTION: se référer à la fiche de données de sécurité (FDS)).
- Ajouter 1 ml de xylène (ATTENTION: Reportez-vous à la fiche signalétique) à chaque tube de centrifugeuse de l'échantillon. Fermer le couvercle et vortex vigoureusement pendant 10 secondes.
- Procéder à l'extraction de l'ADN selon la procédure décrite dans le produit la notice du fabricant avec les modifications suivantes.
- Tout d'abord ajouter 6 ul du contrôle interne (IC) à chaque tube de centrifugeuse.
- Suite à l'ATL / protéinase K lyse incubation à 56 ° C pendant 1 h, incuber à 99 ° C pendant 30 minutes, au lieu de 90 ° C pendant 1 heure.
- Au cours de la dernière étape d'élution de l'ADN, ouvrir soigneusement le couvercle de la colonne de purification d'ADN et d'appliquer 50 ul / eau RNase-free DNAse distillée au centre de la membrane, plutôt que buffer ATE.
REMARQUE: Reportez-vous à la notice pour le stockage et la préparation des réactifs appropriés. ADN doit être extrait à partir de tous les 5 rouleaux de FFPE. Effectuez toutes les étapes de centrifugation à température ambiante (15-25 ° C).
3. QPCR pour le CMV
- Polymerase Chain Reaction (PCR) Procédure
- Générer une feuille de calcul Excel pour l'analyse PCR CMV terme. Cette feuille de calcul Excel calcule le montant total de chaque réactif nécessaire pour faire le mixage de maître avec Mg. Il multiplie la quantité de chaque réactif nécessaire par échantillon (voir la liste ci-dessous) fois le nombre d'échantillons et des contrôles plus un (pour compenser la perte due à la pipette).
- Inclure les réactifs suivants dans chaque réaction de PCR dans le montant indiqué:
Réactif0; Montant par échantillon
CMV LC Master Mix flacon 12,5 pi
Solution jaune mg flacon 2,5 pi
Le volume total de 15,0 pi
- Inclure les réactifs suivants dans chaque réaction de PCR dans le montant indiqué:
- Inclure dans chaque test, exécuter une eau ou pas de contrôle de cible (NTC), témoin négatif, un contrôle positif faible, un contrôle positif élevé, et soit QS3 ou QS4, et tous les échantillons de patients. Les capillaires doivent être mis en place dans cet ordre.
- Obtenir le refroidissement du bloc spécifique à l'instrument PCR en temps réel qui est stocké à 4 ° C. Placer les tubes capillaires appropriés dans le bloc de refroidissement. Ne touchez pas la surface des tubes capillaires. Toujours porter des gants lors de la manipulation des capillaires.
- Mettre en place toutes les réactions en chaîne de la polymérase dans une hotte propre pas contaminés par l'amplification de productionts.
- Retirer le bon nombre de flacons de maître du kit PCR pour tester tous les échantillons de patients, plus 5 contrôles. Laissez les flacons de maître, solution de Mg, et PCR qualité dégel de l'eau dans le bloc de refroidissement. Chaque flacon de maître contient les réactifs suffisants pour 12 tests.
- Vortex doucement les flacons de maîtres et rapide les faire tourner dans la centrifugeuse à la vitesse maximale.
- Mélanger le contenu de chaque flacon maître dans un flacon, et vortex doucement à nouveau.
- Combiner le mélange maître et solution de Mg dans les montants indiqués sur la feuille de PCR dans un seul tube à centrifuger stérile.
- Mélanger doucement et aliquote de 15 ul de mélange maître avec Mg dans chaque tube capillaire, le capillaire sauf en position 5, qui est pour l'étalon de quantification (QS).
- Déplacer le bloc de refroidissement contenant les tubes capillaires et de mélange maître avec le Mg à partir de la hotte propre à une hotte de traitement.
