Triage de tissus et de congélation pour les modèles de la maladie de muscle squelettique

Résumé

L’analyse des tissus musculaires squelettiques pour déterminer les propriétés structurelles, fonctionnelles et biochimiques est grandement facilitée par une préparation appropriée. Ce protocole décrit les méthodes appropriées pour préparer le tissu musculaire squelettique à un large éventail d’études de phénotypage.

Résumé

Le muscle squelettique est un tissu unique en raison de sa structure et de la fonction, qui nécessite des protocoles spécifiques pour la collecte de tissus pour obtenir des résultats optimaux à partir des évaluations fonctionnelles, cellulaires, moléculaires et pathologiques. En raison de la subtilité de certaines anomalies pathologiques observées dans les troubles musculaires congénitales et le potentiel de fixation d'interférer avec la reconnaissance de ces caractéristiques, l'évaluation pathologique de muscle congelé est préférable de muscle fixé lors de l'évaluation des muscles squelettiques de la maladie musculaire congénitale. En outre, le potentiel de produire de graves artefacts de congélation dans le muscle nécessite des précautions particulières lors de la congélation du muscle squelettique pour l'examen histologique qui ne sont pas couramment utilisé lors de la congélation d'autres tissus. Ce manuscrit décrit un protocole pour la congélation rapide de muscle squelettique en utilisant isopentane (2-méthylbutane) refroidi à l'azote liquide pour préserver optimale du squelette morphologie musculaire. Ce procédé est également efficace pour ftissus à des études génétiques ou protéiques expression reezing. De plus, nous avons intégré notre protocole de congélation dans une procédure plus large qui décrit également des méthodes préférées pour le triage à court terme de tissu pour (1) fibre unique des études fonctionnelles et (2) la culture de myoblastes, avec un accent sur l'effort minimum nécessaire de recueillir tissu et de le transporter à des laboratoires de recherche ou de référence spécialisés pour compléter ces études. Dans l'ensemble, ce manuscrit donne un aperçu de la façon dont le tissu frais peut être distribué de manière efficace pour une variété d'études phénotypiques et fournit des procédures d'utilisation normalisées (SOP) pour les études pathologiques liés aux maladies du muscle congénitale ainsi.

Introduction

Le muscle squelettique est un tissu unique en raison de sa structure et de sa fonction, ce qui peut présenter un certain nombre de défis lors de l’évaluation de sa pathologie. Bien qu’il soit suffisant, et souvent même optimal, d’évaluer la plupart des tissus après la fixation du formol et l’intégration de la paraffine, ce processus conduit à la production d’artefacts de rétrécissement cellulaire qui nuisent à l’évaluation des phénotypes critiques dans les maladies musculaires congénitales (y compris la taille et la forme des myofibres). De plus, le muscle gelé est nécessaire lors de la réalisation de nombreuses colorations histochimiques (y compris le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), la cytochrome oxydase (COX), la succinate déshyrogenase (SDH), l’adénosine triphosphatase (ATPase) et les colorants Oil Red O) qui sont essentielles pour la détection d’anomalies pathologiques spécifiques nécessaires au diagnostic d’une variété de myopathies congénitales, de myopathies mitochondriales et de maladies de stockage. De nombreux anticorps et outils moléculaires utilisés pour caractériser la morphologie et la fonction musculaires ont donc été développés et optimisés uniquement pour les tissus congelés, ce qui limite encore l’utilité des préparations de tissus fixes dans les études de biologie des muscles squelettiques. En conséquence, il est devenu pratique courante de congeler des échantillons de muscle squelettique pour la plupart des indications cliniques et de recherche dans le domaine des maladies musculaires congénitales, malgré les défis techniques que peut poser une congélation appropriée.

La congélation des muscles squelettiques peut être techniquement difficile en raison de la forte probabilité de formation de cristaux de glace dans les myofibres lorsqu’un protocole de congélation inapproprié est suivi¹. Dans la plupart des cas, les artefacts de congélation sont rencontrés lorsque la teneur en eau du tissu est trop élevée ou lorsque le processus de congélation est trop lent. La teneur en eau des tissus peut être accidentellement augmentée par immersion dans un liquide, comme le transport du muscle dans une solution saline ; ou la congélation peut être compromise si le tissu a été entièrement immergé dans l’OCT. Ces deux procédures peuvent entraîner des artefacts de congélation catastrophiques dans les tissus musculaires. De plus, un certain nombre de petits faux pas dans le processus de congélation peuvent entraîner une congélation lente ou une décongélation accidentelle des échantillons après une congélation appropriée, et ces problèmes peuvent également compliquer l’évaluation pathologique.

