contrôle du moteur et la performance de la balance sont connus à se détériorer avec l'âge. Ce document présente un certain nombre de tests comportementaux non invasives standard avec l'ajout d'un stimulus rotatif simple de contester le système et afficher les changements vestibulaires de la performance de l'équilibre dans un modèle murin de vieillissement.
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Article de méthode
Évaluation du comportement du système vestibulaire vieillissement de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Liée à l'âge déclin de la performance de la balance est associé à la détérioration de la force musculaire, la coordination motrice et la fonction vestibulaire. Bien qu'un certain nombre d'études montrent des changements dans l'équilibre phénotype avec l'âge chez les rongeurs, très peu isoler la contribution à l'équilibre vestibulaire soit en conditions normales ou lors de la sénescence. Nous utilisons deux tests de comportement standard pour caractériser la performance de la balance des souris à des points d'âge définies sur la durée de vie: le test de la tige tournante et le test de la poutre inclinée. Surtout si, un rotateur construit sur mesure est également utilisé pour stimuler le système vestibulaire de la souris (sans induire des signes manifestes de la cinétose). Ces deux tests ont été utilisés pour montrer que les changements dans vestibulaire performance équilibre médiation sont présents sur la durée de vie de souris. Les résultats préliminaires montrent que les deux le test de la tige tournante et le test de la poutre modifiée peuvent être utilisés pour identifier les changements dans les performances de l'équilibre au cours du vieillissement comme une alternative à plus diffictechniques ult et invasives telles que (VOR) mesures vestibulo-oculaire.
Introduction
Notre sens de l'équilibre est peut-être l'une des composantes essentielles des encore plus négligés de même des activités automobiles les plus élémentaires comme la marche et le tournage. L'équilibre est influencé par de nombreux facteurs, y compris la force musculaire, la coordination motrice et la fonction vestibulaire, et ce n'est que dans la présence de neuropathies vestibulaires ou lors du vieillissement normal que l'importance d'un système de balance pleinement fonctionnel est appréciée. Troubles du système vestibulaire sont souvent associés à des expériences de vertiges ou d'étourdissements et de déséquilibre résultant en un risque accru de chutes et de blessures ultérieures 1. Ceci est particulièrement important dans les populations âgées où les chutes sont une des principales causes de blessures 2.
Tests de la fonction vestibulaire sont généralement basées sur les réflexes vestibulaires, en particulier, la vestibulo-oculaire (VOR) ou le réflexe vestibulo-collique (VCR). Le VOR et magnétoscope sont essentiels pour la stabilisation d'images surla position de la rétine et de la tête lors des mouvements de la tête et du corps respectivement. Généralement, les mesures de VOR nécessitent l'implantation invasive de recherche bobines pour mesurer les mouvements oculaires ou suivi vidéo des mouvements oculaires 3. Ceci est difficile chez la souris en raison du faible nature de l'oeil de la souris et la difficulté de la détection de la pupille pour l'analyse vidéo 3. En variante, le magnétoscope est utilisé pour mesurer la stabilisation de la tête en réponse à des mouvements du corps chez la souris sans la nécessité d'une chirurgie invasive 4. Malgré cela, peu d'études portent spécifiquement sur la façon dont le système vestibulaire effectue dans son ensemble et surtout comment il change au cours du vieillissement.
Pour évaluer la performance globale de l'équilibre simplement et de manière non invasive, nous avons modifié deux tests comportementaux utilisés couramment. Les tests de faisceau d'équilibre tige tournante et inclinées évaluer les différents aspects de la performance motrice chez des rongeurs et dans des études précédentes ont été utilisés dans une batterie de test à acquérir une complèteprofil de la capacité du moteur. Cette capacité peut être affecté par la maladie ou de modification génétique, et est également sensible à des processus associés au développement normal et le vieillissement 7.5. Des travaux antérieurs utilisant la tige tournante a montré que la coordination motrice chez des souris diminue après 3 mois de 8 ans. En outre, les rats présentent des déficits de la balance notables avec l'augmentation de l'âge sur le test de la poutre 9.