- Ajouter 2 ul de contrôle interne (IC) à 30 pi restants de maîtremélanger avec Mg. Mélanger délicatement et aliquote de 15 ul dans le capillaire en position 5 (position pour le QS).
- Introduire à la pipette 10 ul d'eau, le contrôle de l'ADN, ou l'ADN de l'échantillon dans le tube capillaire appropriée. Boucher les tubes capillaires à l'aide de l'outil de coiffage.
- Prenez refroidissement bloc / échantillons de l'instrument PCR en temps réel.
- Générer une feuille de calcul Excel pour l'analyse PCR CMV terme. Cette feuille de calcul Excel calcule le montant total de chaque réactif nécessaire pour faire le mixage de maître avec Mg. Il multiplie la quantité de chaque réactif nécessaire par échantillon (voir la liste ci-dessous) fois le nombre d'échantillons et des contrôles plus un (pour compenser la perte due à la pipette).
- Instrument programmer la PCR en temps réel (voir le tableau 1)
- Amplification et détection effectuées sur l'instrument PCR en temps réel
- Connectez-vous sur l'ordinateur
- Double-cliquez sur l'icône de l'appareil et connectez-vous au logiciel.
- Mettez l'instrument PCR en temps réel
- Cliquez sur "CMV / EBV" de l'écran avant.
- Suivez les instructions de l'assistant macro.
- Cochez la case pour lancer un auto-test lorsque vous êtes invité par le logiciel. Un auto-test doit être effectué une fois par jour l'instrument est en cours d'utilisation.
- Nommez le terme.
- Réglez le nombre d'échantillons situé dans le lef supérieuret coin de la page à la somme des contrôles et des patients inclus dans le terme et entrer le numéro d'identification de chaque échantillon de patient.
- Cliquez sur l'onglet "Abs Quant".
- Sous la rubrique «Type d'échantillon", affecter le type approprié de l'échantillon pour la norme.
- Tapez les concentrations attendues pour la norme de quantification (QS).
- Retirer les tubes capillaires à partir du bloc refroidisseur et les placer dans la position correspondante dans le carrousel (bloc de refroidissement échantillon N ° 1 doit être placé en position n ° 1 sur le carrousel, etc.)
- Placez le carrousel en centrifugeuse et presse le début de l'instrument.
- Ouvrez la centrifugeuse et enlever le carrousel.
- Placer le carrousel dans l'instrument PCR en temps réel. Fermez le couvercle.
- Appuyez sur "Start Run".
- L'instrument PCR en temps réel vérifie chaque position pour un échantillon. Ne pas s'éloigner de l'instrument jusqu'à ce que ce contrôle a été achevée, surtoutparticulier si l'un des capillaires n'est pas dans le carrousel. L'instrument noter cela et se demander si le terme doit être poursuivi. Répondez oui avant de partir.
- Une fois la course terminée, fermez le rapport qui a été généré.
- Cliquez sur "Absolute Quantification".
- Cliquez sur la flèche à côté de Couleur de rémunération.
- Cliquez sur "Choisir rémunération Couleur» dans le menu déroulant.
- Choisir le fichier de compensation de couleur le plus courant à appliquer à la course.
- Cliquez sur OK lorsque la boîte s'ouvre.
- Cliquez sur la flèche de la courbe standard.
- Sélectionnez «usage externe» dans le menu déroulant.
- Sélectionnez le fichier le plus récent de la courbe de niveau externe, puis cliquez sur OK.
- Regardez chaque courbe dans le menu Absolute Quantification de veiller à ce que les courbes sont présents et pas la ligne plate, si une concentration est affectée. L'Absolu quantification pour la 705/Back 530 est automatiquement analysé.
- Qucontrôle alité
- Générer une nouvelle courbe standard chaque fois un nouveau numéro de lot de réactifs est reçu, ou tous les six mois, selon la plus fréquente.
- Ajouter 10 ul de chaque norme pour le mélange de maître avec Mg. Considérez les normes fournies avec le kit que l'ADN extrait précédemment.