Au fur et à mesure que de nouveaux modèles et traitements pour les maladies des muscles squelettiques sont développés, il deviendra de plus en plus utile d’utiliser des procédures opératoires standard (SOP) pour évaluer les phénotypes des muscles squelettiques et l’efficacité du traitement. Ceci est particulièrement important pour l’évaluation pathologique des maladies musculaires congénitales, car la reconnaissance des phénotypes subtils observés dans bon nombre de ces troubles peut être altérée par une mauvaise préparation des tissus. Ce rapport représente un effort d’un consortium de maladies musculaires congénitales pour établir une POS de congélation des muscles squelettiques pour l’étude de modèles de maladies musculaires congénitales.

Le protocole présenté ici décrit une stratégie utilisée dans nos laboratoires cliniques et de recherche pour optimiser l’évaluation de la pathologie musculaire congelée, tout en étant adapté à une variété d’études basées sur les protéines et la génétique. Des stratégies spécifiques pour préparer des échantillons de muscle squelettique pour la microscopie électronique sont également présentées. De plus, comme il est possible de tester le fonctionnement d’une seule fibre de tissus congelés^2,3, les experts de ces techniques ont fourni des détails sur les protocoles de manipulation optimale des tissus. Malheureusement, l’isolement des lignées cellulaires de myoblastes ne peut pas être effectué efficacement sur des tissus précongelés, c’est pourquoi une stratégie est présentée ici pour le stockage et le transport à court terme de tissus musculaires pour l’établissement de cultures de myoblastes dans des laboratoires extérieurs. Dans l’ensemble, les méthodes décrites ici fournissent des lignes directrices pour le traitement approprié du tissu musculaire pour une variété d’études pathologiques, fonctionnelles, moléculaires et cellulaires, quelles que soient les capacités sur place d’un laboratoire donné.

Protocole

Étiqueter les récipients utilisés pour le stockage de muscle avec des identificateurs appropriés pour l'animal et le muscle récolté. Pré-refroidir les sacs / récipients et instruments pour prévenir le gel / dégel du tissu lorsqu'il est ajouté.

1. Considérations étude de conception pour la collecte du tissu musculaire

1. Pour les petits animaux (souris) des modèles de maladie musculaire, utilisent toute une muscle pour l'étude depuis de petits modèles animaux ont souvent besoin de l'évaluation de l'ensemble un muscle de prélever des échantillons de fibres musculaires suffisante pour des études pathologiques. Pour les grands animaux (canin) modèles de maladie musculaire, utilisent des parties de muscles qui sont au moins 0,3 x 0,3 cm ou plus de leur aspect transversal (transversale).
   NOTE: les biopsies de base peuvent également être utilisés, mais peuvent être sous-optimal pour les études de caractérisation primaire en raison de problèmes d'échantillonnage.
2. Pour les études portant sur le sarcomère, la mesure ultrastructurale de la longueur du sarcomère peut comprendre un paramètre critique et peut require spécialisée manipulation. Cela n'est généralement pertinente dans les maladies où les éléments des sarcomère montrent longueurs inappropriées, comme dans certaines causes de némaline myopathie. Certains laboratoires préfèrent fixer muscle dans son état non-traitées ou étiré, plutôt que d'effectuer ces mesures sur le muscle non tendu ou non étiré.
   1. Si la longueur des sarcomères ne sera pas mesuré, fixer le tissu musculaire sans pré-étirement du muscle en le plaçant directement dans le fixateur EM désirée (voir réactifs).
   2. Si la longueur des sarcomères seront mesurés, plusieurs techniques de pré-étirer le muscle (voir Discussion) peuvent être utilisés:
      1. Utilisez un dispositif de serrage pour maintenir le muscle à sa tension de repos alors qu'il est encore dans l'animal, exciser le muscle autour de l'extérieur de la pince, et le placer directement dans le fixateur EM désirée (voir réactifs).
      2. Étirer et épingler le muscle à une surface (comme un morceau de liège) à une longueur similaire à celle observée in vivo, après qu'il a été extrait à partir de l'animal.

2. Sous-diviser le muscle squelettique isolé en fragments qui sont appropriées pour les études souhaitées (Figure 1)

1. Pour l'histologie musculaire congelés:
   1. Inclure autant d'un muscle donné que possible pour minimiser les biais d'échantillonnage (voir l'étape 1.1), mais les spécimens doivent être <1,5 cm pour éviter le gel des artefacts.
   2. Traiter tous les muscles de la même étude est similaire pour empêcher des différences d'artefact de taille des fibres en raison des différences de manipulation.
2. Pour la microscopie électronique (EM):
   1. Couper une ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm bande de muscle à partir de l'échantillon, avec l'axe longitudinal de l'échantillon parallèlement à l'axe longitudinal du muscle initial.
      NOTE: Le fixateur ne pénètre pas de manière adéquate des pièces plus épaisses de tissu, de sorte que le maintien de l'épaisseur de l'éprouvette à 2 mm ou moins est indispensable pour obtenir des résultats appropriés. De plus,que l'orientation de ces petits fragments de muscle est souvent difficile, il est souhaitable d'utiliser un fragment de tissu qui imite l'orientation réelle du muscle (par exemple, l'aspect le plus long de l'échantillon est fixe l'orientation longitudinale des fibres musculaires / muscle) à minimiser la manipulation et la confusion pendant le traitement de l'EM.
3. Pour la culture cellulaire:
   1. Le rendement de la cellule souhaitée peut affecter la quantité de muscle requis pour l'établissement d'une culture cellulaire. Muscles simples (ou parties de muscles) de petits animaux peuvent fournir des numéros de cellulaires sont insuffisantes pour établir des cultures de cellules, si nécessaire, piscine tissu à partir de plusieurs muscles.