Ce document décrit l'utilisation des tests de rotarod et poutre d'équilibre, en liaison avec un stimulus vestibulaire afin de contester le système vestibulaire et caractériser l'impact sur les performances de l'équilibre chez les souris jeunes et âgées. Bien que les méthodes simples et non invasives décrites ne sont pas conçus comme des mesures autonomes de la fonction vestibulaire périphérique, ils ne fournissent une mesure comportementale simple et utile pour comparer les changements cellulaires et sous-cellulaires à plusieurs étapes du traitement vestibulaire lors du vieillissement normal chez la souris.
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Protocole
1. Animaux
- Souris (C57/BL6) de 1 ans, 9 et 13 mois ont été obtenues auprès du Centre des ressources animales (Perth, Australie). Ces souris ont été logés dans des cages standard de la souris dans la facilité Bosch rongeurs à l'Université de Sydney sur un 12/12 h cycle lumière / obscurité avec accès à la nourriture et de l'eau ad libitum. Les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par l'Université du comité d'éthique animale Sydney.
- Apportez cages à souris dans la salle d'examen avant chaque essai pendant 10 min pour permettre souris de s'acclimater à l'environnement de test.
2. Rotarod
- Mettre en place l'appareil de la tige tournante (figure 1A):
- Installez les chevilles dans chaque ligne de la tige tournante.
Remarque: Dans ce cas rat chevilles (70 mm de diamètre) sont utilisés au lieu des chevilles de souris (32 mm de diamètre) pour décourager les souris de s'accrocher à la cheville et d'effectuer des rotations "passifs" 10. - Postulerions les plates-formes d'atterrissage magnétiques sur le fil situé en bas de chaque voie de la tige tournante de s'assurer qu'ils ne sont pas inclinent à toucher le sol de la tige tournante et sont placés le plus près possible de la paroi droite magnétique de chaque couloir sans se toucher.
Remarque: Lors de souris de test de la tige tournante sont tenus de marcher dans une direction avant de rester sur les chevilles tournantes et d'accélération. Quand une souris n'est plus en mesure de rester sur la cheville, ils tombent et déplacer la plate-forme d'atterrissage qui active ensuite un capteur magnétique. Le temps nécessaire pour passer de la cheville en rotation, la vitesse de rotation de la cheville au moment de la chute et de la distance parcourue est automatiquement calculé pour chaque souris et enregistré sur l'écran à l'avant de la tige tournante. - Faites glisser deux panneaux de plastique transparent à l'avant de chaque voie de la tige tournante avec les panneaux plus courts à la base et les panneaux plus ci-dessus.
- Entrée, les paramètres d'essai en utilisant le clavier situé à l'avant de la tige tournante. Suivez steps 2.1.4.1 à 2.1.4.6 pour les paramètres de test de la tige tournante d'accélération et les étapes 2.1.4.7 à 2.1.4.12 pour les paramètres de test de la tige tournante à vitesse fixe.
- Définir la durée maximale de l'essai à 60 sec.
- Définissez le nombre de voies à utiliser (ou le nombre de souris à tester).
- Réglez la vitesse de départ de l'épreuve à 5 tours.
- Réglez la vitesse de pointe de l'épreuve à 44 tours par minute.
- Réglez la vitesse de la rampe de l'épreuve à 60 sec.
- Définir la taille des chevilles choisies et la direction de rotation de chevilles de rat en rotation dans une direction vers l'avant.
- Définir la durée maximale de l'essai à 240 sec.
- Définissez le nombre de voies à utiliser pour 1 que les souris sont testés individuellement.
- Réglez la vitesse de départ de l'épreuve à 15 tours par minute.
- Réglez la vitesse de pointe de l'épreuve à 15 tours par minute.
- Réglez la vitesse de la rampe de l'essai à 0 sec.
- Définir la taille de la cheville choisi et le sens de rotation à une cheville de rat tourne dans un forwadirection e.
Remarque: Les paramètres ci-dessus peuvent être modifiés pour répondre aux besoins des différentes expériences.
- Placer une caméra en face de la tige tournante pour le test de la tige tournante à vitesse fixe, de sorte que le comportement de la souris pendant les essais peuvent être enregistrées et les vidéos utilisé pour une analyse ultérieure pour déterminer la durée de temps les souris ont été en mesure de rester sur la tige tournante.