- Ajouter 1 pl de contrôle interne pour chaque norme au mélange de maître avec Mg utilisée pour générer la courbe standard afin d'assurer une quantification précise. Ne pas ajouter IC au mélange de maître avec Mg pour le contrôle sans matrice (NTC).
- Préparer un NTC et trois répétitions de quantification normes QS 4, 3, 2, 1, et une dilution 1:10 de QS4 pour la course à générer la courbe standard, pour un total de 16 points de données.
- Sélectionnez "répétition de" dans le menu déroulant des normes répétées
- Choisissez canal 530/back aucun et tourner sur la rémunération des couleurs lors de l'analyse de la course,
- Sous "Courbe standard (En Run)", sélectionnez "enregistrer sous exinterne "et le nom de la courbe. Entrez le commentaire "appliquée comme courbe standard" lors de l'enregistrement.
- Graphiquement les résultats. Le coefficient de linéarité qui en résulte doit être ≥ 0,81.
- Pour les courses quotidiennes, inclure une copie de QS3 ou QS4 comme un contrôle dans la course. La courbe de courant standard externe peut être importé dans la course au cours de la phase d'analyse.
- Exécuter les contrôles: aucun contrôle de l'ADN, le contrôle négatif, faible, et les contrôles positifs élevés. Charge virale prévue est déterminée et ajustée pour chaque fournisseur et le numéro de lot.
- Ajouter un IC à chaque échantillon et à contrôler au cours de l'extraction de l'ADN.
- Si l'un des contrôles tombent hors de portée, enregistrer les résultats inacceptables et reporter le test pour le dépannage.
- Fréquence des contrôles
- Inclure dans chaque course: un NTC, faible contrôle négatif, positif, positif élevé, et standard.
REMARQUE: Les limites acceptables pour les contrôles. Aucun pic devraient être observentd pour le pas de modèle (CNT) et les contrôles négatifs. Pics doivent être présents dans le canal 530 et une charge virale attendus sont déterminés et ajustés pour chaque fournisseur et le numéro de lot pour les contrôles positifs basse et haute.
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Résultats
Un total de 228 blocs de tissus ont été testés par quantitative en chaîne par polymérase (qPCR), qui était composé de 91 cytomégalovirus (CMV) de cas positifs en fonction de l'histologie et immunohistochimie positive (IHC), 18 avec équivoque CMV IHC, et 79 contrôles négatifs. Comme illustré sur la figure 2, les cas positifs seraient CMV CMV ont démontré inclusions virales typiques (A) et / ou la coloration IHC positif (B). Cas équivoques auraient démontré modèles ra...
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Discussion
De nombreux procédés de laboratoire sont disponibles pour le diagnostic de cytomégalovirus (CMV), y compris la sérologie, la culture virale, les dosages de virémie moléculaires, l'histologie de matériel de biopsie, et, comme démontré récemment, des dosages moléculaires fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) biopsie 5,6 tissulaire. Sérologie, une fois l'un des piliers de diagnostic, identifie seulement de manière fiable l'exposition et ne correspond pas bien avec l'infection à CMV aig...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous reconnaissons Amy Thomasson pour son aide à la préparation de ce manuscrit, et Fredrik Skarstedt et Ryan Christy pour leurs efforts dans la préparation de chiffres.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,7 ml Tubes à microfuge | Costar | 3620 | |
| Pince dentelée | Services de microscopie électronique | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Centrifugeuses de table (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific : X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific : ET108 | 96-100 % |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| LightCycler | centrifugeuse Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling | Block Roche | ||
| Outil de capsulage LightCycler | Roche | 3357317 | |
| Kit de compensation de couleur | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 &mu ; l Capillaires | Roche | 1 909 339 | |
| Lames | Sakura | Fisher Scientific : 4689 | Accu-Edge low profile |
Références
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
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Réimpressions et autorisations