3. Fixation transformation de tissus et de microscopie électronique (EM)

1. Placer un fragment de muscle n'est pas supérieure à 2 mm dans sa dimension la plus mince directement dans le fixateur de EM souhaitée (voir réactifs).
2. Placez le muscle dans un tampon de fixateur EM (voir réactifs) après 2-48 heures de FIXATIsur. Fixation prolongée (pendant des semaines ou des mois) peut entraîner la perte de détail ultrastructurale sur des études de EM.
3. Envoyer à une installation de base EM pour le traitement.

4. Congélation de muscle pour histologique, biochimique et moléculaire des études

1. Éliminer l'humidité excessive dans l'échantillon par bien buvard l'échantillon avec une serviette en papier jusqu'à ce que le tissu est légèrement adhérente à la serviette. Une humidité excessive produire des artefacts de congélation importantes dans le muscle.
   REMARQUE: Les tissus peuvent être encore séché par rouler dans la poudre de bébé. Cette étape n'est généralement pas nécessaire pour les muscles, sauf s'ils ont été dans un environnement très humide.
2. Placez OCT (ou un adhésif semblable comme la gomme adragante) dans le fond d'un cryomoule peu profonde ou sur le liège, avec seulement assez OPO pour fournir une base pour le muscle orienté (figure 2C). Etiquetage du liège ou cryomoule avant congélation peut être utile pour le suivi de l'échantillon.
3. Carefully placer le muscle dans le moule dans l'orientation souhaitée, avec la majorité de la saillie à partir du muscle de sorte que le muscle octobre sectionnée n'est pas en contact avec octobre (Figure 2C).
4. Ajouter isopentane à une coupelle métallique jusqu'à ce qu'il atteigne une profondeur d'environ 4.3 cm.
5. Mettez des gants de sécurité thermique et enlever le couvercle du Dewar.
6. Placer ou maintenir la coupelle métallique en contact avec l'azote liquide, de sorte que le niveau de l'azote liquide à l'extérieur de la cuvette est supérieur au niveau de l'isopentane à l'intérieur de la coupelle. Stratégies pour organiser ces conteneurs sont présentés dans la figure 2.
   1. Ne pas permettre à l'azote liquide pour entrer la coupe de métal, car il produit une mousse de bulles qui peuvent être difficiles à travailler avec (et est également insuffisamment froid pour la congélation).
7. Observez la isopentane à déterminer quand il a atteint la température appropriée. À la température appropriée (de façon optimale entre -140 à -149 ° C), de sorte quecouvercle cailloux blancs d'isopentane congelés feront (après quelques minutes, et après le brouillard initiale a disparu au-dessus du isopentane) sur le fond de la tasse, ou la solution généralement épaissir jusqu'à la consistance de la mélasse. Congélation avant cette étape donnera atifacts de congélation.
   1. Si l'isopentane gèle entièrement solide, décongeler et le refroidir à des températures de congélation de nouveau avant utilisation ultérieure.
8. En utilisant des pinces pré-réfrigérés, réduire l'échantillon et de liège / moule dans l'isopentane pendant environ 10-20 secondes.
9. Placer l'échantillon congelé dans un récipient préalablement refroidi.
10. Gardez échantillon et de conteneurs sur la glace sèche en tout temps jusqu'au transfert à -80 ° C congélateur.

5. Si Artefact congélation est présent dans le tissu déjà gelé, il est possible d'améliorer le degré de congélation Artefact Utilisation de la suite de "Thaw et Recongeler" Procédure

1. Prendre blocs hors du congélateur, un à la fois, Et de les garder sur la glace sèche. Le calendrier de ce protocole est critique. Seulement décongeler et recongeler un bloc à la fois.
2. Déplacez échantillon de glace sèche à la température ambiante.
3. Si l'échantillon a été intégré dans l'OCT, retirez les PTOM environnante aussi complètement que possible à l'aide d'un scalpel.
4. Laisser l'échantillon décongeler à la température ambiante au point où il est complètement dégelée, mais pas au point où il est en train de s'assécher.
   1. Pousser doucement l'échantillon avec une pince pour faire en sorte que le spécimen est complètement décongelé avant de passer à l'étape suivante.
5. Congeler le muscle comme indiqué dans les étapes 4.1 à 4.10.