- Installez les chevilles dans chaque ligne de la tige tournante.
- Suivez les étapes 2.2.1 à 2.2.4 pour le test de la tige tournante accélération:
- Placez une souris sur chaque cheville fixe pendant 5 min pour permettre la souris pour s'acclimater à la tige tournante.
- Pousser gentiment les souris pour faire face à l'arrière de la tige tournante et démarrer le test de la tige tournante où tous les sujets sont confrontés dans ce sens (voir la figure 1B).
- Retour toutes les souris dans leurs cages quand ils sont tombés des chevilles tournantes et les laisser reposer pendant 10 minutes avec un accès à la nourriture et de l'eau.
- Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.3 pour compléter un total de 8 essais en veillant à nettoyerles chevilles, les voies et plates-formes d'atterrissage de la tige tournante pour l'urine et les matières fécales, et déplacer les plates-formes d'atterrissage à sa position de départ Situés entre chaque essai.
Remarque: Les 3-5 premiers essais sont utilisés comme des essais de formation pour permettre aux souris de se familiariser avec la tâche. Le temps de tomber, la distance parcourue et la fin rpm de la cheville au moment de la chute pour chaque procès ultérieur est enregistrée pour une analyse ultérieure (Figure 2).
- Suivez les étapes 2.3.1 à 2.3.8 pour le test de la tige tournante à vitesse fixe:
- Placez une souris sur une cheville pendant 5 minutes pour lui permettre de s'adapter à la tige tournante. Retour de la souris à sa cage.
- Début de l'enregistrement vidéo sur l'appareil photo et appuyez sur Start sur la tige tournante. Ensuite, placez la souris sur la cheville de rotation assurant qu'il donne sur l'arrière de la tige tournante.
- Arrêtez l'enregistrement vidéo sur l'appareil photo lorsque la souris tombe des chevilles tournantes, et retourner la souris pour ses cages pendant 10 min avec un accès à la nourriture et de l'eau.
- Répétez les étapes 2.3.2 et 2.3.3 jusqu'à un total de 8 essais est acquis en veillant à nettoyer les chevilles, les voies et plates-formes d'atterrissage de la tige tournante pour les matières fécales et l'urine, et déplacer les plates-formes d'atterrissage à sa position de départ entre chaque essai .
- Allumez le rotateur construit sur mesure à 3 Hz pendant 20 secondes pour permettre aux souris de se familiariser avec le son. Arrêtez la coiffe après 20 secondes par arrêt de la perceuse et placez les mains de chaque côté de la roue de roulement pour l'empêcher de continuer à faire tourner le passé initiale de 20 sec.
Remarque: le rotateur se compose d'une roue de roulement rongeur fixée à un forage (Figure 3A). Au centre de la roue de roulement est une petite chambre avec un couvercle en treillis où la souris est placé (figure 3B). Le dispositif de rotation fait tourner dans le sens inverse des aiguilles d'une montre autour de l'axe vertical. L'ampleur de la stimulation est conforme aux études antérieures qui montrent stimulations rotatifs allant de 0,2 à 3 Hz sont suffisantes pour Genermangé réponses VOR et magnétoscope 4,11,12. - Placer la souris à l'intérieur de la chambre au centre du dispositif de rotation et remettre le couvercle.
- Mettez la coiffe à son réglage le plus bas de 3 Hz à 20 sec. Démarrez le rotarod et commencer l'enregistrement vidéo sur l'appareil photo pendant ce temps dans la préparation du prochain procès. Eteignez la perceuse à la fin de la 20 sec et placez les mains de chaque côté de la roue de roulement pour l'empêcher de tourner. Refaites le test de la souris sur la tige tournante immédiatement après par le transfert le plus rapidement possible à la cheville en rotation.
- Arrêtez l'enregistrement vidéo sur l'appareil photo lorsque la souris passe de la cheville et retourner la souris dans sa cage.
- Nettoyer les panneaux en plastique transparent avec un détergent / mélange et de l'eau douce de la chevilles cylindriques, les voies et plates-formes d'atterrissage métalliques de la tige tournante avec 70% d'éthanol quand toutes les souris ont été testés.
3. Poutre avec vestibulaire Défi
- Mettre en place la baAppareil à faisceau lance comme on le voit sur la figure 4A.