6. Préparation de muscle pour pelé fibre unique Tests fonctionnels

1. La procédure de stockage pour le muscle dépend du moment où le muscle / fibre est utilisée pour les expériences.
   1. Pour une utilisation dans quelques semaines, placez le muscle dans une solution de 50% glycerol/50% solution de détente (voir réactifs), et conserver à -20 ° C.
   2. Pour une utilisation à l'arrièreer quelques semaines, placez le muscle dans une solution de 75% glycerol/25% solution de détente (voir réactifs), et conserver à -80 ° C.
   3. Sinon, laisser le muscle sec, broches à liège, et de stocker sur des granules de silice à -80 ° C. Ces muscles déshydratés peuvent être utilisés pendant des années.

7. Préparation de muscle frais pour envoi de culture cellulaire à des laboratoires extérieurs

Protocoles pour l'établissement de cultures de cellules ont été bien décrit par ailleurs ^4-7.

1. Remplir un tube conique stérile de 50 ml avec un milieu de croissance complet stérile.
2. Ajouter le tissu musculaire du tube à l'aide d'une pince stérile, complètement immerger le tissu dans un milieu.
   1. Remplissez le reste du tube avec les médias pour éviter le dessèchement pendant le transport.
3. Ajouter de la glace sur la boîte en polystyrène et placer le tube conique à proximité de plusieurs packs de glace.
   1. S'il vous plaît noter que seuls les packs de glace (glace et pas sec) doivent être utiliséspour éviter d'endommager le gel du liquide et du tissu.
4. forfaits navires O / N, mais les tissus peuvent durer deux jours dans ces conditions.

Résultats

Pour donner des exemples des objets observés avec gel impropre, plusieurs quadriceps muscles de souris ont été gelés en utilisant différentes techniques (figure 3) de reproduire les erreurs couramment rencontrées. Comme le montre la figure 3A, le muscle squelettique de manière appropriée congelé montre une apposition serrée de fibres musculaires dans le tissu environnant (habituellement d'autres fibres musculaires, mais parfois l'espace endomysial entre myofibres est rempli de la fibrose ou de cellules inflammatoires dans diverses maladies ou des processus de lésion) et un compartiment cytoplasmique clairement visible. Pour l'analyse pathologique, la possibilité de visualiser l'espace intracellulaire est souvent plus important que le compartiment endomysial, comme il est généralement essentiel d'identifier clairement la présence de changements dégénératifs, les changements de régénération ou d'autres conclusions pathognomonique (noyaux centraux, inclusions intracellulaires) dans ce espace. Ainsi, la présence de cristaux de glace dans le compartiment intracellulaire représente amproblème de ajeure dans l'évaluation pathologique des muscles.

Congélation correct du tissu musculaire nécessite à la fois des températures suffisamment froides et une vitesse suffisante pour éviter la congélation de la formation de cristaux de glace. Même en tenant compte de deux facteurs, le gel artefact considérable peut encore se produire en raison de l'humidité excessive dans le tissu musculaire. Ce problème est le plus souvent rencontré dans le tissu musculaire qui avait déjà été immergé dans une solution saline et insuffisamment séché ou lorsque le muscle a été en contact direct OCT milieu de montage sur le site de la coupe (figure 3B, 3E). Alors que certains contact avec OPO est généralement inévitable à la suite du processus de montage, tous les efforts doivent être faits pour éviter le contact entre les zones qui seront histologiquement évalués et les PTOM utilisé pour le montage. En revanche, les échantillons congelés en utilisant un congélateur à -80 ° C (figure 3C) et de l'azote liquide (figure 3D) fournissent exemples artefact de congélation qui est produite par la température ou la vitesse du sous-optimales de congélation. Le processus de congélation lente rencontrées par le tissu placer dans un congélateur à -80 ° C fournit un exemple extrême de congélation artefact. Lors de l'utilisation de l'azote liquide, le problème principal est que le contact entre l'azote liquide et le tissu provoque une gaine d'azote gazeux pour former à l'interface tissu-liquide, et cette interface gazeux n'est pas suffisamment froide pour produire ^une congélation rapide muscle. Cela peut produire important artefact de congélation près de la surface de l'échantillon, mais les zones internes de l'échantillon sont plus susceptibles d'éclair gel à une vitesse appropriée et peut être entièrement épargné de congélation artefact. Alors que la simple immersion du tissu musculaire dans l'azote liquide est loin d'être aussi utile que le processus de l'isopentane-gel, il peut être utile pour le gel des grands spécimens de muscle dans les situations où l'isopentane est indisponible (comme échantillons d'autopsie cliniques dans les établissements delaboratoires cliniques sur la pathologie musculaire). Les résultats obtenus avec cette stratégie sont généralement mieux lorsque vous utilisez de grandes portions de tissu (> 2 cm dans plusieurs dimensions).

Bien que l'élimination de l'artefact gel fournit des résultats histologiques optimales, une technique a également été mis au point (et décrit ici) qui renverse sensiblement le gel des artefacts pour permettre l'évaluation des tissus mal congelé. Tissu qui est mal gelé (Figure 3E) peut être décongelé et recongelé dans des conditions strictement contrôlées (figure 3F) pour permettre la redistribution de l'eau dans les fibres, et le degré de préservation morphologique qui peut être obtenu peut être excellent. Dans notre expérience, ce processus conserve la morphologie intracellulaire du tissu à un degré remarquable, mais il produit souvent une séparation d'artefact de fibres dans l'espace endomysial. Comme de nombreux paramètres pathologiques se trouvent dans l'espace intracellulaire et ceux dansl'espace endomysial sont optimisé en utilisant des colorations spéciales (soit de mettre en évidence une fibrose ou d'identifier d'autres types de cellules), ces changements artéfactuelles sont susceptibles de nuire à vraiment l'évaluation pathologique des muscles.

Figure 1. Triage de tissu pour des études structurelles, fonctionnelles et cellulaires du muscle squelettique. En fonction des types d'études souhaitées, le tissu musculaire squelettique recueillies peuvent être traitées dans une variété de façons pour des résultats optimaux. Les protocoles décrits dans le présent document décrivent les méthodes de triage ou le traitement des échantillons de muscles squelettiques pour les études hors site pour optimiser les résultats obtenus à partir des installations de base experts.

Figure 2. Exemples d'appareils utilisés pour la congélation de muscle. Comme décrit dans le protocole, le gel optimal musculaire nécessite l'immersion du tissu musculaire dans de l'isopentane qui est à sa température de congélation. Un moyen sûr et efficace pour obtenir l'isopentane refroidi à la glace implique l'utilisation d'un récipient métallique pour la isopentane que l'on refroidit dans un Dewar contenant de l'azote liquide environnant. Comme il est souvent commode d'avoir les deux mains libres, il est possible d'utiliser un renfort tel qu'un support annulaire (A) pour maintenir le récipient de l'isopentane dans l'azote liquide tout en empêchant le mélange des deux liquides. Alternativement, le récipient pourrait également être tenu à l'azote liquide manuellement (B). Dans les deux cas, le tissu ne doit pas être placé dans l'isopentane jusqu'à l'isopentane est visiblement très froid au fond du récipient (généralement des cailloux blancs comme opaques), puis doit être immergé pendant 10-20 secondes pour permettre gel complet. Isopentane à la température de congélation produit minimal "brouillard", (c'est à dire, la température est insuffisante si considérable brouillard est présent). Une fois le tissu est gelé, placer directement dans des récipients pré-refroidis (et ensuite directement dans une glacière ou congélateur) pour éviter la décongélation accidentelle après congélation. Muscle congelé (C) monté de manière appropriée, doit avoir la majorité du tissu musculaire faisant saillie à partir d'une base de gelée OCT.

Figure 3. Exemples de congélation artefact, et de vigueur dégel / regel. Des images représentatives de (A) musculaire appropriée isopentane congelé, (B) muscle congelés de manière appropriée dans l'isopentane, mais alors en contact OCT milieu de montage, (C) muscle congelé C dans un congélateur à -80 ° C, et (D ) muscle congelé dans l'azote liquide, qui affiche des degrés variables de congélation artefact. Comme le montre la (B), la forte teneur en liquide de l'OCT produit important artefact de congélation dans le muscle qui est en contact avec elle, de sorte que le montant minimal de l'OCT nécessaire pour le montage doit être utilisé, et le muscle pour l'évaluation histologique doit être «debout out "à partir de sa surface. La lenteur de la procédure de congélation en utilisant un (C) -80 ° C ou congélateur (D) de l'azote liquide (par rapport à la vitesse de congélation en glace de l'isopentane froid) peut conduire à la production d'artefacts significatifs de congélation. Panneaux E et F montrent muscle dans la même pièce qui était (E) d'abord sous-optimale congelés (due à un contact excessif avec OCT) et (F) décongelés et recongelés en utilisant la technique décrite ici. Si l'on peut observer une certaine séparation entre les fibres d'artefact dans l'échantillon de regel, l'amélioration in la morphologie intracellulaire des fibres musculaires est évidente. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le muscle squelettique est un tissu structurellement et fonctionnellement unique, et les procédures de préparation spécialisés sont nécessaires pour permettre l'évaluation optimale des paramètres structurels et fonctionnels. Bien qu'une variété de tissus sont souvent gelé pour des études pathologiques dans des contextes cliniques et de recherche, les protocoles de congélation des tissus non musculaires impliquent généralement l'immersion totale du tissu dans l'OCT avant de les congeler. Comme le montre la figure 3, un tel protocole ne convient pas pour l'évaluation pathologique des muscles squelettiques et est suffisamment similaire au protocole décrit ici qu'il s'agit d'une erreur couramment rencontré encore. Le but de ce document est de fournir un protocole simple pour la manipulation correcte du muscle pour éviter les problèmes de ce genre. Des conseils ont également été établies sur la manipulation correcte du muscle hors site physiologique et études cellulaires dans le but de faciliter l'acquisition de données de haute qualité en dehors des laboratoires de base en cas EPMre des études sur place ne sont pas préférables ou possible.