Remarque: L'appareil à faisceau d'équilibre a été adapté à partir d'un appareil décrit dans Carter et al (2001) 13.. Pour ce test, les souris à pied de l'extrémité inférieure de la poutre, qui est de 52,5 cm au-dessus du sol, à une boîte sombre de but (13 x 22 cm, avec un cm porte 5 x 6), situé à 60 cm au-dessus du sol (figure 4A ). Souris cherchent naturellement à l'obscurité et à la protection de la zone de but en faveur de la poutres apparentes et sont en outre encouragés à traverser le faisceau par la légère pente qui exploite leur mécanisme d'échappement naturel de courir dans une direction vers le haut 14. La poutre elle-même est de 1 m de longueur et a une section transversale circulaire avec un diamètre de 14 mm. Une gamme adaptée de diamètres de faisceau peut être utilisé, qui permet à l'expérimentateur d'ajuster la sensibilité du test ou accueillir des sujets plus importants. A l'extrémité inférieure de la poutre d'une ligne blanche indique la ligne de départ. Une autre ligne a ététirée à 60 cm de la ligne de départ à l'extrémité supérieure de la poutre pour indiquer la ligne d'arrivée (figure 4A).- Position deux caméras, l'une de chaque côté de la poutre, à l'extrémité inférieure de la poutre (figure 4B).
Note: Ces caméras doivent être orientées pour capturer toute la longueur de la poutre et de sorte que les lignes de départ et d'arrivée indiqués sur le fléau de balance sont clairement visibles. Ces caméras seront utilisées pour enregistrer de la vidéo le comportement de la souris comme ils traversent la poutre d'équilibre, avec des vidéos résultantes étant utilisés pour une analyse ultérieure. - Tapisser le fond de la boîte de but avec une serviette en papier, pour permettre un nettoyage facile de l'urine et les fèces après l'essai de chaque souris, et placez le dôme du logement de la cage sujets de maison à l'intérieur de la boîte de but.
- Placez la mousse adéquate ou autre matériau de rembourrage sous la poutre posée pour protéger tous les sujets qui relèvent de l'appareil. Les souris qui tombent seront ramassés immédiatement par l'expérienceer et placé à l'intérieur de la boîte de but pour se reposer.
- Position deux caméras, l'une de chaque côté de la poutre, à l'extrémité inférieure de la poutre (figure 4B).
- Placer une souris dans la zone de but pendant 2 minutes de sorte qu'il se familiarise avec ce milieu. Couvrir l'ouverture de la boîte de but avec une main gantée pendant 5 secondes si la souris essaie de marcher sur la poutre pendant ce temps pour décourager ce comportement.
- Former la souris en le plaçant sur la poutre juste à l'extérieur de l'ouverture de la boîte de but et de lui permettre de marcher dans la zone de but. Continuer à former la souris en le plaçant sur le faisceau progressivement plus loin de la zone de but jusqu'à ce que la souris est capable de marcher à partir de la ligne de départ de la zone de but sans l'aide et l'hésitation minime. Laissez la souris pour se reposer dans la zone de but pendant 1 min après chaque course.
- Commencer à tester la souris lorsque la formation est terminée.
- Début de l'enregistrement vidéo des caméras.
- Placer la souris à la ligne de départ de la poutre et patienter pendant qu'elle traverse le faisceau dans la direction de la zone de but.
- Arrêtez l'enregistrement vidéo sur cameras lorsque la souris atteint la case.
- Laissez la souris pour se reposer dans la zone de but pendant 1 min. Retirez tout urine ou les selles qui peuvent avoir été déposé au cours du procès en attendant.
- Répétez les étapes 3.4.1 à 3.4.4 jusqu'à un total de 5 essais ont été réalisés.
- Allumez le rotateur construit sur mesure à 3 Hz pendant 20 sec (comme dans le test de la tige tournante à vitesse fixe) pour permettre aux souris de se familiariser avec le son. Arrêtez la coiffe après 20 secondes par arrêt de la perceuse et placez les mains de chaque côté de la roue de roulement pour l'empêcher de tourner.
- Placer la souris à l'intérieur de la chambre au centre du dispositif de rotation et remettre le couvercle.