Comme indiqué dans ce protocole, les éléments qui sont absolument essentiels dans le traitement correct de muscle pour des études pathologiques comprennent en minimisant la teneur en eau du tissu, ce qui diminue la température à laquelle le muscle est congelée, et l'augmentation de la vitesse à laquelle la congélation est obtenue. Une humidité excessive dans le tissu ou la lenteur excessive du processus de congélation (produit par des températures insuffisantes ou par absence de contact direct entre l'agent de congélation et le tissu, comme cela est rencontré avec l'azote liquide) va conduire à la congélation des artefacts qui peuvent nuire à une analyse pathologique. Comme octobre fournit une source supplémentaire de l'humidité du tissu, de nombreux laboratoires utilisent d'autres adhésifs tels que la gomme adragante en tant que substrat un enrobage. Même dans les cas où le gel est effectuée de manière appropriée, il faut prendre soin d'éviter les spécimens ensuite dégeler accidentellement par contact avec des récipients ou instruments RT.Ainsi, un processus de congélation réussie exige un degré de planification qui comprend un pré-refroidissement de tous les instruments et les contenants à utiliser. Quand on rencontre des artefacts de congélation, il existe un procédé décrit ici pour la récupération du tissu qui est suffisant pour la plupart des évaluations pathologiques. Toutefois, ce cycle gel / dégel n'offre pas histologie parfait et a le potentiel de nuire à d'autres études moléculaires ou enzymatiques du tissu (en plus du temps nécessaire pour re-congeler les tissus), de sorte que l'utilisation de pratiques initiales appropriées de congélation est de loin préférable . Dans les cas où le gel artefact est rencontrée sur le tissu pré-congelé, cependant, la technique décrite ici peut être extrêmement utile.

Fixation et le traitement des tissus pour EM peut offrir des défis techniques spécifiques qui nécessitent une planification préalable à la collecte de tissus. L'erreur la plus courante lors de la collecte des échantillons pour EM implique l'utilisation de fragments de tissus qui sont trop épais pour glutaraldehyde de pénétrer. Que le glutaraldéhyde ne pénètre d'environ 0,1 cm dans le tissu musculaire d'une surface, soins donnés doivent être prises pour veiller à ce que l'une des dimensions des échantillons EM n'est pas plus épaisse que 0,2 cm. En outre, comme EM est un excellent moyen d'évaluer directement l'appareil contractile, certains chercheurs ont développé des stratégies de pré-tension ou de pré-étirement du muscle avant la fixation pour permettre la mesure des éléments contractiles à une tension physiologiquement pertinents. Il n'ya pas de protocole standard pour la pré-tension, mais deux stratégies sont brièvement décrits dans ce protocole. Il convient de noter que les tentatives de pré-tension du muscle peut produire des résultats imprévisibles, sauf si elles sont faites d'une manière très spécifique, et il peut être préférable de fixer les muscles à l'état de mou pour empêcher les modifications des artéfacts de longueur de sarcomère par un non-standard procédure de pré-tension ^8,9. Pour les muscles dans lesquels ces mesures spécifiques ne sont pas nécessaires (y compris les plus biopsies réalisées à des fins cliniques), les efforts visant à pré-tension du muscle ne sont généralement pas faites, et le principal effet sur la morphologie musculaire est un espacement non uniforme des sarcomères dans le muscle.

Ce document constitue la première d'une série de fournir des SOP pour la réalisation de tests dans le domaine de la maladie musculaire congénitale, et il représente les efforts de plus de 20 experts dans le domaine de la maladie musculaire congénitale qui effectuent régulièrement cellulaire, moléculaire et fonctionnelle, physiologique et la recherche pathologique. Une gamme de modes opératoires normalisés publiés sera mis à disposition au cours de la prochaine année, et les protocoles nécessaires et les formats de publication appropriées pour chaque été discuté lors d'une Muscle maladie congénitale Consortium atelier qui s'est tenu en Avril 2013 à Washington DC Le but de cet effort de SOP est de fournir une feuille de route pour les tests nécessaires et l'analyse d'échantillons dans le domaine de la maladie musculaire congénitale à 1) normaliser les pratiques et les critères d'évaluation utilisés dans notre domaine comme mette que possible, et 2) fournir des instructions sur les pratiques normalisées pour les nouveaux chercheurs dans notre domaine. Nous croyons que ces ressources faciliter l'entrée de nouveaux chercheurs dans notre domaine sous-étudié et améliorer ainsi la portée de la recherche qui peut être réalisée. En outre, une normalisation des pratiques sera très utile pour comparer les données entre les études et d'identifier paramètres lors de la planification et de l'exécution des essais précliniques et cliniques.