- Mettez la coiffe à son réglage le plus bas de 3 Hz à 20 sec. Début de l'enregistrement vidéo sur les caméras pendant ce temps, dans la préparation du prochain procès. Eteignez la perceuse à la fin de la 20 sec et placez les mains de chaque côté de la roue de roulement pour l'empêcher de continuer à faire tourner le passé initiale de 20 sec. Transfer la souris pour le début de la poutre d'équilibre aussi rapidement que possible et d'attendre que la souris traverse le faisceau de la zone de but.
- Arrêtez l'enregistrement vidéo des caméras lorsque la souris atteint la case de but et retourner la souris dans sa cage.
- Nettoyez l'appareil à faisceau d'équilibre avec 70% d'éthanol et de changer la serviette de papier dans la boîte de but après chaque souris a été testé.
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Résultats
Rotarod
La performance motrice chez la souris a été décrit comme le temps de tomber (TTF) enregistrée pour chaque souris sur 8 essais. Grâce à ces mesures de TTF, les courbes de formation pour chaque souris peuvent être tracées. Figure 2 montre des exemples de la performance du moteur d'un 1 mois-vieille souris et un de 9 mois vieille souris au cours de 8 essais. Ces courbes de formation montrent une augmentation de la TTF au cours des 3-5 premiers essais suivis d'un pl...
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Discussion
Étapes critiques dans le protocole
Des travaux antérieurs ont montré qu'il est facile de overtrain souris à la fois sur la tige tournante et un appareil à faisceau d'équilibre et en conséquence, l'acquisition des mesures précises peuvent être difficiles 15. Par exemple, le surentraînement sur la tige tournante peut conduire à des souris sautant volontairement large des chevilles au cours des deux périodes d'acclimatation et d'essai, tandis que le surentraînement...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier la Fondation commémorative Garnett Passe et Rodney Williams ainsi que l’Animal Behavioural Facility de l’Institut Bosch.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Rotarod | IITC Sciences de la vie Inc. | #755 | "Chevilles de rat » = 70 mm de diamètre. Ne laissez pas l’éthanol entrer en contact avec le plexiglas. |
| iPhone | Apple | Peut utiliser n’importe quel type d’appareil photo. Velcro fixé à la surface arrière pour la fixation au bras articulé 3D. | |
| Bras articulé 3D | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Tout type de support vertical stable serait adéquat. Le velcro est fixé à l’extrémité apicale du bras pour la fixation de l’iPhone. |
| Poutre mobile en bois : bande de bois lisse de 1 m de long avec une section circulaire de 14 mm de diamètre | Une gamme de diamètres et de formes de section transversale peut être utilisée en fonction des paramètres expérimentaux | ||
| Boîte de but en bois (130 x 140 x 220 mm) fabriquée à partir de planches | |||
| Support en poutres de 41 x 41 mm : 2 faisceaux verticaux à 525 et 590 mm du sol au début et à la fin du but respectivement ; Poutre horizontale de 803 mm qui longe le sol directement sous la poutre de marche ; deux poutres de 20 mm de long agissent comme des « pieds », reliant les poutres horizontales et verticales à chaque extrémité ; un bloc de 21 x 21 x 36 mm taillé à l’extrémité apicale de la poutre verticale « de départ » ; Une ouverture de 13 x 13 mm découpée au centre de ce bloc, formant un tunnel perpendiculaire au faisceau de marche. | Renforcez tous les joints avec de petits supports en acier. | ||
| Peinture noire (à base d’eau) | Handycan | Acrylique Noir mat | 2-3 couches pour toutes les surfaces en bois de l’appareil de poutre d’équilibre |
| Finition transparente | Wattle Estapol | Polyuréthane mat | Couche unique pour toutes les poutres. Double couche pour toutes les autres surfaces de l’appareil de poutre d’équilibre |
| Mousse, matériel | Pour amortir les chutes de la poutre d’équilibre | ||
| 70 % Éthanol, serviettes en papier Nettoyez | poutre et la boîte de but entre chaque animal. | ||
| Compresses de gaze/serviettes | en papier Pour tapisser le sol de la boîte de but | ||
| Maison des souris (de la cage de la maison) |
Références
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Réimpressions et autorisations