Bien que l'objectif principal de cet article est lié à la congélation et à la préparation de tissu approprié pour une variété d'études, notre groupe de collaboration a également examiné les paramètres utiles pour l'analyse pathologique des échantillons de muscle. À l'heure actuelle, il n'existe aucun consensus officiel sur l'approche à adopter lors de l'exécution analyse pathologique, et une variété de différentes études sont effectuées à rapporter de nouveaux résultats de publications antérieures pour chaque maladie respective. Ainsi, nous avons pensé qu'il serait utile deproposer des lignes directrices générales pour la planification des paramètres pathologiques dans le muscle pathologie caractérisation. Avant de quantifier la pathologie dans une étude, une réflexion approfondie devrait être mis en 1) la méthode de mesure de la taille des fibres, 2) la possibilité d'anomalies fibres de type spécifique ou les effets du traitement, 3) la possibilité d'anomalies ou des effets qui sont limités de muscles individuels, et 4) une stratégie pour la quantification des résultats pathologiques qui sont caractéristiques de la maladie étudiée. taille des fibres est un paramètre nécessaire pour la plupart des études, et malheureusement, il est vaste variation dans la façon dont elle est quantifiée. De nombreuses études rapportent ces résultats en utilisant des méthodes de quantification automatiques fournies par le logiciel d'imagerie, mais beaucoup de ces programmes prennent des raccourcis (comme en supposant que les fibres sont des cercles ou ellipses) qui peuvent rendre ces mesures automatisées inexacte. Il est nécessaire de comprendre comment ces programmes automatisés font leurs mesures bvant avoir confiance dans les mesures, et nous encourager les chercheurs à inclure ces informations dans les méthodes de papier. En outre, la mesure spécifique utilisé pour désigner la taille de la fibre est extrêmement variable, et certaines mesures sont préférables à d'autres ^10,11. Une mesure couramment utilisée de la taille des fibres est la superficie de la section de fibre (CSA), en particulier parce que les enquêteurs de la scène études physiologiques normaliser leurs résultats à des mesures de l'ASC obtenues à l'aide de leurs instruments. Malheureusement, alors que les mesures de la CSA peuvent refléter la taille des fibres dans les sections transversales parfaites, elles sont largement dépendants de l'orientation des fibres (dans la mesure où les fibres longitudinales ou obliquement-sectionnés auront mesures artificiellement élevés de la CSA) et sont des mesures donc pas idéal pour la taille des fibres. Une mesure préférée de la taille des fibres qui est moins dépendante de la fibre surface de section transversale est le diamètre de Feret le minimum (diamètre MinFeret), qui est la mesure de the diamètre mineur dans la cellule musculaire ^12. Cette mesure est peu dépendant de l'orientation des fibres et est généralement l'étalon-or clinique pour la mesure de la fibre, et les enquêteurs sont encouragés à se déplacer vers l'utilisation de cette technique. Ces mesures peuvent souvent être faites en utilisant le même logiciel qui génère des mesures de l'ASC ^13, et sont aussi faciles à mesurer manuellement. En ce qui concerne l'évaluation des données pathologiques selon le type de fibre, muscle spécifique, et dans le contexte des résultats pathologiques liés à la maladie spécifique, ce sont des questions moins controversées qui devraient simplement être considérés lors de la planification d'une étude. Type de fibre peut être évaluée en utilisant la coloration immunohistochimique ou ATPase, mais il est utile de considérer que les muscles spécifiques et d'espèces animales ont des mélanges spécifiques de ces types de fibres (nécessitant donc des attentes différentes et tester des stratégies). Muscle implication pathologique spécifique ou l'efficacité du traitementpeut se produire, et le poids total de muscle par rapport aux témoins peuvent être utilisés pour identifier le degré d'hétérogénéité de la maladie avant de décider sur les muscles pour évaluer pathologique. Enfin, il est bien connu que beaucoup de maladies musculaires sont associés à des anomalies pathologiques spécifiques (tels que les tiges de némaline dans la myopathie némaline) ^14,15, et il est donc également utile d'examiner si ces anomalies sont trouvées dans une fibre musculaire de type ou spécifique de distribution lors de l'exécution de l'analyse ^16,17. Dans l'ensemble, alors que nous ne proposons pas un ensemble rigide de normes pour l'évaluation des muscles, nous croyons que ces questions devraient être examinées avant la réalisation d'études pathologiques dans une maladie du muscle squelettique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pour la congélation
Dewar d’azote liquide avec un dispositif de prélèvement de liquide	Systèmes biogéniques personnalisés	Lab-5	Tout autre dewar d’azote liquide pourrait substituer.
Conteneur conducteur de froid	Fisher	02-583A
Récipient isotherme large capable de contenir de l’azote liquide	Nalgene	4150-2000
Oakton Temp 10 Thermomètre à thermocouple	Thomas Scientific	1228Y01	Facultatif, mais peut être très utile pour identifier le point auquel l’isopentane gèle.
Pour le test
boîte de Pétri	Fisher Scientific	08-757-11
revêtement Sylgard	Ellsworth Adhesives	; 3-6636
Stéréomicroscope de dissection	Appareil de Harvard	693101	Tout autre microscope de dissection pourrait le remplacer.
Pour la culture
Hotte stérile à flux laminaire	Thermo Scientific	51022485	Toute autre hotte de culture cellulaire pourrait remplacer.
Pour la congélation
de tissus Sacs/récipients en plastique	Nasco	B01009WA
Gants de sécurité thermiques	Denville	G4162
Visière faciale	Fisher Scientific	S47640
Pince longue	Fisher Scientific	; 12-460-807
Agrafes	marqueurs	125328
Pour la culture
Tubes coniques stériles 50 ml Unité	PES Denville	C1060-P
, 500 ml, 0.22 µ ; m	Denville	F5227
Pince stérile	Fisher Scientific	644320
Blocs réfrigérants	Fisher Scientific	NC9909223
Boîte isotherme en polystyrène	Polar Tech	207F
Ruban d’emballage	Agrafes	795570
Congélation
Azote	liquideAirgas	NI NF160LT350 Stocker l’azote	liquide dans des récipients conçus pour les liquides à basse température
Isopentane (2-méthylbutane)	Sigma	M32631-4L	Stocker l’isopentane dans une armoire pour matériaux inflammables.
Fixateur EM (choisissez-en un)			Les tampons sans fixateur doivent également être disponibles, car les tissus fixés par EM doivent être transférés du fixateur au tampon après plusieurs heures ou jours s’ils ne sont pas immédiatement traités pour EM.
2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate 0,1 M	Microscopie électronique Sciences	16537-15
Fixateur de Karnovsky (3 % de glutaraldéhyde + 2 % de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate 0,1 M)	Microscope électronique Sciences	15732-10
Pour les études fonctionnelles (si désiré)  ;
Solution relaxante, contenant (en mmol/L)
;   ;   ;   ; 40 BES	Sigma	B9879
° ;   ;   ;   ;   ; 10 EGTA	Sigma	E4378
;   ;   ;   ;   ; 6.56 MgCl2	Sigma	M8266
;   ;   ;   ;   ; 5.88 Na-ATP	Sigma	A3377
² ;   ;   ;   ;   ; 1.0 DTT	RPI	D11000
;   ;   ;   ;   ; 46.35 K-propionate			Préparer une solution en mélangeant de l’acide proprionique (Sigma P1386) et du KOH (Fisher P250) 1:1
.   ;   ;   ;   ; 15 créatine phosphate, pH 7,0	Sigma	P7936
;   ;   ;   ;   ; 0.4 leupeptine	Calbiochem	10895
;   ;   ;   ;   ; 0.1 PMSF	Sigma	P7676
Solution de dépouillement, contenant  ;
;   ;   ;   ;   ; Solution relaxante (voir ci-dessus)
;   ;   ;   ; 0,5 % Triton X-100	Sigma	T8787
			de silice indicateurs
Morceaux plats de liège (1 x 1 pouce)	Microscopie électronique Sciences	63305
Glycérol	Sigma	G2025
Pour la culture cellulaire (si désiré)
Milieu de croissance complet, contenant (pour 500 ml)			Stériliser en filtrant la solution à travers un 500 ml 0,22 & micro ; m Unité de filtration PES.  ; Stocker à 4° ; C et à utiliser dans un délai de 1 mois.
395 ml de Dulbecco' à haute teneur en glucose s Aigle modifié' s Milieu (DMEM)	Sigma	D5671
100 ml de sérum fœtal bovin (FBS)  ;	Sigma	F6178
5 ml de 100X Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (PSG)	Sigma	G1146
Voir la fiche de données de sécurité (FDS) pour tous les autres réactifs pour les spécifications

des tissus Série fonctionnel d’une seule fibre, , , , , cellulairecellulaire de filtration des tissusGranules de stockage